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문제 정의
- 본 연구의 목적은 항생제 내성균 제거를 위한 초음파 조사 공정의 기초 연구로서, 시간 및 강도를 달리 하여 그에 따른 제거효율을 비교하는 것이다. 또한 항생제 내성균의 내성도 차이를 조사하였으며, 이를 통하여 미생물 불활성화 및 내성도의 변화에 따른 초음파 소독 효율 및 성능 향상을 이해하고자 하였다.
- 본 연구에서는 폐수에 존재할 수 있는 그람 양성/음성세균에 대하여 초음파 소독을 통한 불활성화 정도및 항생제 감수성 변화에 대해서 다음과 같은 결론을 얻을 수 있다.
- 본 연구의 목적은 항생제 내성균 제거를 위한 초음파 조사 공정의 기초 연구로서, 시간 및 강도를 달리 하여 그에 따른 제거효율을 비교하는 것이다. 또한 항생제 내성균의 내성도 차이를 조사하였으며, 이를 통하여 미생물 불활성화 및 내성도의 변화에 따른 초음파 소독 효율 및 성능 향상을 이해하고자 하였다.
제안 방법
- 초음파 조사 전과 후에 대한 생장억제구역(inhibition zone)을 측정하여 감수성 변화를 분석하였다. 각 항생제 별로 3회의 실험을 진행하였으며 CLSI 가이 드라인에 따라 결과는 저항성(resistant), 중간내성(intermediate), 감수성(sensitive)으로 구분하였다 (CLSI, 2017).
- 본 실험에서는 강도 20 (27.7 W)및 40 (39.1 W)에서 초음파를 조사하는 동안, 조사 시간 2, 5, 10, 15 분 간격으로 시료를 채취하였다. 초음파 조사에 의해 생성 되는 수산화 라디칼의 생성을 간접적으로 확인하기 위하여 생성되는 과산화수소의 양을 측정하였다 (Fig.
- faecalis)를 이용하여, 24시간 배양(37˚C, 180 rpm)하였다. 초기 균의 농도 조절을 위해, 600 nm에서의 흡광도 분석을 통해 107 ~108 CFU/mL임을 확인 후, 10 mL를 반응기에 주입한 뒤 초음파를 조사하였다. 항생제 저항성 발현을 위하여, 통상적으로 사용되는 EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) 및 CLSI(Clinical & Laboratory Standards Institute)의 유효값(cutoff value)을 참고하여 Table 1와 같이 항생제 첨가 농도를 선정하여 배지를 제조하였다.
- 실험에 활용된 디스크는 ThermoScientific Oxoid (USA)에서 구입하였으며, 암피실린 (ampicillin, AMP, 10 µg), 아목시실린 (amoxicillin, AMX, 10 µg), 아목시실린/클라불란산 (amoxicillin/clavulanic acid, AMC, 30 µg), 시프로플록사신 (ciprofloxacin, CIP5, 5 µg), 테트 라시클린 (tetracycline, TET30, 30 µg), 설파메톡사졸 (sulfamethoxazole, RL, 25 µg), 설파메톡사졸/트리메도 프림 (sulfamethoxazole/trimethoprim, SXT, 25 µg)을 사용 하였다. 초음파 조사 전과 후에 대한 생장억제구역(inhibition zone)을 측정하여 감수성 변화를 분석하였다. 각 항생제 별로 3회의 실험을 진행하였으며 CLSI 가이 드라인에 따라 결과는 저항성(resistant), 중간내성(intermediate), 감수성(sensitive)으로 구분하였다 (CLSI, 2017).
- 2, 25˚C 항온 조건에서 초음파를 조사하였다. 초음파 조사는 주파수 20 kHz (MISONIX S-4000, USA)를 이용하였으며, 조사 강도(amplitude)는 20과 40으로 변화시켰다. 두 강도에서 실제 수용액으로 전달된 에너지의 양은 calorimetric power 방법(식-(1))을 이용하여 계산하였으며 (Kimura et al.
- 2 로 조사되었다. 초음파 조사를 위해 제작된 원통형 반응기(Double-jacketed Pyrex reactor)에 폐수 290 mL 및 미생물 배양액 10 mL를 분주하여, 총 부피 300 mL가 되게 하고, pH 7.2, 25˚C 항온 조건에서 초음파를 조사하였다. 초음파 조사는 주파수 20 kHz (MISONIX S-4000, USA)를 이용하였으며, 조사 강도(amplitude)는 20과 40으로 변화시켰다.
