[논문]인체 흑색종 세포에 대한 와송 추출물의 세포주기 억제를 통한 항암효과와 기전 연구

류덕현; 류덕선

doi:10.6114/jkood.2019.32.4.001

인체 흑색종 세포에 대한 와송 추출물의 세포주기 억제를 통한 항암효과와 기전 연구
Anticancer and Signaling Mechanisms of Biologically Active Substances from Orostachys japonicus through Arrest of Cell cycle in Human Melanoma Cells 원문보기

韓方眼耳鼻咽喉皮膚科學會誌 = The journal of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology, v.32 no.4, 2019년, pp.1 - 12

류덕현 (대전대학교 한의과대학 안이비인후피부과학 교실) , 류덕선 (순천향대학교 의료과학대학 임상병리학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The purpose of this study was to identify the anticancer effect of biological substances of ethylacetate(EtOAc) fraction from Orostachys japonicus(OJEF), their effect on human melanoma A375 cells and the related molecular mechanisms. Methods : The MTS assay was used to confirm the inhibition of cancer cell proliferation in A375 cells. And the $MUSE^{TM}$ analyzer was used to determine the ability of OJEF to induce cell cycle arrest. Western blotting was used to determine the changes in protein expression in A375 cells after treatment with OJEF. Results : OJEF showed cytotoxicity to A375 cells. And cell cycle arrest occurred in G1 phase and G2/M phase owing to inhibition of CDK1, cyclin B1, CDK4, and cyclin D, which are related to cell cycle regulation and cell division control. Conclusion : OJEF is effective in regulating cell cycle of human melanoma cells and thus can be a good theraputic agent to treat patients with melanoma.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Scheme for Extraction and Preparation of EtOAc Fraction from O. Japonicus
그림 Fig. 2. Effect of OJEF on Viability of A375 Cells The cells were treated with the indicated concentration(0, 0.1% DMSO, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, and 150㎍/㎖) of OJEF for (A) 12, (B) 24 and (C) 48 h, and the cell viabilities were examined by using the MTS assay. The values are expressed as the mean ± SD. *Significantly different from the control at p<0.05.
그림 Fig. 3. Effect of OJEF on Cell Cycle Regulation in A375 Cells The cells were treated with the indicated concentration(A–G; 0, 0.1% DMSO, 20, 40, 60, 80, and 100㎍/㎖) of OJEF for 6 h, and the cell cycle distribution was determined by using a MUSE™ analyzer. Histograms display G0/G1, S, and G2/M phase of A375 cells. The data shown are representative of three experiments.
표 Table 1. Effect of OJEF on Cell Cycle Regulation in A375 Cells
그림 Fig. 5. Effect of OJEF Treatment on Protein Expression of CDK1 and Cyclin B1 in A375 Cells The cells were treated with the indicated concentration(0, 0.1% DMSO, 20, 40, 60, and 80㎍/㎖) for (A) 12 h and (B) 24 h. The expression of CDK1 and cyclin B1 was examined by western blotting. The band density was quantitated and plotted on the bar graph. CDK1, 34 kDa; cyclin B1, 55 kDa. GAPDH was used as an internal control. The intensities of bands were determined by using Image J software for three separate experiments with similar results. The values are expressed as the mean ± SD. *Significantly different from the control at p<0.05.
그림 Fig. 4. Effect of OJEF Treatment on Protein Expression of CDK4 and Cyclin D1 in A375 Cells The cells were treated with the indicated concentration(0, 0.1% DMSO, 20, 40, 60, and 80㎍/㎖) for (A) 12 h and (B) 24 h. The expression of CDK4 and cyclin D1 was examined by western blotting. The band density was quantitated and plotted on the bar graph. CDK4, 30 kDa; cyclin D1, 36 kDa. GAPDH was used as an internal control. The intensities of bands were determined by using ImageJ software for three separate experiments with similar results. The values are expressed as the mean ± SD. *Significantly different from the control at p<0.05.

