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문제 정의
- 산국의 잎과 줄기에 대하여 새로운 약리작용과 성분 화합물을 연구함으로써 산국의 활용방안을 다양하게 모색해 볼 수 있을 것이고, 식물자원의 이용이란 측면에서 산국의 꽃과 더불어 잎과 줄기를 모두 이용할 수 있다면 자원의 수급이 훨씬 용이해질 것이다. 따라서 본 연구에서는 예로부터 한방과 민간에서 호흡기 보호에 많이 사용하고 있는 산국의 잎과 줄기로부터 생리활성물질을 추적하면서 유효성분을 분리하였고 그 화학구조를 규명하여 보고하는 바이다.
- , 1998a). 본 연구는 국화과 식물인 산국에서 약효성분으로 예상되는 sesquiterpene lactone을 분리하여 그 구조를 규명하고, 생물학적 활성을 평가함으로써 새로운 천연물 유래 생리활성물질의 탐색에 그 목적이 있다.
제안 방법
- 3종의 sesquiterpene lactone들을 대상으로 FPTase에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 Scintillation Proximity Assay를 실시하였다. 그 결과 Table 5와 같이 100 ㎍/㎖의 농도에서 화합물 1은 54%, 화합물 2는 78%, 화합물 3은 90%의 강한 저해율을 보였다.
- 96 well plate의 각 well에 5×103~2×104개의 실험 세포들을 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하여 세포를 well의 바닥에 부착시킨 후 단계별로 희석한 시료(30, 10, 3, 1, 0.3 ㎍/㎖)를 처리하여 48시간 더 배양하였다.
- Apoptosis 저해제로서의 개발가능성을 조사하기 위하여 3종의 sesquiterpene lactone들에 의한 caspase 3의 활성 저해 정도를 살펴보았다. 그 결과 Table 6에 나타낸 바와 같이 화합물 1은 100 ㎍/㎖의 농도에서 94%를 제해하였고, 화합물 2는 100 ㎍/㎖의 농도에서 91%를 저해하여 강한 활성을 보였다.
- U937 세포에 10 μM etoposide를 처리하여 apoptosis를 유도한 후 4시간 후에 현미경으로 cell의 모양을 관찰하여 apoptosis 여부를 1차 판정하였으며, 세포를 harvest 한 후 얻은 cell lysate를 이용하여 apoptosis에 중요한 역할을 담당하는 효소인 caspase 3의 활성을 측정하였다. Etoposide를 투여한 경우 유도된 caspase의 활성과 비 투여시의 활성을 기준으로 각 시료의 저해 활성을 환산하였다. Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)는 표준 caspase 3 저해제로 사용하였다.
- LPS로 유도된 murin macrophage에서 배지 내로 방출되는 NO의 량이 얼마나 감소되는가를 알아보기 위하여 Griess reagent를 이용한 NO production inhibitory activity assay를 실시하였다. 그 결과 Table 7에 나타낸 바와 같이 화합물 1은 IC50 값이 10 ㎍/㎖ 이며, 화합물 2는 IC50 값이 15 ㎍/㎖, 화합물 3은 IC50 값이 20 ㎍/㎖로 비교적 강한 활성을 보였다.
- U937 세포에 10 μM etoposide를 처리하여 apoptosis를 유도한 후 4시간 후에 현미경으로 cell의 모양을 관찰하여 apoptosis 여부를 1차 판정하였으며, 세포를 harvest 한 후 얻은 cell lysate를 이용하여 apoptosis에 중요한 역할을 담당하는 효소인 caspase 3의 활성을 측정하였다.
- 산국 잎·줄기 5 kg을 클로로포름으로 추출하여 얻은 조추출물 157 g을 silica column (70~230 mesh, 10×15 cm)에 loading하여 클로로포름/메탄올의 혼합용매에서 메탄올의 비율을 점진적으로 높여가며 1차 칼럼크로마토그래피를 실시하여 16개의 소분획물로 나누었다. 분획물의 분류 기준은 precoated TLC plate를 사용하여 상승 1차원법으로 전개시킨 후, UV254nm, UV366nm 조사와 10% 황산에 발색되는 반점의 색깔과 Rf 값의 차이에 따라 분류하였다. 16개의 분획물 중에서 UV254nm에서 약하게 형광을 나타내며 Rf 값이 0.