- 1 W)에서 초음파를 조사하는 동안, 조사 시간 2, 5, 10, 15 분 간격으로 시료를 채취하였다. 초음파 조사에 의해 생성 되는 수산화 라디칼의 생성을 간접적으로 확인하기 위하여 생성되는 과산화수소의 양을 측정하였다 (Fig. 1) (Nomura et al., 1996). 실험 결과에 대한 통계분석은 Microsoft® excel의 Analysis add-in을 활용하여, 피어슨 상관(Pearson’s correlation) 및 Student t-test (등분산 가정 두집단)을 비교하였다.
- 초음파로 인하여 불활성화 되었던 균들의 재증식 정도를 이해하기 위하여 초음파 처리 후, 다시 24시간 동안 배양하여 증식되는 균 수를 측정하였다(Fig. 2). 초음파 조사 전의 균 수에 비해 그람 양성균에서는 약 0.
- 초음파에 의한 소독 효과를 관찰하기 위해, 조사 강도별 시간에 따른 균수의 변화를 측정하였다 (Figs. 2-4). 조사 강도와 관계없이 그람 음성균인 대장균에 서의 제거 효율이 가장 큰 것으로 나타났고, 그람 양성균인 장구균, 포도상구균 순으로 균 수의 감소가 큰것으로 나타났다.
- 항생제 저항성 발현을 위하여, 통상적으로 사용되는 EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) 및 CLSI(Clinical & Laboratory Standards Institute)의 유효값(cutoff value)을 참고하여 Table 1와 같이 항생제 첨가 농도를 선정하여 배지를 제조하였다.
대상 데이터
- 대표종으로 그람 음성균인 Escherichia coli (E. coli, KCCM 41310)와 그람 양성균인 Staphylococcus aureus (S. aureus, KCCM 12256), Enterococcus faecalis (E.faecalis, KCCM 11814)를 선택하였으며, nutrient agar (E. coli) 및 tryptone soy agar (S. aureus, E. faecalis)를 이용하여, 24시간 배양(37˚C, 180 rpm)하였다. 초기 균의 농도 조절을 위해, 600 nm에서의 흡광도 분석을 통해 107 ~108 CFU/mL임을 확인 후, 10 mL를 반응기에 주입한 뒤 초음파를 조사하였다.
- 항생제 저항성 발현을 위하여, 통상적으로 사용되는 EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) 및 CLSI(Clinical & Laboratory Standards Institute)의 유효값(cutoff value)을 참고하여 Table 1와 같이 항생제 첨가 농도를 선정하여 배지를 제조하였다. 선별배지 (selective media)에서 배양된 세균들은 항생제 내성을 가지고 있는 것으로 판단하여 30% 글리세롤(glycerol) 을 첨가하여 균 저장액(stock)으로 제조하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 쓰인 생활하수는 중앙대학교내 기숙사 건물 에서 배출되는 폐수를 채취하였으며, 원래 존재하던 균들의 사멸을 위하여 고압 멸균(autoclave)시킨 후, -20˚C 보관하였다가 사용하였다. 폐수의 기본적인 수질은, COD: 28.
- 실험에 활용된 디스크는 ThermoScientific Oxoid (USA)에서 구입하였으며, 암피실린 (ampicillin, AMP, 10 µg), 아목시실린 (amoxicillin, AMX, 10 µg), 아목시실린/클라불란산 (amoxicillin/clavulanic acid, AMC, 30 µg), 시프로플록사신 (ciprofloxacin, CIP5, 5 µg), 테트 라시클린 (tetracycline, TET30, 30 µg), 설파메톡사졸 (sulfamethoxazole, RL, 25 µg), 설파메톡사졸/트리메도 프림 (sulfamethoxazole/trimethoprim, SXT, 25 µg)을 사용 하였다.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계분석은 Microsoft® excel의 Analysis add-in을 활용하여, 피어슨 상관(Pearson’s correlation) 및 Student t-test (등분산 가정 두집단)을 비교하였다.
이론/모형
- 초음파 조사는 주파수 20 kHz (MISONIX S-4000, USA)를 이용하였으며, 조사 강도(amplitude)는 20과 40으로 변화시켰다. 두 강도에서 실제 수용액으로 전달된 에너지의 양은 calorimetric power 방법(식-(1))을 이용하여 계산하였으며 (Kimura et al., 1996), 각각 27.7 W (강도 20)와 39.1 W (강도 40)로 측정되었다.