AI 본문요약
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문제 정의

이에 본 연구에서는 와송 유래 생리활성물질에 의한 인체 흑색종 A375SM 세포에 대한 항암 효과를 세포주기 조절의 관점에서 확인하고 이의 분자적 기전을 밝히고자 한다

제안 방법

시간별 6, 12, 24h 배양 후, 상층액을 모두 제거하고 MTS 시약 100㎕를 분주하였다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 1h 배양 후, 470㎚에서 Multiskan sky microplate spectrophotometer(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를이용하여 흡광도를 측정하였다. MTS를 이용한 cell viability assay는 3번 반복 실험하여 평균결과 및 standard deviation 수치를 산출하였다.
A375 human melanoma cells에 대한 EtOAc fraction의 농도별 세포주기 제어능을 확인하기 위하여 MUSE® Cell Cycle Kit를 사용하였고,실험방법은 제조사에서 지시하는데로 수행하였다.
A375 human melanoma cells에 대한 EtOAcfraction의 농도별, 시간별 세포생존율을 확인하기 위하여 CellTier 96 non-radioactive cell proliferation assay kit를 사용하였고, 실험방법은 제조사에서 지시하는 대로 수행하였다. 96 well plates에 5×10⁵ cells/㎖ 농도로 세포를 분주한 후, 18h 37℃, 5% CO₂incubator에서 배양하였다.
A375 세포에 대한 암세포 증식 억제효과를 MTS assay를 통하여 확인하였다. 암세포의 증식이 OJEF의처리농도와 배양시간에 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig.
A375 인체 흑색종 세포에 대한 와송의 항암효과를 실험적으로 규명하기 위하여 OJEF를 투여한 후 암세포증식 억제효과와 cell cycle arrest 유도능을 측정하고 western blotting을 통하여 apoptosis 관련 유전자 및 단백질의 발현을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. A375 인체 흑색종 세포의 증식이 OJEF의 처리농도와 배양시간에 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었고 세포주기 조절을 보면 농도 의존적으로 G1 phase는 유의적으로 arrest가 증가하였고, G2/M phase으로의 진행은 유의적으로 감소하였다.
MTS(3-[4,5-dimethylythiazol-2-yl]-5-[3-carbpxymethoxyphenyl]-2-[4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium, innersalt) 용액인 CellTier 96 non-radioactive cell proliferation assay kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하였고, Apoptosis 유도능과 cell cycle arrest 정도를 확인하기 위하여 MUSE®Annexin V and Dead Cell Assay Kit(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)와 MUSE®Cell Cycle Kit(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 사용하였다.
37℃, 5% CO₂ incubator에서 1h 배양 후, 470㎚에서 Multiskan sky microplate spectrophotometer(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를이용하여 흡광도를 측정하였다. MTS를 이용한 cell viability assay는 3번 반복 실험하여 평균결과 및 standard deviation 수치를 산출하였다.
MUSE™ analyzer를 이용하여 분석하기 직전에 EtOAc 분획물의 농도별 시료를 전처리 하였다.
MUSE™ analyzer를 이용한 cell cycle analysis는 3번 반복 실험하여 평균결과 및 standard deviation 수치를 산출하였다.
2). OJEF를 농도별(0, 0.1%DMSO, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 150㎍/㎖)로 처리 하고, 12h 후 회수하여 보라색의 formazan 형성정도를 470㎚ 흡광도에서 측정하고, 대조군을 100% 생존율로 보고 각 농도별 실험군의 결과 값을 %으로 환산한 값을 그래프로 나타내었다(Fig. 2A). 그 결과, Control에 비해 각 농도별(20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 150㎍/㎖) 결과 값은 순서대로 10⁴.
OJEF의 A375 human melanoma cells에 대한 cell cycle arrest 유도능을 확인하기 위하여 MUSE™analyzer를 이용하여 G0/G1, S, G2/M phase의 %를각각 측정하였다.
OJEF의 A375 세포에 대한 cell cycle arrest 유도능을 확인하기 위하여 MUSE™ analyzer를 이용하여 G0/G1, S, G2/M phase의 %를 각각 측정하였다.
Round bottom flask안에 200g의 powder O. japonicus과 95% ethyl alcohol(EtOH) 1ℓ를 현탁한 다음 reflux condenser(SciLab®, Seoul, Korea)를 이용하여 3h, 3회 끓였다.
The cells were treated with the indicated concentration(0, 0.1% DMSO, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, and 150㎍/㎖) of OJEF for (A) 12, (B) 24 and (C) 48 h, and the cell viabilities were examined by using the MTS assay. The values are expressed as the mean ± SD.