- 산국 잎·줄기 5 kg을 클로로포름으로 추출하여 얻은 조추출물 157 g을 silica column (70~230 mesh, 10×15 cm)에 loading하여 클로로포름/메탄올의 혼합용매에서 메탄올의 비율을 점진적으로 높여가며 1차 칼럼크로마토그래피를 실시하여 16개의 소분획물로 나누었다.
- 산국의 잎·줄기로 부터 생리활성 성분 연구를 위하여 다양한 크로마토그래피를 반복적으로 실시하여 3개의 guaianolide type의 sesquiterpene lactone들(화합물 1,2, 3)을 분리하였다.
- 3 ㎍/㎖)를 처리하여 48시간 더 배양하였다. 시료의 세포독성효과를 계산하기 위하여, 시료를 가하는 시점에서의 세포수(Tz, zero time)와 시료 대신 과량의 medium만을 가하여 48시간 배양하였을 때의 세포수(C, control) 및 각 농도의 시료를 함께 넣고 48시간 배양했을 때의 세포수(T, test)를 각각 측정하여 다음의 수식에 따라 시료가 암세포 성장을 50% 억제하는 농도인 GI50(50% growth inhibitory dose)을 계산하였다.
- 따라서, NO의 과잉방출은 여러 가지 생리학적인 문제를 유발할 수 있으며, NO의 방출을 억제하는 인자들을 발견하는 것은 NO의 독성으로 유발되는 질병 치료제의 개발을 위한 중요한 연구로 판단된다. 이러한 연구를 배경으로 본 연구에서는 산국의 잎줄기에서 분리한 sesquiterpene lactone들을 이용하여 대식세포 배양액내의 NO 생성량을 측정하였으며, 화합물 1, 2, 3의 IC50 값은 각각 10,20, 30 ㎍/㎖으로 확인되었다. NO 생성에 대한 저해활성은 sesquiterpene lactone들의 α-methylene-γ-lactonering 보다는 치환체의 종류에 따라 많은 연관성이 있는 것으로 판단되며, sesquiterpene lactone들의 골격형과 치환체의 종류에 따른 활성의 특이성은 NO의 합성에 관여하는 NOS의 active site에 대한 기질구조의 특이성과 세포막의 투과성이나 용해도의 차이 등에 의한 것으로 추측된다.
- 이중에서 Rf 값이 클로로포름/아세톤=1/1에서 0.9인 Fr.4을 sesquiterpene lactone으로 추정하고 silica column (230~400 mesh, 2×17 cm)에 loading하여 핵산/에틸아세테이트의 혼합용매에서 에틸아세테이트의 비율을 점진적으로 높여가며(19/1→1/1) 3차 칼럼크로마토그래피를 실시하였다.
- 7 cell은 100 ㎍/㎖ penicillin-streptomycin 및 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지로 배양하여 1×106/㎖의 농도로 조정한 후 96 well microplate의 각 well에 200 ㎕씩 분주하여 2시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 진공 흡입법으로 상등액을 제거한 후 새로운 배지로 교환한 다음 DMSO에 다양한 농도로 녹인 시료액 5 ㎕와 LPS (1 ㎍/㎖) 5 ㎕를 차례로 처리하여 다시 20시간동안 37℃, 5 % CO2 incubator에서 배양하였다. 배양 후 각 well에서 100 ㎕ 씩 상등액을 취하고 여기에 Griess reagent 100 ㎕를 가한 후 microplate reader로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 분획물의 분류 기준은 precoated TLC plate를 사용하여 상승 1차원법으로 전개시킨 후, UV254nm, UV366nm 조사와 10% 황산에 발색되는 반점의 색깔과 Rf 값의 차이에 따라 분류하였다. 16개의 분획물 중에서 UV254nm에서 약하게 형광을 나타내며 Rf 값이 0.7~0.9 (CHCl3 / MeOH=19/1)이고, 10% 황산에서 푸른색으로 발색되어 sesquiterpene lactone으로 추정되는 분획물 Fr.10을 선택하였다. Fr.
- 14로 부터 분리하였다. Fr.14에 대하여 화합물 1에서와 동일한 조건의 2차 칼럼크로마토그래피를 실시하여 12개의 분획물을 획득하였으며, 이 중에서 Rf 값이 에테르/메탄올=19/1에서 0.3인 Fr.8을 선택하였다. Fr.