- 항생제 감수성(antibiotic sensitivity)을 검사하는 미생물 생장 억제 최소농도로 항생제를 첨가하여 미생물의 약제 내성을 확인하는 최소저해농도(MIC, Minimum Inhibitory Concentration)방법 중 Kirby-Bauer 디스크 방법을 활용하였다.
성능/효과
- 조사 강도와 관계없이 그람 음성균인 대장균에 서의 제거 효율이 가장 큰 것으로 나타났고, 그람 양성균인 장구균, 포도상구균 순으로 균 수의 감소가 큰것으로 나타났다. 강도 변화에 따른 로그 제거율은 Table 6과 같으며, 대장균 수 감소는 지속적으로 발생 하여 15분 경과 후 초음파 조사 강도 20에서 약 1.2-log 제거율을 보였으며 조사 강도 40에서는 1.3배증가한 1.6-log 제거율을 나타냈다 (Fig. 2). 그람 양성 균의 균 수가 조사 시작 2분 이내에 미세하게 증가하는 이유는, 초음파 처리로 인해 이전에 군집(clump)을형성하던 균들이 흩어져 단일 균 형태로 숫자 측정이 되었기 때문으로 사료된다 (Joyce et al.
- Table 5은 초음파 처리에 의한 세균 불활성화(즉, 시간에 따른 초음파 처리 후 CFU/초기 CFU)정도와 항생제 억제 구역 사이의 피어슨 상관 분석 결과이다. 균 종류에 따라 다른 상관관계를 나타내었으며 초음파 처리에 민감했던 대장균의 경우, 비교적 큰 음의 상관관계를 보였다. 세균 불활성화 및 처리시간대비 항생제 내성도 감소가 적게 나타났던 그람 양성균의 경우, 비교적 낮은 상관성을 보였다.
- 3). 그람 양성균인 포도상구균은 15분 경과 후조사 강도가 2배 증가함에 따라 평균 제거율이 미약 하게 증가하지만 강도 20에서와 유사하게 0.05-log 제거율 수준으로 나타나 미생물 불활성화 효과가 거의 없는 것으로 나타난다 (Fig. 4). Madge and Jensen (2002)의 미생물 로그 제거율 분석방법에 따르면, 15분당 로그제거효율이 0.
- 따라서, 본 실험의 결과를 종합해 볼 때, 그람 음성 균에서는 초음파 조사의 영향을 받아 항생제 내성도가 증가하며 이는 항생제의 종류에 따라 달라질 수있다. 또한, 그람 양성균에서는 항생제 종류에 상관없이 낮은 강도(low-intensity)의 초음파 처리를 통한 항생제 내성도 증가는 잘 이루어지지 않음을 나타낸다.
- 5-log 정도의 재증식이 일어나지만, 대장균에 서는 큰 변화가 존재하지 않았다. 또한, 그람 양성균 에서도 항생제 종류에 따라 재증식이 일어나는 정도가 달랐다. 이는 폐수의 성상 및 과산화수소 형성의 복합적인 효과에 대한 특징으로 유추할 수 있다.
- 대장균의 경우(Table 2), 페니실린(penicillin) 계열 항생제인 암피 실린, 아목시실린 항생제에 대한 감수성 변화는 강도 20에서는 거의 나타나지 않지만, 조사 강도 40에서는 처리 시간이 증가함에 따라 항생제 감수성이 증가하여 초기 표현된 저항성 또는 중간내성이 감수성으로 변화하였다. 또한, 초음파 조사 후, 처리수를 분취하여 24시간 배양하였을 때, 조사 강도 20으로 처리한 대장 균은 저항성을 회복 하였지만 강도 40으로 처리한 대장균은 감수성을 유지하였다. 술폰아미드(sulfonamide) 계열 설파메톡사졸 항생제가 처리된 대장균은 시간 경과에 따라 높은 항생제 감수성 나타내었다.
- 균 종류에 따라 다른 상관관계를 나타내었으며 초음파 처리에 민감했던 대장균의 경우, 비교적 큰 음의 상관관계를 보였다. 세균 불활성화 및 처리시간대비 항생제 내성도 감소가 적게 나타났던 그람 양성균의 경우, 비교적 낮은 상관성을 보였다. 이는 앞서 기술한 바와 같이, 간섭효과로 인해 미생물 활성화 및 항생제 내성도 감소가 야기된 것으로 사료된다.