The cells were treated with the indicated concentration(A–G; 0, 0.1% DMSO, 20, 40, 60, 80, and 100㎍/㎖) of OJEF for 6 h, and the cell cycle distribution was determined by using a MUSE™ analyzer.
대조군 및 실험군에 대한 농도별 cell cycle arrest정도를 G1, S,G2/M phase로 구분지어서 MUSE™ analyzer(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)을 이용하여 측정하였다.
KG, Staufen, Germany)를 사용하여 40℃에서EtOH를 완전히 증발시켰다. 동일 플라스크에 1ℓ의 double distilled water(H₂O)를 넣고 충분히 흔들어준 후, 동량의 n-hexane(hexane), dichloromethane(DCM), ethylacetate(EtOAc), n-butanol(BuOH), H₂O순으로 systematic solvent fractionation을 수행하였다(Fig. 1). 각각 회수된 solvent fraction은 rotary evaporator을 사용하여 용매를 완전히 제거하고, 유리용기에 옮겨담은 후, silica gel이 들어있는 밀폐된 용기에서 충분히 건조시키고 가루로 분쇄하여 –20℃ 냉동보관하였다.
MTS(3-[4,5-dimethylythiazol-2-yl]-5-[3-carbpxymethoxyphenyl]-2-[4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium, innersalt) 용액인 CellTier 96 non-radioactive cell proliferation assay kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하였고, Apoptosis 유도능과 cell cycle arrest 정도를 확인하기 위하여 MUSE^®Annexin V and Dead Cell Assay Kit(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)와 MUSE^®Cell Cycle Kit(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 또한 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)solution(VECTASHIELD mounting medium with DAPI, Burlingame, CA, USA)으로 핵을 염색하여 형광현미경으로 확인하였다. Western blotting을 위하여 사용한 primary antibodies인 NF-κB, Bcl-2, pro-caspase-3, cleaved caspase-3, CDK1, CDK4, Cyclin B1, Cyclin D1, p-ERK, p-JNK, p-p38, ERK, JNK, p38은 cell signaling technology(Danver, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였고, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 AbFrontier(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
96 well plates에 5×10⁵ cells/㎖ 농도로 세포를 분주한 후, 18h 37℃, 5% CO₂incubator에서 배양하였다. 배양 후 SF media로 washing하고, 6h starvation 시킨 후, EtOAc fraction을 농도별(0, 20, 40, 60, 80, 100㎍/㎖)로 처리하였다. 시간별 6, 12, 24h 배양 후, 상층액을 모두 제거하고 MTS 시약 100㎕를 분주하였다.
6 well plates에 5×10⁵ cells/㎖ 농도로 세포를 분주한 후, 18h 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양 후 SF media로 한번 washing하고, 6hstarvation 시킨 후, EtOAc fraction을 농도별(0, 20,40, 60, 80, 100㎍/㎖)로 처리하였다. 6h 배양 후, 상층액을 모두 제거하고, 1×PBS를 사용하여 2번 세척하였다.
6 well plates에 5×10⁵ cells/㎖ 농도로 세포를 분주한 후, 18h 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양 후 SF media로 한번 washing하고, 6hstarvation 시킨 후, EtOAc fraction을 농도별(0, 20,40, 60, 80, 100㎍/㎖)로 처리하였다. 6h 배양 후, 상층액을 모두 제거하고, 1×PBS를 사용하여 2번 세척하였다.
세포가 90-95% confluency를 보일 때, 4-5일마다 계대배양하였고, 1-2일마다 1×PBS를 사용하여 2번 세척하고 배지를 교체해 주었다.
세포주는 모든 실험에서 5×105 cells/㎖ 농도로 사용하였고, 농도별 EtOAc fraction(0, 20, 40, 60, 80, 100㎍/㎖)을 처리하기 전, 1% penicillin-streptomycin만 들어 있는 serum free(SF) media를 이용하여 6h 이상 starvation 하였다.
배양 후 SF media로 washing하고, 6h starvation 시킨 후, EtOAc fraction을 농도별(0, 20, 40, 60, 80, 100㎍/㎖)로 처리하였다. 시간별 6, 12, 24h 배양 후, 상층액을 모두 제거하고 MTS 시약 100㎕를 분주하였다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 1h 배양 후, 470㎚에서 Multiskan sky microplate spectrophotometer(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를이용하여 흡광도를 측정하였다.
반응 membrane을 1×PBST buffer에 5분간 3번 세척하고, 세척 후 membrane은 1:500으로 희석한 2차 antibody와 4℃에서 2h 반응시키고 다시 1×PBST에 세 번 세척하였다. 표적 단백질은 ECL detection kit(Santa Cruz, CA, USA)를 이용하여 X-ray film에 감광시켜 확인하였고, band는 ImageJ software를 이용하여 분석하였다.

