[논문]구증구포 도라지 Ethyl Acetate 분획물의 예쁜 꼬마선충 내의 항산화 효과

권강무; 김준형; 양재헌; 기별희; 황인현; 김대근

doi:10.22889/kjp.2020.51.4.325

구증구포 도라지 Ethyl Acetate 분획물의 예쁜 꼬마선충 내의 항산화 효과
Antioxidant Activity of Ethyl Acetate Fraction of the Guzeunggupo-procossed Platycodon grandiflorum A. De Candolle Roots in Caenorhabditis elegans 원문보기

생약학회지, v.51 no.4, 2020년, pp.325 - 331

권강무 (우석대학교 약학과) , 김준형 (우석대학교 식품생명공학과) , 양재헌 (아이나라) , 기별희 (아이나라) , 황인현 (우석대학교 약학과) , 김대근 (우석대학교 약학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Through Caenorhabditis elegans model system, the antioxidant activity of methanol extract of the guzeunggupo-processed Platycodon grandiflorum A. De Candolle (Campanulaceae) roots was calculated. Between the methanol extracts of guzeunggupo-processed and non-processed P. grandiflorum roots, the processed P. grandiflorum root showed higher DPPH radical scavenging effect than the non-processed one. The ethyl acetate soluble fraction of the methanol extract of the guzeunggupo-processed P. grandiflorum showed the best DPPH radical scavenging activity. The ethyl acetate fraction of the processed sample was measured for the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase, and oxidative stress tolerance by using C. elegans along with reactive oxygen species level. In addition, to confirm the regulation of the stress response gene is responsible for the increased stress tolerance of C. elegans treated by the ethyl acetate fraction of the processed sample, SOD-3 expression was measured using a transgenic strain (CF1553). Consequently, the ethyl acetate fraction of the processed sample, increased SOD and catalase activities, and decreased ROS accumulation in a dose-dependent manner. Furthermore, the ethyl acetate fraction of the processed sample-treated CF1553 worm showed higher SOD-3::GFP intensity than the control worm.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extracts from P. grandiflorum and guzeunggupo-processed P. grandiflorum roots. P. g.: Platycodon grandiflorum, G-processed P. g.: guzeunggupo-processed Platycodon grandiflorum.
$Fig. 2. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from the guzeunggupo-processed P. grandiflorum roots.$ 그림 Fig. 2. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from the guzeunggupo-processed P. grandiflorum roots.
$Fig. 3. Effects of ethyl acetate fraction of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate⦁O2- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H2O2, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 3. Effects of ethyl acetate fraction of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate⦁O₂- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H₂O₂, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.
$Fig. 4. Effects of ethyl acetate fraction of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 4. Effects of ethyl acetate fraction of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.
$Fig. 5 Effects of ethyl acetate fractions of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by logrank test.$ 그림 Fig. 5 Effects of ethyl acetate fractions of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by logrank test.
$Table I. Effects of ethyl acetate fraction of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the oxidative stress tolerance of C. elegans$ 표 Table I. Effects of ethyl acetate fraction of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the oxidative stress tolerance of C. elegans
$Fig. 6 Effect of ethyl acetate fraction of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of ethyl acetate fraction. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 19 to 25 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and **p<0.01 by one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 6 Effect of ethyl acetate fraction of the guzenuggupo-processed P. grandiflorum roots on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of ethyl acetate fraction. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 19 to 25 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and **p<0.01 by one-way ANOVA.

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

본 연구는 구증구포 도라지 methanol 추출물을 용매로 계통분획하여 각 분획물에 대해 vitamin C를 대조군으로 하여 DPPH free radical 소거능 실험을 하여 가장 강한 소거능을 보인 ethyl acetate 분획물을 확보한 후 이 분획에 대하여 항노화 실험모델로 잘 알려진 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 산화적 스트레스에 대한 저항 효능을 확인하였다. 더불어 산화적 스트레스에 저항할 수 있는 단백질의 증가 여부를 확인하기 위하여 형질전환 mutant를 이용한 유전자 발현 증가 여부 실험을 통하여 몇가지 결과를 얻었기에 이를 보고하고자 한다.