- 또한, 초음파 조사 후, 처리수를 분취하여 24시간 배양하였을 때, 조사 강도 20으로 처리한 대장 균은 저항성을 회복 하였지만 강도 40으로 처리한 대장균은 감수성을 유지하였다. 술폰아미드(sulfonamide) 계열 설파메톡사졸 항생제가 처리된 대장균은 시간 경과에 따라 높은 항생제 감수성 나타내었다. 퀴놀린 (quinolone) 계열 시프로플록사신 및 테트라시클린 계열 테트라시클린 항생제에 대해서는 초음파 조사 강도 20 과 40에서 모두, 초기 중간내성이었던 대장균이 감수성이 증가하는 방향으로 변화하였지만, 24시간 경과 후 공통적으로 저항성을 회복하는 것으로 관찰 되었다.
- 그람 음성균은 그람 양성균보다 초음파를 통한 불활성화 효과가 크다. 시간 및 강도 증가에 따라 그람 음성균의 불활성 정도는 증가하나, 그람 양성균은 강도 및 시간의 변화에 따른 불활성이 거의 이루어지지 않았다. 그러나, 처리 후 24시간 배양하였을 때, 초기 CFU와 유사한 농도로 재활성화 되었다.
- 설파메톡사졸 항생제의 경우, 장구균의 저항성은 24시간 배양 이후까지 일정 하게 유지되었다. 시프로플록사신 및 테트라시클린에 대해서도 항생제 감수성이 초음파 조사 시간 및 강도가 증가함에 따라 미비하게 감소하는 경향을 보였다. 시프로플록사신에서는 초기 중간내성이던 균이 초음파 처리에 따라 억제구역이 증가되면 감수성이 발현 되었지만, 테트라시클린에서는 저항성에 큰 변화를 보이지 않았다.
- 시프로플록사신 및 테트라시클린에 대해서도 항생제 감수성이 초음파 조사 시간 및 강도가 증가함에 따라 미비하게 감소하는 경향을 보였다. 시프로플록사신에서는 초기 중간내성이던 균이 초음파 처리에 따라 억제구역이 증가되면 감수성이 발현 되었지만, 테트라시클린에서는 저항성에 큰 변화를 보이지 않았다. 그람 양성균인 포도상구균의 경우 (Table 4), 시프로플록사신을 처리한 균은 초음파 처리 과정에서는 항생제 저항성이 거의 존재하지 않았다.
- 하지만 처리 후 24시간 배양된 균에서는 저항성이 존재하는 것으로 나타났다. 암피실린과 아목시실린에 처리된 균은 초음파 조사 시간에 따라 저항성 감소가 나타났지만 24시간 처리 후 다시 저항성을 회복한 것으로 관찰되었다. 그 외 항생제 물질에 대해서는 초음파 조사 시간 및 강도에 따른 억제구역 변화가 거의 존재하지 않았으며, 저항성을 지속적으로 유지하였다.
- 우리나라의 경우, OECD 평균보다 50%이상 많은 항생제가 처방되고 있는데, 이로 인한 내성 세균 발생률도 최근 7년간 최대 3배 이상 증가한 것으로 나타났다. 또한, 축산 업계의 항생제 사용량은 2013년부터 지속적으로 증가하여 현재 연간 약 1,004톤에 이른다.
- 초음파를 조사한 5가지 항생제 계열에 대해서 페니실린 계열 항생제에 대하여 가장 큰 감수성 증가를 보였으며, 술폰아미드 계열 항생제에 대해서는 모든 균들의 저항성에 큰 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 간섭효과 때문으로 추정되며, 초음파 처리 후 24시간 경과 후 감수성을 다시 측정했을 때, 감수성을 확보했던 균들이 대부분 저항성을 지니게 되었다는 것을 확인할 수 있었다.
- 5이상일 때 효과적인 효율을 기대하여 실용성이 있다고 판단하였다. 이를 통하여 본 연구에서의 초음파 조사 조건에서는 그람 음성균은 적절한 소독 효과가 있음을 알 수 있지만 그람 양성균에는 소독 효과가 거의 없음을 알 수 있다.