대상 데이터

A375 human melanoma cell lines은 Korean cell line bank(KCLB, Seoul, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양과정에서는 Dulbecco’s modifiedEagle’s medium(DMEM; Corning, Manassas.
O. japonicus은 Geobugiwasong 농장(Miryang, Korea)으로부터 제공받았다. O.
Western blotting을 위하여 사용한 primary antibodies인 NF-κB, Bcl-2, pro-caspase-3, cleaved caspase-3, CDK1, CDK4, Cyclin B1, Cyclin D1, p-ERK, p-JNK, p-p38, ERK, JNK, p38은 cell signaling technology(Danver, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였고, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 AbFrontier(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
Western blotting을 위하여 사용한 primary antibodies인 NF-κB, Bcl-2, pro-caspase-3, cleaved caspase-3, CDK1, CDK4, Cyclin B1, Cyclin D1, p-ERK, p-JNK, p-p38, ERK, JNK, p38은 cell signaling technology(Danver, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였고, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 AbFrontier(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 그리고 Mouse anti-Rabbit IgG-HRPconjugated secondary antibodies는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.
본 연구에 사용한 세포주는 A375 human melanoma cell로서 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin이 들어있는 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 세포가 90-95% confluency를 보일 때, 4-5일마다 계대배양하였고, 1-2일마다 1×PBS를 사용하여 2번 세척하고 배지를 교체해 주었다.
각각 회수된 solvent fraction은 rotary evaporator을 사용하여 용매를 완전히 제거하고, 유리용기에 옮겨담은 후, silica gel이 들어있는 밀폐된 용기에서 충분히 건조시키고 가루로 분쇄하여 –20℃ 냉동보관하였다. 본 연구에 사용한 용매 분획물은 이전의 연구에서 항암효과가 가장 뛰어난 것으로 밝혀진¹⁵⁾ EtOAc 분획물로서 실험 전 세포실험전용 0.1% dimethyl sulfoxide(DMSO; applichem GmbH, Darmstadt, Germany) 용액에 녹여서 사용하였다.

데이터처리

모든 실험 결과는 3번 이상 반복실험하여 평균결과값및 standard deviation 수치를 산출하였다. 통계 처리는 p<0.
통계 처리는 p<0.05 수준에서 Student's t-test에 의해 유의차를 검증하였다.

이론/모형

A375 human melanoma cells에 대한 EtOAc fraction의 농도별, 시간별 단백질 발현정도를 확인하기 위하여 Western blotting을 수행하였다. 6 well plates에 5×10⁵ cells/㎖ 농도로 세포를 분주한 후, 18h 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.
3와 Table 1에서 보이듯, OJEF 처리 후, A375 human melanoma cells의 세포증식이 G1 phase arrest에 의해서 세포 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 이와 관련하여 각 세포주기를 조절하는 인자에 대하여 단백질 수준에서 western blotting을 통하여 확인하였다. MUSE^™ analyzer를 이용하여 실험한 cell cycle 결과에서 G1 phase는 유의적으로 arrest가 증가하였고, G2/M phase으로의 진행은 유의적으로 감소하였다.