- Etoposide를 투여한 경우 유도된 caspase의 활성과 비 투여시의 활성을 기준으로 각 시료의 저해 활성을 환산하였다. Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)는 표준 caspase 3 저해제로 사용하였다.
- RPMI 1640, DMEM, Fetal Bovine Serum (FBS), penicillin-streptomycin, trypsin-EDTA는 Gibco (Rockville, MD, USA) 제품을 사용하였고, PBS, Tris-Chloride, EGTA, EDTA, ammonium sulfate, phenylmethylsulfonyl fluoride, leupetin은 Sigma (St.Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Rotary evaporator(R-114, BUCHI, Flawil, Switzerland), UV/VIS spectrophotometer (DU-70, Beckman, Fullerton, CA, USA), UV lamp (UVGL-58 Mineralight lamp, UVP, Upland, CA, USA), Polarimeter (JASCO, Japan), IR spectrophotometer (ATI Mattson Genesis, UK), MS (JMS-DX300, JOEL, Japan), NMR (AW500, Bruker Analytische GmbH, Germany), MPLC (Yemazen, Japan), recyclic HPLC (JAI, Japan)의 것을 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Rotary evaporator(R-114, BUCHI, Flawil, Switzerland), UV/VIS spectrophotometer (DU-70, Beckman, Fullerton, CA, USA), UV lamp (UVGL-58 Mineralight lamp, UVP, Upland, CA, USA), Polarimeter (JASCO, Japan), IR spectrophotometer (ATI Mattson Genesis, UK), MS (JMS-DX300, JOEL, Japan), NMR (AW500, Bruker Analytische GmbH, Germany), MPLC (Yemazen, Japan), recyclic HPLC (JAI, Japan)의 것을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 세포주는 ACHN (kidney carcinoma), LOX-IMVI (melanoma), SW620 (colon adenocarcinoma), PC-3 (prostate adenocarcinoma),A549 (lung carcinoma)이며, 한국생명공학연구원에서 계대배양 중인 것을 분양 받아 사용하였다. 96 well plate의 각 well에 5×103~2×104개의 실험 세포들을 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하여 세포를 well의 바닥에 부착시킨 후 단계별로 희석한 시료(30, 10, 3, 1, 0.
- 본 실험에서 사용한 산국(C. boreale)은 경상남도 사천시 일대의 자생지에서 채집하여 그늘에서 건조하고 세절하여 실험에 사용하였으며, 클로로포름(CHCl3)으로 추출하였다. 즉, 산국의 꽃을 제외한 잎·줄기 5 kg을 상온에서 클로로포름 60ℓ로 3회 반복하여 추출한 후 rotary evaporator로 감압, 농축하여 용매를 완전히 제거한 후 -20℃에 보관하면서 유효성분의 분리에 이용하였다.
이론/모형
- FPTase의 활성은 Scintillation Proximity assay에 의해 측정하였다. 20 ㎕의 3H-FPP (farnesyl pyrophosphate), 20 ㎕ biotin lamin B peptide, 10 ㎕ 시료용액, 10 ㎕의 assay 완충용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.
- NO 방출 저해 활성은 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell에서 배양액으로 방출되는 NO2의 량을 Griess reagent를 이용한 흡광도법으로 측정하였다. RAW 264.
- , 1991). 지금까지 개발된 mechanism-based bioassay방법 중 본 실험에서는 FPTase inhibitor 탐색법을 사용하였다. FPTase는 세포의 증식과 분화를 조절하는 신호전달 과정에 관여하는 효소 중의 하나로서 farnesyl pyrophosphate의 farnesyl group을 암화과정에서 중요한 역할을 담당하는 ras protein에 전달하는 역할을 한다(Janice et al.
성능/효과
-
C-NMR spectral data for compound 1
13C-1H COSY (HMQC) 스펙트럼에서 endo methylene 1개와 exo methylene 1개가 분자 내에 존재함을 알 수 있었다
. 이상의 결과들은 DEPT스펙트럼의 결과들과 잘 일치하였다. - 13C-1H COSY (HMQC) 스펙트럼의 교차 peak로 부터 endo methylene 2개와 vinylic methylene 1개가 분자 내에 존재한다는 것을 알 수 있었고, 이상의 결과들은 DEPT 스펙트럼의 결과와 일치하였다. 1H-1H COSY 스펙트럼에서 H13a/b(6.