- , 2018). 이를 통해, 초음파 조사에 의한 소독의 효과가 급격하게 크지는 않았으나, 초음파에 조사된 미생물의 재증식을 지체 시키는 효과는 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 소독 혹은 산화의 효과를 상승시킬 수 있는 적절한 산화제나 촉매 등의 조합을 통해 항생제 내성세균의 사멸을 위한 추가 연구가 필요하다고 판단된다.
- 이와 유사하게, 포도상구균은 mecA 유전자를 통해 β-lactam계열 항생제에 대해 저항성을 갖지만, 유전자 돌연변이로 인해 형성된 mecA의 대립유전자인 mecC 유전자를 가진 포도상구균은 저항성을 띠던 oxacillin에 감수성을 띠고 β-lactam 계열 및 cefoxitin 항생제에 대해 저항성 을 가질 수 있었다.
- , 2003). 이후 처리시간 경과에 따라, 그람 양성균인 장구균 및 포도 상구균 에서의 초음파 제거율은 대장균 보다 약 4배정도 작게 나타났으며, 이는 세포벽 두께에 따른 제거 효율 차이로 사료된다. 하지만 테트라시클린 처리를한 장구균의 15분 경과 후 처리 효율은 다른 항생제 처리보다 약 2배 정도 높은 점은 동일 균이라도 항생 제에 따라 처리 효율이 달라질 수 있음을 나타낸다 (Fig.
- 2-4). 조사 강도와 관계없이 그람 음성균인 대장균에 서의 제거 효율이 가장 큰 것으로 나타났고, 그람 양성균인 장구균, 포도상구균 순으로 균 수의 감소가 큰것으로 나타났다. 강도 변화에 따른 로그 제거율은 Table 6과 같으며, 대장균 수 감소는 지속적으로 발생 하여 15분 경과 후 초음파 조사 강도 20에서 약 1.
- 그람 음성균의 경우, 감수성 변화와 세균 불활성간에 음의 상관관계를 보였다. 초음파 조사 강도의 변화와 상관없이 세균 불활성화는 감수성을 증가하는 효과를 야기하나, 균이 재활성화되면 저항성을 갖는 균의 비율이 증가하여 항생제 저항성을 회복하였다.
- 항생제 감수성 변화는 그람 양성균에 비해 그람 음성균에서 더 민감하게 나타났다. 초음파를 조사한 5가지 항생제 계열에 대해서 페니실린 계열 항생제에 대하여 가장 큰 감수성 증가를 보였으며, 술폰아미드 계열 항생제에 대해서는 모든 균들의 저항성에 큰 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 간섭효과 때문으로 추정되며, 초음파 처리 후 24시간 경과 후 감수성을 다시 측정했을 때, 감수성을 확보했던 균들이 대부분 저항성을 지니게 되었다는 것을 확인할 수 있었다.
- 술폰아미드(sulfonamide) 계열 설파메톡사졸 항생제가 처리된 대장균은 시간 경과에 따라 높은 항생제 감수성 나타내었다. 퀴놀린 (quinolone) 계열 시프로플록사신 및 테트라시클린 계열 테트라시클린 항생제에 대해서는 초음파 조사 강도 20 과 40에서 모두, 초기 중간내성이었던 대장균이 감수성이 증가하는 방향으로 변화하였지만, 24시간 경과 후 공통적으로 저항성을 회복하는 것으로 관찰 되었다. 그람 양성균인 장구균의 경우(Table 3), 페니 실린 계열 항생제에 대해서 시간 및 강도에 따른 감수성 변화는 뚜렷이 확인되지 않았다.
- 항생제 감수성 변화는 그람 양성균에 비해 그람 음성균에서 더 민감하게 나타났다. 초음파를 조사한 5가지 항생제 계열에 대해서 페니실린 계열 항생제에 대하여 가장 큰 감수성 증가를 보였으며, 술폰아미드 계열 항생제에 대해서는 모든 균들의 저항성에 큰 변화가 관찰되지 않았다.
후속연구
- 이를 통해, 초음파 조사에 의한 소독의 효과가 급격하게 크지는 않았으나, 초음파에 조사된 미생물의 재증식을 지체 시키는 효과는 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 소독 혹은 산화의 효과를 상승시킬 수 있는 적절한 산화제나 촉매 등의 조합을 통해 항생제 내성세균의 사멸을 위한 추가 연구가 필요하다고 판단된다.
- , 2018). 따라서 하수 성상이 항생제 내성균 성장에 미치는 복합적인 영향에 대해서는 추가 연구가 필요 하다고 판단된다. Fig.
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