성능/효과

A375 인체 흑색종 세포에 대한 와송의 항암효과를 실험적으로 규명하기 위하여 OJEF를 투여한 후 암세포증식 억제효과와 cell cycle arrest 유도능을 측정하고 western blotting을 통하여 apoptosis 관련 유전자 및 단백질의 발현을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. A375 인체 흑색종 세포의 증식이 OJEF의 처리농도와 배양시간에 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었고 세포주기 조절을 보면 농도 의존적으로 G1 phase는 유의적으로 arrest가 증가하였고, G2/M phase으로의 진행은 유의적으로 감소하였다. CDK4와 cyclin D1, CDK 1과 cyclin B1의 단백질 발현량이 농도 및 시간 의존적으로 감소하였다.
4B). CDK 1과 cyclin B1complex의 경우에서도 농도 및 시간 의존적으로 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 5). 12h의 CDK 1 경우, 3.
A375 인체 흑색종 세포의 증식이 OJEF의 처리농도와 배양시간에 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었고 세포주기 조절을 보면 농도 의존적으로 G1 phase는 유의적으로 arrest가 증가하였고, G2/M phase으로의 진행은 유의적으로 감소하였다. CDK4와 cyclin D1, CDK 1과 cyclin B1의 단백질 발현량이 농도 및 시간 의존적으로 감소하였다.
또한 분열기로 진행하기 전에 DNA 복제가 종결되었는지 확인하는 시기는 G2/M phase로서 관여하는 단백질은 CDK1과 cyclin B1 complex 이다. Fig. 4는 OJEF 처리 후, 농도(0, 0.1% DMSO, 20, 40, 60, 80㎍/㎖) 및 시간(12 및 24h)에 따른 CDK4와 cyclin D1의 발현정도를 확인한 결과로서, 농도 및 시간 의존적으로 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 각 농도별 band 강도를 house keeping gene인 GAPDH와 비교하여 수치로 변환한 것을 그래프로 나타낸 결과를 보면, 12h의 CDK 4 경우, 1.
MUSE™ analyzer를 이용하여 실험한 cell cycle 결과에서 G1 phase는 유의적으로 arrest가 증가하였고, G2/M phase으로의 진행은 유의적으로 감소하였다.
OJEF를 농도별로 처리 하고, 24h 후 회수하여 MTS assay를 수행한 결과, 농도별(20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 150㎍/㎖)로92.21±0.85, 93.55±5.65, 80.32±0.93, 68.78±0.80, 47.34±0.12, 39.88±1.78, 28.67±0.88, 27.47±0.37이었고, 이중 20㎍/㎖와 60㎍/㎖에서부터 유의적으로 감소하였다(Fig. 2B).
OJEF를 농도별로 처리 하고, 48h 후 회수하여 MTS assay를 수행한 결과, 농도별 (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 150㎍/㎖)로76.97±1.56, 68.15±1.38, 51.85±1.38, 51.85±5.88, 41.74±1.34, 28.18±0.46, 21.31±0.71, 19.87±2.42, 18.38±1.15이었고, 20㎍/㎖에서부터 유의적으로 감소하였다(Fig. 2C).
본 연구에서는 OJEF 처리 시 농도 의존적으로 G1 phase는 유의적으로 arrest가 증가하였고, G2/M phase으로의 진행은 유의적으로 감소하였다. OJEF를 농도별로 처리하고 6h 배양했을 때 100㎍/㎖ 처리군에서 control에 비해 G0/G1 phase peak의 %는 1.4배 증가하였고, 같은 농도에서 G2/M phase peak의 % 는 control에 비해 2.44배 감소하였다. 이와 같은 결과를 통하여 OJEF가 A375 human melanoma cells의 G1 phase를 arrest 시킴으로서 암세포 증식을 억제함을 확인하였다.
각 농도별 band 강도를 house keeping gene인 GAPDH와 비교하여 수치로 변환한 것을 그래프로 나타낸 결과를 보면, 12h의 CDK 4 경우, 1.93±1.82 인 control과 비교하여 농도별(20, 40, 60, 80㎍/㎖)로 0.73±0.25, 0.46±0.22, 0.66±0.20, 0.29±0.05으로 감소하였고, cyclin D1의 경우, 1.37±0.47인 control과 비교하여 농도별(20, 40, 60, 80㎍/㎖)로 0.70±0.13, 0.37±0.04, 0.29±0.06, 0.14±0.07으로 감소하는 경향을 보였으며, 40㎍/㎖에서부터 유의적으로 감소하였다(Fig. 4A).
그 결과, Control에 비해 각 농도별(20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 150㎍/㎖) 결과 값은 순서대로 104.88±1.38, 105.95±1.46, 98.05±0.90, 97.1±2.42, 74.59±1.24, 58.32±3.82, 57.39±8.58, 36.49±2.93이었고, 100㎍/㎖에서부터 유의적으로 감소하였다.
그리고 24h의 CDK 1 경우, 1.74±0.22 인 control과 비교하여 농도별(20, 40, 60, 80㎍/㎖)로 1.94±0.76, 1.79±1.14, 1.09±0.77, 0.94±0.80으로 감소하였고, cyclin B1의 경우, 0.54±0.16인 control과 비교하여 농도별(20, 40, 60, 80㎍/㎖)로 0.49±0.26, 0.36±0.34, 0.12±0.15, 0으로 감소하는 경향을 보였으며, 60㎍/㎖에서부터 유의적으로 감소하였다(Fig.5B).
analyzer를 이용하여 G0/G1, S, G2/M phase의 %를 각각 측정하였다. 농도별(0, 0.1% DMSO, 20, 40, 60, 80, 100㎍/㎖)로OJEF를 처리하고 6h 배양 후 세포주기를 확인한 histogram 결과, 농도의존적으로 G0/G1 phase peak가 높아지는 것이 관찰되었으며, 반대로 G2/M phase peak는 낮아지는 현상이 관찰되었다(Fig. 3). Fig.
그러나 과다한 DNA 손상이 야기되어 DNA 수복이 어려워지게 되면 G1/S 또는 G2/M check point에서 이를 감지하여 apoptosis가 유도되어 게놈상의 안전성을 유지하고 있다³⁶⁾. 본 연구에서는 OJEF 처리 시 농도 의존적으로 G1 phase는 유의적으로 arrest가 증가하였고, G2/M phase으로의 진행은 유의적으로 감소하였다. OJEF를 농도별로 처리하고 6h 배양했을 때 100㎍/㎖ 처리군에서 control에 비해 G0/G1 phase peak의 %는 1.
A375 세포에 대한 암세포 증식 억제효과를 MTS assay를 통하여 확인하였다. 암세포의 증식이 OJEF의처리농도와 배양시간에 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig. 2). OJEF를 농도별(0, 0.
또한 CDK 1과 cyclin B1가 농도 및 시간 의존적으로 감소한 것은 G2/M phase로의 진행을 늦추는 것과 연관된 것으로 보인다. 이를 통하여 OJEF가 A375 흑색종 세포의 세포주기 정지를 일으켜 세포분열이 제어됨으로써 증식이 억제될 것으로 사료된다.
이상의 결과를 종합하면 OJEF는 흑색종 세포주인 A375 cells에 선택적으로 시간 및 농도 의존적인 세포독성을 보였으며 세포주기 조절과 관련된 CDK1, cyclin B1, CDK4, cyclin D 억제로 G1 phase와 G2/M phase에서 세포주기 정지가 일어나 세포분열이 제어되었음을 확인하였다. 따라서 와송 유래 생리 활성 물질의 흑색종에 대한 항암 효과가 확인되었으므로 앞으로 와송 추출물의 항암제로의 개발을 위해서는 세포자멸사에 대하여 보다 정확한 신호전달 기전 연구와 in vivo 연구가 필요하리라 사료되며 이를 바탕으로 다양한 질병으로 고통받는 환자들을 치료하는 데 도움이 될 치료제로서 개발 가능성이 매우 높다고 사료된다.
44배 감소하였다. 이와 같은 결과를 통하여 OJEF가 A375 human melanoma cells의 G1 phase를 arrest 시킴으로서 암세포 증식을 억제함을 확인하였다. 이는 G1기 이행단계를 조절하는 CDK4와 cyclin D1의 단백질 발현량이 농도 및 시간 의존적으로 감소한 것과 깊은 관련이 있을 것으로 판단된다.