- 13C-NMR 스펙트럼에서 20개의 탄소 peak가 관찰되었고, 화학적 이동값 δ 169.2 ppm과 166.5 ppm으로부터 2개의 카르보닐기가 존재한다는 것을 알 수 있었다.
- 13C-NMR 스펙트럼에서는 탄소 수가 18개라는 것을 알 수 있었으며, 화학적 이동값 δ 169.6 ppm, 169.1 ppm의 peak로부터 2개의 카르보닐기가 존재한다는 사실 을알 수 있었다.
- 13C-NMR 스펙트럼에서는 탄소 수가 19개라는 것을 알 수 있었으며, 화학적 이동값 δ 170.0 ppm, 169.64 ppm의 peak로부터 3개의 카르보닐기가 존재한다는 사실을 알 수 있었다.
- DEPT 90과 135 스펙트럼에서는 4개의 CH3 (3H×4=12H), 3개의 CH2 (2H×3=6H), 6개의 CH (1H×6=6H)가 존재함을 알 수 있었다. 1H-NMR 스펙트럼의 적분비로부터 이 화합물에는 수소가 26개 존재하고 있다는 것을 알 수 있었다(Table 2). 따라서 이러한 분광학적인 자료를 종합하여 볼 때, 화합물 2의 분자식은 C20H26O6로 추정할 수 있었다.
- 이들은 국화과 식물의 대표적인 지표성분인 sesquiterpene lactone 계열 화합물이지만, 모두 산국의 잎·줄기에서는 처음으로 보고되는 물질이다. 3종의 sesquiterpene lactone들을 대상으로 인체암 세포주들에 대한 in vitro 세포독성을 조사한 결과 세포독성을 보였다. 특히 화합물 1이 강한 세포독성을 보였다.
- DEPT 90과 135 스펙트럼에서는 4개의 CH3 (3H×4=12H), 2개의 CH2 (2H×2=4H), 7개의 CH (1H×7=7H), 6개의 4차탄소가 존재하고 있음을 알 수 있었고, 1H-NMR 스펙트럼의 적분비로부터 이 화합물에는 24개의 수소가 존재함을 알 수 있었다(Table 3).
- DEPT 90과 135 스펙트럼에서는 4개의 CH3 (3H×4=12H), 2개의 CH2 (2H×2=4H), 7개의 CH (1H×7=7H), 그리고 5개의 4차탄소가 존재하고 있음을 알 수 있었고, 또 1H-NMR 스펙트럼의 적분비로부터 이 화합물에는 24개의 수소가 존재함을 알 수 있었다(Table 1).
- 특히 화합물 1이 강한 세포독성을 보였다. FPTase 활성 저해 효과는 화합물 1이 54%, 화합물 2는 78%, 화합물 3은 90%의 강한 저해율을 보였다. LPS에 의해 과다 생성된 NO도 3종의 sesquiterpene 화합물에 의해 저해됨을 확인하였다.
- HMBC로 분석해 본 결과 C10 탄소는 격리된 H14(1.18 ppm), H1(3.25 ppm) 및 H9a/b(2.32, 1.84 ppm), C4 탄소는 H1(3.25 ppm), H5(2.75 ppm) 및 H15(1.47 ppm)와의 교차 peak가 관찰되었다. C2 탄소는 H1(3.
- FPTase 활성 저해 효과는 화합물 1이 54%, 화합물 2는 78%, 화합물 3은 90%의 강한 저해율을 보였다. LPS에 의해 과다 생성된 NO도 3종의 sesquiterpene 화합물에 의해 저해됨을 확인하였다. 또한 3종의 화합물은 caspase 3의 활성을 90% 이상 억제하여 apoptosis를 저해하는 효과를 나타내었다.
- 격리된 H3′(6.28 ppm)는 H4′(2.02 ppm)와 교차 peak가 관찰되었고, H5′(1.94 ppm) 양성자는 H3과 allylic coupling을 하고 있음을 알 수 있었다.
- 3종의 sesquiterpene lactone들을 대상으로 FPTase에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 Scintillation Proximity Assay를 실시하였다. 그 결과 Table 5와 같이 100 ㎍/㎖의 농도에서 화합물 1은 54%, 화합물 2는 78%, 화합물 3은 90%의 강한 저해율을 보였다.