제안 방법

본 실험에 사용한 도라지는 시중에서 구입하여 우석대학교 김대근 교수가 검증한 후에 음건세절하여 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WS-20-003). 구증구포한 도라지는 국산 생도라지를 2시간 증숙하고 10시간 건조기로 건조하는 과정을 각각 9번 시행하여 실험에 사용하였다.
그 추출액을 수욕상에서 감압농축하여 도라지 methanol 엑스 약 10 g과 구증구포 도라지 methanol 엑스약 28 g을 각각 얻었다. 도라지 methanol 엑스에 증류수로 현탁시키고 동량의 methylene chloride(0.5 g), ethyl acetate (0.3 g) 및 n-butanol(0.6 g)의 순으로 용매 분획하였으며, 구증구포 도라지 methanol 엑스를 증류수로 현탁시켜 methylene chloride(0.6 g), ethyl acetate(0.5 g) 및 n-butanol (1.4 g) 분획물을 얻었다.
도라지와 구증구포한 도라지 시료 각 50 g을 methanol로 진탕하면서 3시간씩 50°C에서 각각 2회 추출하였다
본 연구는 구증구포 도라지 methanol 추출물을 용매로 계통분획하여 각 분획물에 대해 vitamin C를 대조군으로 하여 DPPH free radical 소거능 실험을 하여 가장 강한 소거능을 보인 ethyl acetate 분획물을 확보한 후 이 분획에 대하여 항노화 실험모델로 잘 알려진 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용한 산화적 스트레스에 대한 저항 효능을 확인하였다. 더불어 산화적 스트레스에 저항할 수 있는 단백질의 증가 여부를 확인하기 위하여 형질전환 mutant를 이용한 유전자 발현 증가 여부 실험을 통하여 몇가지 결과를 얻었기에 이를 보고하고자 한다.
성장 단계가 동일한 선충을 각각의 농도별 plate에서 배양하였다(EDZ 250, 500μg/mL). 산화적 스트레스에 의한 내성은 기존 방법을 약간 변형하여 평가하였으며, 성체가 된 후 7일째에 일시적으로 선충을 1 mM juglone이 함유된 M9 buffer가 담긴 96 well plate의 well에 옮기고 시간 별로 생존율을 확인하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 도라지는 시중에서 구입하여 우석대학교 김대근 교수가 검증한 후에 음건세절하여 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WS-20-003). 구증구포한 도라지는 국산 생도라지를 2시간 증숙하고 10시간 건조기로 건조하는 과정을 각각 9번 시행하여 실험에 사용하였다.

데이터처리

그룹간의 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도는 Log-rank test 분석 방법을 이용하였다
통계 자료의 값은 평균값 ± 표준오차(mean ± S.E.M.)로 표시하였다

이론/모형

5). SOD 활성은 Ibrahim등의 방법을 응용하여 측정하였다. 먼저 10 mM phosphate buffer(pH 8.

성능/효과

구증구포 도라지 methanol 추출물 분획물의 DPPH radical 소거활성 실험에서, ethyl acetate 분획은 가장 강한 활성을 보여 주었다. Ethyl acetate 분획은 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것으로 확인되었으며, juglone 처리한 산화적 스트레스조건하에서는 선충 세포 내 활성산소종의 강한 축적 억제 효능을 나타내었다. 또한, 구증구포 도라지 ethyl acetate 분획물 처리를 한 선충의 스트레스 저항능력에 미치는 영향을 확인하는 실험에서는 Juglone 처리의 산화적 스트레스 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 크게 증가하는 것이 확인되었다.
구증구포 도라지 ethyl acetate 분획은 DPPH free radical 소거활성을 보여주었으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 항산화 실험에서는 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 산화적 스트레스 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다.
구증구포 도라지 methanol 추출물 분획물의 DPPH radical 소거활성 실험에서, ethyl acetate 분획은 가장 강한 활성을 보여 주었다. Ethyl acetate 분획은 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것으로 확인되었으며, juglone 처리한 산화적 스트레스조건하에서는 선충 세포 내 활성산소종의 강한 축적 억제 효능을 나타내었다.
Ethyl acetate 분획은 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것으로 확인되었으며, juglone 처리한 산화적 스트레스조건하에서는 선충 세포 내 활성산소종의 강한 축적 억제 효능을 나타내었다. 또한, 구증구포 도라지 ethyl acetate 분획물 처리를 한 선충의 스트레스 저항능력에 미치는 영향을 확인하는 실험에서는 Juglone 처리의 산화적 스트레스 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 크게 증가하는 것이 확인되었다. 이와 관련하여, mutant(GFP-fused transgenic strain CF1553)를 이용하여 산화적 스트레스 저항성 단백질 발현 여부를 확인하는 실험에서 SOD-3::GFP 발현량의 증가를 확인하는 형광이 상당히 증가함이 확인되어 산화적 스트레스에 저항할 수 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인되었다.
구증구포 도라지 ethyl acetate 분획은 DPPH free radical 소거활성을 보여주었으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 항산화 실험에서는 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 산화적 스트레스 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 저항성 단백질 발현 실험에서는 산화적 스트레스에 저항성이 있는 형광을 띤 단백질 발현이 증가되었음을 확인하였다.
선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 산화적 스트레스 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 저항성 단백질 발현 실험에서는 산화적 스트레스에 저항성이 있는 형광을 띤 단백질 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 구증구포 도라지 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 있을 것으로 사료된다.
또한, 구증구포 도라지 ethyl acetate 분획물 처리를 한 선충의 스트레스 저항능력에 미치는 영향을 확인하는 실험에서는 Juglone 처리의 산화적 스트레스 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 크게 증가하는 것이 확인되었다. 이와 관련하여, mutant(GFP-fused transgenic strain CF1553)를 이용하여 산화적 스트레스 저항성 단백질 발현 여부를 확인하는 실험에서 SOD-3::GFP 발현량의 증가를 확인하는 형광이 상당히 증가함이 확인되어 산화적 스트레스에 저항할 수 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인되었다.

후속연구

이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 저항성 단백질 발현 실험에서는 산화적 스트레스에 저항성이 있는 형광을 띤 단백질 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 구증구포 도라지 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 있을 것으로 사료된다.

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표제어: PCR

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용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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