후속연구

이상의 결과를 종합하면 OJEF는 흑색종 세포주인 A375 cells에 선택적으로 시간 및 농도 의존적인 세포독성을 보였으며 세포주기 조절과 관련된 CDK1, cyclin B1, CDK4, cyclin D 억제로 G1 phase와 G2/M phase에서 세포주기 정지가 일어나 세포분열이 제어되었음을 확인하였다. 따라서 와송 유래 생리 활성 물질의 흑색종에 대한 항암 효과가 확인되었으므로 앞으로 와송 추출물의 항암제로의 개발을 위해서는 세포자멸사에 대하여 보다 정확한 신호전달 기전 연구와 in vivo 연구가 필요하리라 사료되며 이를 바탕으로 다양한 질병으로 고통받는 환자들을 치료하는 데 도움이 될 치료제로서 개발 가능성이 매우 높다고 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	세포주기란 무엇인가?	세포는 세포가 mitosis하는 시기(M phase)와 염색체 DNA를 synthesis하는 S phase, 그리고 이들의 준비를 행하는 시기(G1 and G2 phase)를 반복하여 증식하는데, 이 반복을 세포주기라 한다9). 세포의 증식과고사는 세포주기에 의해 결정되는데, 세포주기는 regulatory cyclins subunits, cyclin dependent kinases 그리고 their inhibitors 같은 세포주기 조절인자에 의해 조절된다10).
	서양의학에서 피부암의 치료 방법에는 무엇이 있는가?	서양의학에서 피부암의 치료는 외과적 절제술이 가장일반적인 치료 방법이며 동결요법, 소파술, 전기건조법,광역동치료, 방사선요법, 화학요법, 면역요법 등의 다양한 치료방법이 있다5). 그러나 흑색종이 다른 피부암보다 더 치명적인 이유는 항암화학요법에 대한 저항성을가지고 있어 20% 정도의 환자에서만 치료효능을 보이기 때문이다6).
	서양의학의 피부암 치료 방법이 흑색종에게 유효하지 않은 이유는 무엇인가?	서양의학에서 피부암의 치료는 외과적 절제술이 가장일반적인 치료 방법이며 동결요법, 소파술, 전기건조법,광역동치료, 방사선요법, 화학요법, 면역요법 등의 다양한 치료방법이 있다5). 그러나 흑색종이 다른 피부암보다 더 치명적인 이유는 항암화학요법에 대한 저항성을가지고 있어 20% 정도의 환자에서만 치료효능을 보이기 때문이다6). 약물 저항성에 대한 기전연구는 아직 밝혀지지 않았지만 세포의 죽음 기전과 연관되어 있다고생각되고 있으며, 또한 이것이 질병의 진행과 전이에연관되어 있다고 알려져 있어 세포의 죽음에 관한 기전 연구가 절실히 요구되고 있다7,8).