- LPS로 유도된 murin macrophage에서 배지 내로 방출되는 NO의 량이 얼마나 감소되는가를 알아보기 위하여 Griess reagent를 이용한 NO production inhibitory activity assay를 실시하였다. 그 결과 Table 7에 나타낸 바와 같이 화합물 1은 IC50 값이 10 ㎍/㎖ 이며, 화합물 2는 IC50 값이 15 ㎍/㎖, 화합물 3은 IC50 값이 20 ㎍/㎖로 비교적 강한 활성을 보였다.
- 1H-NMR 스펙트럼의 적분비로부터 이 화합물에는 수소가 26개 존재하고 있다는 것을 알 수 있었다(Table 2). 따라서 이러한 분광학적인 자료를 종합하여 볼 때, 화합물 2의 분자식은 C20H26O6로 추정할 수 있었다.
- LPS에 의해 과다 생성된 NO도 3종의 sesquiterpene 화합물에 의해 저해됨을 확인하였다. 또한 3종의 화합물은 caspase 3의 활성을 90% 이상 억제하여 apoptosis를 저해하는 효과를 나타내었다. 이상의 연구 결과는 산국의 잎·줄기를 암이나 염증성질환에 효과가 있는 다양한 한약제제와 술, 차 등의 기능성 제품으로 개발하는데 기초 자료가 될 수 있을 것이다.
- 보다 구체적인 구조동정을 위하여 HMBC로 분석해본 결과 C10 탄소는 격리된 H14(1.20 ppm)와 H1(2.31 ppm), H9a/b(3.04, 1.82 ppm) 교차 peak가 관찰되었고, C4 탄소는 H3(5.71 ppm), H5(3.77 ppm), H15(1.42 ppm)의 교차 peak가 관찰되었다. C11 탄소는 H13a/b (6.
- 암세포주인 ACHN (kidney carcinoma), LOX-IMVI (melanoma), SW620 (colon adenocarcinoma), PC-3 (prostate adenocarcinoma), A549 (lung carcinoma)에 대하여 산국의 잎과 줄기에서 분리한 3종의 sesquiterpene lactone들의 세포독성 활성을 조사한 결과 Table 4에서 보는 바와 같이 모든 세포주에 대해서 독성이 나타났다. 특히 화합물 1은 대조군인 Adriamycin 보다는 높았지만 실험에 사용된 모든 세포주에 대해서 GI50 값이 3.
- DEPT 90과 135 스펙트럼에서는 4개의 CH3 (3H×4=12H), 2개의 CH2 (2H×2=4H), 7개의 CH (1H×7=7H), 그리고 5개의 4차탄소가 존재하고 있음을 알 수 있었고, 또 1H-NMR 스펙트럼의 적분비로부터 이 화합물에는 24개의 수소가 존재함을 알 수 있었다(Table 1). 이러한 분광학적인 자료를 종합하여 볼 때, 화합물 1의 분자식은 C18H24O6로 추정할 수 있었다.
- DEPT 90과 135 스펙트럼에서는 4개의 CH3 (3H×4=12H), 2개의 CH2 (2H×2=4H), 7개의 CH (1H×7=7H), 6개의 4차탄소가 존재하고 있음을 알 수 있었고, 1H-NMR 스펙트럼의 적분비로부터 이 화합물에는 24개의 수소가 존재함을 알 수 있었다(Table 3). 이러한 분광학적인 자료를 종합하여 볼 때, 화합물 3의 분자식은 C19H24O7로 추정할 수 있었다.
- 이상의 결과들로부터 산국의 잎과 줄기에 인체암 세포주에서 세포독성을 나타내고 FPTase과 caspase 활성 및 NO의 생성을 저해하는 3종의 sesquiterpene lactone이 함유되어 있음을 확인하였다. 분리된 화합물 1, 2, 3은 Lee et al.
- H COSY (HMQC) 스펙트럼에서 endo methylene 1개와 exo methylene 1개가 분자 내에 존재함을 알 수 있었다. 이상의 결과들은 DEPT스펙트럼의 결과들과 잘 일치하였다. 1H-1H COSY 스펙트럼에서 H13a/b(6.