참고문헌 (36)

Sekulic A, Haluska P Jr, Miller AJ, Lamo JGD, Ejadi S, Pulido JS, et al. Malignant melanoma in the 21st century: the emerging molecular landscape. Mayo Clinic Proc. 2008;83(7):825-46.

상세보기
Rigel DS, Carucci JA. Malignant melanoma: prevention, early detection, and treatment in the 21st century. CA Cancer J Clin. 2000;50(4):215-36.

상세보기
Cho HK, Yu SJ, Roh JY, Hwang WI, Sohn HJ. Molecular Mechanism of the Antiproliferative Effect by Ginseng Panaxynol on a Human Malignant Melanoma Cell Line, SK-MEL-1. J Ginseng Res. 1999;23(3):190-7.
Kwon JH, Lee DS, Jung EC, Kim HM, Kim SB, Ryu DS. Anti-cancer activity of the ethylacetate fraction from Orostachys japonicus in A549 human lung cancer cells by induction of apoptosis and cell cycle arrest. Asia-pacific Journal of Multimedia Services Convergent with Art, Humanities, and Sociology. 2017;7(1):395-405.
Lee BM, Shim JS, Kim TS Han DG. Clinical Consideration of 137 Cases of Basal Cell Carcinoma in Face. Arch Craniofac Surg. 2013;14(2):107-10.

원문보기 상세보기
Hussein MR, Haemel AK, Wood GS. Apoptosis and melanoma: molecular mechanisms. J Pathol. 2003;199(3):275-88.

상세보기
Helmbach H, Rossmann E, Kern MA, Schadendorf D. Drug-resistance in human melanoma. Int J Cancer. 2001;93(5):617-22.

상세보기
Kang YJ, Jung HJ, Yim KI, Lee KY, Lee YS, Kang SJ, et al. Alternation of Apoptosis- Related Proteins(Apaf-1, Caspase-9, Bcl-2, p53, and Survivin) According to Malignant Progression in Cutaneous Melanocytic Lesion. Korean J Pathol. 2011;45(3):247-53.

상세보기
Yamamoto T, Senba K. Illustration map of cell signaling. (SG Oh and ES Oh trasslation). Seoul:World science. 2006.
Athar M, Back JH, Kopelovich L, Bickers DR, Kim AL. Multiple molecular Targets of Resveratrol: Anti-carcinogenic Mechanisms. Arch Biochem Biophys. 2009;486(2):95-102.

상세보기
Ryu DS, Kim SH, Kwon JH, et al. Orostachys japonicus induces apoptosis and cell cycle arrest through the mitochondria-dependent apoptotic pathway in AGS human gastric cancer cells. Int J Oncol. 2014;45(1):459-69.

상세보기
Jo CS and Jo JG. A Literature Review about Orostachys japonicus. J Korean Med Daejeon Univ. 1993;2(2):83-98.
Jeong JH, Ryu DS, Suk DH, Lee DS. Anti-inflammatory effects of ethanol extract from Orostachys japonicus on modulation of signal pathways in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. BMB REP. 2011;44(6):399-404.

원문보기 상세보기
Je Ma C, Jung WJ, Lee KY, Kim YC, Sung SH. Calpain inhibitory flavonoids isolated from Orostacys japonicus. J Enzyme Inhib Medic Chem. 2009;24(3):676-9.

상세보기
Ryu DS, Lee HS, Lee GS, Lee DS. Effects of the Ethylacetate Extract of Orostachys japonicus on Induction of Apoptosis through the p53-Mediated signaling Pathway in Human Gastric Cancer Cells. Biol Pharm Bull. 2012;35(5):660-5.