- 14 ppm)와 교차 peak를 관찰 할 수 있었다. 이상의 분광학적 결과로 화합물 3은 4,8-O-diacetyl-10-hydroxy-2(3),11(13)-guaiadiene-12,6-olide로 동정 되었으며(Fig. 1C), 산국에서는 처음으로 보고되는 물질로 판명되었다.
- 13 ppm)와 교차 peak를 관찰 할 수 있었다. 이상의 분광학적 결과와 문헌자료를 비교하여 화합물 1은 4-methoxy-8-O-acetyl-10-hydroxy-2,11(13)-guaiadiene-12,6-olide로 동정 되었다(Fig. 1A). 이 화합물은 산국에서는 처음 보고되는 물질이었다.
- 따라서 화합물 2는 20개 탄소를 갖는 sesquiterpene lactone 골격에 4개의 탄소를 갖는 angeloyl기가 붙어있음을 알 수 있었다. 이상의 분광학적 분석 결과로부터 화합물 2는 8-O-(2-carbonyl-2-butyl)-3,10-dihydroxy-4,11(13)-guaiadiene-12,6-olide로 동정 되었으며, 지금까지 산국에서는 보고된 적이 없는 물질이었다(Fig. 1B).
- , 1995). 이에 따라 본 연구에서 FPTase의 저해제 탐색을 통해 산국의 항암활성에 대하여 알아본 결과, 3개의 화합물 모두에서 50% 이상의 FPTase 효소활성 저해 효과가 확인되었으며 화합물 3은 90%의 가장 높은 저해효과를 보였다. 화합물 3의 경우, 인체암 세포주에 대한 세포독성은 다른 sesquiterpene lactone 보다 낮게 나타나는 것으로 보아 α-methylene-γ-lactone ring을 함유하는 sesquiterpene lactone 계열 화합물들의 FPTase의 억제는 α-methylene-γ-lactone ring에 기인하는 직접적인 세포독성 보다는 치환체의 종류에 따라 서로 상이하다고 할 수 있겠다.
- 에서 3개의 카르보닐기(-CO)의 peak가 존재하고 있음을 알 수 있었다. 질량 스펙트럼에서는 분자이온 (M+) peak가 m/e＝364에서 관찰되었고, m/e=304 (M+-60) fragment와 m/e=244 (M+-120) fragment로부터 acetyl기가 2개 존재하고 있다는 정보를 얻을 수 있었다. 또한, m/e=226 (M+-138)의 fragment로부터 hydroxy기가 존재하고 있다는 사실을 알 수 있었다.
- 부근에서 C=C의 peak가 존재하고 있다는 것을 알았다. 질량 스펙트럼에서는 분자이온 (M+)의 peak가 m/e＝336에서 관찰되었고, m/e=276 (M+-60)의 fragment로부터 acetyl기, m/e=304 (M+-32)의 fragment로부터 methoxy기가 1개 존재하고 있다는 정보를 얻을 수 있었다.13C-NMR 스펙트럼에서는 탄소 수가 18개라는 것을 알 수 있었으며, 화학적 이동값 δ 169.
- 암세포주인 ACHN (kidney carcinoma), LOX-IMVI (melanoma), SW620 (colon adenocarcinoma), PC-3 (prostate adenocarcinoma), A549 (lung carcinoma)에 대하여 산국의 잎과 줄기에서 분리한 3종의 sesquiterpene lactone들의 세포독성 활성을 조사한 결과 Table 4에서 보는 바와 같이 모든 세포주에 대해서 독성이 나타났다. 특히 화합물 1은 대조군인 Adriamycin 보다는 높았지만 실험에 사용된 모든 세포주에 대해서 GI50 값이 3.57 ㎍/㎖ 이하로 비교적 강한 세포독성을 보였다.
- 화합물 1은 무색유상의 물질로서 적외선 스펙트럼에서 3500 cm-1에서 전형적인 알콜(-OH) 흡수띠와 1759cm-1부근의 2개의 카르보닐기(-CO), 1645 cm-1부근에서 C=C의 peak가 존재하고 있다는 것을 알았다. 질량 스펙트럼에서는 분자이온 (M+)의 peak가 m/e＝336에서 관찰되었고, m/e=276 (M+-60)의 fragment로부터 acetyl기, m/e=304 (M+-32)의 fragment로부터 methoxy기가 1개 존재하고 있다는 정보를 얻을 수 있었다.
- 화합물 2는 화합물 1과 마찬가지로 무색유상의 물질로서 적외선 스펙트럼으로부터 전형적인 알콜기(-OH), 2개의 카르보닐기(-CO), C=C의 peak가 존재하고 있음을 확인하였다. 질량 스펙트럼에서는 분자이온(M+)의 peak가 m/e=362에서 나타났고, m/e=344 (M+-18)에서hydroxy기, m/e=262 (M+-100)에서 angeloyl기의 특징적인 fragment 이온 peak가 각각 관찰되었다.
후속연구
- 화합물 3의 경우, 인체암 세포주에 대한 세포독성은 다른 sesquiterpene lactone 보다 낮게 나타나는 것으로 보아 α-methylene-γ-lactone ring을 함유하는 sesquiterpene lactone 계열 화합물들의 FPTase의 억제는 α-methylene-γ-lactone ring에 기인하는 직접적인 세포독성 보다는 치환체의 종류에 따라 서로 상이하다고 할 수 있겠다. 그러므로 구조-활성관계에서 치환체의 종류와 FPTase 저해활성과 어떤 연관성이 있을 것으로 판단되어 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 특히, 미세먼지가 대기환경 오염원으로 문제가 되고 상황에서 기관지염을 비롯한 호흡기 관련 질환을 예방하고 치료할 수 있는 소재로도 활용될 수 있을 것이다. 더불어, 꽃은 잎과 줄기에 비에 상대적으로 양이 적고 수확이 힘들기 때문에 산국의 잎과 줄기를 사용하면 소재의 확보가 훨씬 용이할 것으로 사료된다.
- 그러므로 apoptosis를 조절하는 화학물들이 천연물화학에서 분리하려는 중요한 목표화합물로 두각을 나타내고 있다. 본 실험에 사용된 3가지 화합물 중 화합물 1번과 3번은 20 ㎍/㎖의 농도에서 75% 이상의 강한 활성을 보였으며, 특히 화합물 3번은 세포독성은 낮은데 비해 FPTase 저해활성과 apoptosis 저해활성이 강하게 나타났으므로 향후 연구방향을 세포수준에서 진행할 수 있는 가능성을 제시함과 동시에 약리학적 활용가능성을 의미한다고 할 수 있을 것으로 사료된다.
- (2017; 2017a)이 산국의 잎과 줄기에서 분리하여 발표했던 sesquiterpene lactone과는 치환기의 종류와 위치가 다른 새로운 sesquiterpene lactone으로 밝혀졌다. 분리・동정된 3종의 화합물은 암이나 염증성 질환과 같은 질병치료제로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 현재까지 산국에 대한 연구의 대부분은 꽃을 재료로 이루어졌으며 잎을 비롯한 산국의 다른 부위에 대한 연구는 많이 진행되지 않은 상황이다. 산국의 잎과 줄기에 대하여 새로운 약리작용과 성분 화합물을 연구함으로써 산국의 활용방안을 다양하게 모색해 볼 수 있을 것이고, 식물자원의 이용이란 측면에서 산국의 꽃과 더불어 잎과 줄기를 모두 이용할 수 있다면 자원의 수급이 훨씬 용이해질 것이다. 따라서 본 연구에서는 예로부터 한방과 민간에서 호흡기 보호에 많이 사용하고 있는 산국의 잎과 줄기로부터 생리활성물질을 추적하면서 유효성분을 분리하였고 그 화학구조를 규명하여 보고하는 바이다.
- 이상의 연구 결과는 산국의 잎·줄기를 암이나 염증성질환에 효과가 있는 다양한 한약제제와 술, 차 등의 기능성 제품으로 개발하는데 기초 자료가 될 수 있을 것이다.
- 이상의 연구 결과는 산국의 잎·줄기를 암이나 염증성질환에 효과가 있는 다양한 한약제제와 술, 차 등의 기능성 제품으로 개발하는데 기초 자료가 될 수 있을 것이다. 특히, 미세먼지가 대기환경 오염원으로 문제가 되고 상황에서 기관지염을 비롯한 호흡기 관련 질환을 예방하고 치료할 수 있는 소재로도 활용될 수 있을 것이다. 더불어, 꽃은 잎과 줄기에 비에 상대적으로 양이 적고 수확이 힘들기 때문에 산국의 잎과 줄기를 사용하면 소재의 확보가 훨씬 용이할 것으로 사료된다.
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