상세보기
Yoon SY, Lee SY, Kim KBWR, Song EJ, Kim SJ, Lee SJ, et al. Antimicrobial activity of the solvent extract from different parts of Orostachys japonicus. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2009;38(1):14-8.

원문보기 상세보기
Lee SJ, Zhang GF, Sung NJ. Hypolipidemic and hypoglycemic effects of Orostachys japonicus A. Berger extracts in streptozotocin-induced diabetic rats. Nutr Res Pract. 2011;5(4):301-7.

원문보기 상세보기
Lee GS, Lee HS, Kim SH, Suk DH, Ryu DS, Lee DS. Anti-cancer activity of the ethylacetate fraction from Orostachys japonicus for modulation of the signaling pathway in HepG2 human hepatoma cells. Food Sci Biotechnol. 2014;23(1):269-75.

원문보기 상세보기
Ryu DS, Baek GO, Kim EY, Kim KH, Lee DS. Effects of polysaccharides derived from Orostachys japonicus on induction of cell cycle arrest and apoptotic cell death in human colon cancer cells. BMB REP. 2010;43(11):750-5.

원문보기 상세보기
Kim CM, Shin MG, Lee GS, et al. Dictionary of Chinese herbs(7). Seoul:Jungdam. 1998:4042-4.
Lee WS, Yun JW, Nagappan A, Jung JH, Yi SM, Kim DH, et al. Flavonoids from Orostachys Japonicus A. Berger Induces Caspase-dependent Apoptosis at Least Partly through Activation of p38 MAPK Pathway in U937 Human Leukemic Cells. Asian Pac J Cancer Prev. 2015;16(2):465-9.

원문보기 상세보기
Park HJ, Lim SC, Lee MS, Young HS. Triterpene and Steroids from Orostachys japonicus. Kor J Pharmacog. 1994;25(1):20-3.
Kim JS, Yoon SH, Ryu BH, Ryu KW. Anti-cancer Effects of Orostachyos Herba on some Kinds of Cancer Cells. Korean J Intern Med. 2005;26(2):333-40.
Kim JY, Jung EJ, Won YS, Lee JH, Shin DY, Seo KI. Cultivated Orostachys japonicus Induces Apoptosis in Human Colon Cancer Cells. Korean J Food Sci Technol. 2012;44(3):317-23.

원문보기 상세보기
Won YS, Lee JH, Kown SJ, Ahn DU, Shin DY, Seo KI. Anticancer Effects of Cultivated Orostachys japonicus on Human Prostate Cancer Cells. Korean J Food Sci Nutr. 2014;43(1):67-73.

원문보기 상세보기
Kim KS, Yea SC, Yoo BC, Cho CK, Lee YW, Yoo HS. Altered Protein Expression in Ovarian and Cervical Cancer Cells by the Treatment of Extracts from Euonymus alatus Sieb, Oldenlandia diffusa(Wild.) Roxburgh, and Orostachys japonicus A. Berger. Korean J Intern Med. 2011;32(1):33-42.
Yun KS, Kim YC, Lee JH, Woo HJ. Effect of Orostachys japonicus A. Berger on Apoptosis in K562 Cell Lines. Korean J Intern Med. 2006;27(1):166-77.
Oh HS and Kim JH. Effects of Partial Cervus elaphus Linne' Extract on Antitumoral Immune Response in Melanoma-induced Mice. J Korean Oriental Med. 2000;14(1):39-77.
Elwood JM. Melanoma and sun exposure. Semin Oncol. 1996;23(6):650-66.

상세보기
Garbe C, Eigentler TK. Diagnosis and treatment of cutaneous melanoma: state of the art 2006. Melanoma Res. 2007;17(2):117-27.

상세보기
Pines J. Protein kinases and cell cycle control. Semin Cell Biol. 1994;5(6):399-408.

상세보기
Elledge SJ, Harper JW. Cdk inhibitors: on the threshold of checkpoints and development. Curr Opin Cell Biol. 1994;6(6):847-52.

상세보기
Blagosklonny MV, Pardee AB. The Restriction Point of the Cell Cycle. Cell cycle. 2002;1(2):102-9.

상세보기
Stark GR, Taylor WR. Analyzing the G2/M Checkpoint. Meth Mol Biol. 2004;280(1):51-82.
Vermeulen K, Van Bockstaele DR, Berneman ZN. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Prolif. 2003;36(3):131-49.

상세보기
Ko HS, Kang KW, Kim JH. Anticancer Effects of Gleditsin in Human Mammary Cancer Cells. Yeungnam Univ J Med. 2007;24(2):580-90.

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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