[논문]저염도에서 생육가능한 미생물 probiotics가 저염분 양식의 흰다리새우(Litopenaeus vannamei)의 성장 및 면역능에 미치는 영향

배준성; 이채원; 양찬영; 정은하; 김은진; 박관하

doi:10.7847/jfp.2020.33.2.145

저염도에서 생육가능한 미생물 probiotics가 저염분 양식의 흰다리새우(Litopenaeus vannamei)의 성장 및 면역능에 미치는 영향
Effect of low salinity probiotics on the growth and non-specific immunity of whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei cultured under low salinity conditions 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.33 no.2, 2020년, pp.145 - 151

배준성 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과) , 이채원 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과) , 양찬영 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과) , 정은하 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과) , 김은진 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과) , 박관하 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과)

초록
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흰다리새우는 광범위한 염도(1-40 psu)에서 생존 가능하다. 하지만 염도의 변화, 특히 낮은 염도(1-5 psu)는 생존율, 비특이적 면역능 및 항병능과 같은 다양한 생리적 변화에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구에서는 73일 동안 경구 투여 및 사육수 첨가를 동시에 수행한 뒤 성장, 비특이적 면역 및 질병 저항성을 측정하였다. 사육수의 염도는 주기적으로 소금을 첨가하여 3 psu를 유지하였다. 그 결과 73일간 사육 후 생존율이 크게 증가하였으며 (5.6 vs. 15.4%), reactive oxygen species (ROS) 생산과 phenol oxidase (PO) 활성의 유의성있는 증가가 확인되었다. 대조적으로 superoxide dismutase (SOD) 활성은 영향을 받지 않았다. 새우에서 Vibrio alginolyticus의 인위 감염 시험의 결과, 프로바이오틱스 처치구에서 약간의 폐사 감소가 관찰되었다(100 vs. 79%). 결과적으로 저염도(3 psu)에서 양식된 흰다리새우의 생산은 저염도에서 생존가능한 프로바이오틱스에 의해 증가 될 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei can survive in a wide range of salinity (1-40 psu). However, such variation, particularly at low salinity (1-5 psu), can affect various physiological changes such as survival rates, non-specific immunity and disease resistance. In this study, growth, non-specific immunity and disease resistance were measured following simultaneous oral feeding and addition of probiotic microbes into culture water for 73 day period. The salinity of the culture water was maintained at 3 psu by periodical salt additions. The result shows that survival rate increased significantly (5.6 vs. 15.4%) after 73 day rearing. Significant increases were identified in reactive oxygen species (ROS) production and phenol oxidase (PO) activity. However, superoxide dismutase (SOD) activity was not influenced. When the shrimp was artificially challenged with Vibrio alginolyticus, slight mortality reduction was observed in the probiotics-treated group (100 vs. 79%). In conclusion, the production of cultured whiteleg shrimp at low salinity might be increased by probiotics survivable at low salinity levels.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Composition of probiotics used for water addition (A) and oral feeding (B)
그림 Fig. 1. Effects of probiotics on culture water quality (A) temperature; (B) Ammonia; (C) Nitrite; ↓ (D) Nitrate; water additives of probiotics.
표 Table 2. Effects of probiotics at growth parameters
그림 Fig. 2. Litopenaeus vannamei non-specific immune response (n=8). Data were expressed as mean±S.D. *Statistical significant (P<0.05).
그림 Fig. 3. Cumulative mortality in Litopenaeus vannamei infected with Vibrio alginolyticus (n=29 in each group).

AI 본문요약
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문제 정의

, 2012). 따라서 본 연구는 수질 관리, 면역증강이 요구되는 저염분 조건 (3 psu)에서사육 중인 흰다리새우에 수질개선 및 사료첨가용 probiotics를 투여 한 후 수질, 성장, 생존율 및 비특이적 면역능을 평가하였다.

제안 방법

0 psu 범위를 유지하였다. 30 psu에서 사육된 흰다리새우(방양시 체중 0.017-0.018 g)를 5일간 순치 과정을 거쳐 3.0 psu로순치시킨 후 m³당 51마리로 73일간 사육하였다. 시험기간 중 사육수의 교환은 최소로 하여 총 3회 각각 사육수의 20%에 해당하는 양을 환수하였다.
획득한 세균 집락을 BHI에 접종하여 shaking incubator (Vision, Korea) 에서 48시간(100 rpm, 25℃)동안 배양하였다. 4℃ 에서 3, 000 rpm으로 10분간 원심분리하여 집균하고 0.83% (w/v) 멸균 생리식염수를 이용하여 4.3× 106 CFU/mL으로 조제하여 0.1 mL씩 등 2번째 마디에 투여(4.3×10⁵CFU/shrimp)하였다. 항병력 측정 기간 동안 새우는 FRP수조(수량 300 L, 수온 28℃) 에 유지한 후 14일간 누적폐사율을 측정하였다.
THC는 일회용 혈구계수기(Incyto, GA, USA)를사용하여 측정하였다. PO 활성능은 Hernández-López et al.
4] 800 ㎕ 첨가 후 얼음 속에서 teflon homogenizer로 마쇄하였다. 마쇄액은 10, 000×g 4℃에서 60분간 원심분리 한 뒤 상층액을 상업용 kit (SOD assay kit-WST, Dojindo, Kumamoto, Japan)로 분석하였다. 항병력의 측정을 위하여 동결 보존(-70℃)되어있는 Vibrio alginolyticus ATCC 17749 균주를 BHIA에 도말한 뒤 25℃에서 24시간 동안 배양하여 단일 집락을 획득하였다.
하지만 염도의 변화, 특히 낮은 염도 (1-5 psu)는 생존율, 비특이적 면역능 및 항 병 능과 같은 다양한 생리적 변화에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구에서는 73일 동안 경구 투여 및 사육수 첨가를 동시에 수행한 뒤 성장, 비특이적 면역 및 질병 저항성을 측정하였다. 사육수의 염도는 주기적으로 소금을 첨가하여 3 psu를 유지하였다.
수행하였다. 사육수조(약 100 m³)는 수차를 이용하여 충분한 산소공급을 하였고 인위적인 수온조절은 하지 않았으며 염분은 식염을 일정량씩 정기적으로 투입하여 3.0±1.0 psu 범위를 유지하였다. 30 psu에서 사육된 흰다리새우(방양시 체중 0.
하지만 probiotics 제제를 사용한 시험군에서 대조군과 비교하여 질소 노폐물들의 값이 상대적으로 낮고 변화의 폭이 적어 다소 조절이 가능함을 시사하고 있다. 생존율 측정시 지수식 양식의 특성상 일별 폐사율은 측정하지 못하였으나 시험 종료시에 사육 수를 전부 제거하여 최종적인 생존율을 측정하였다. 대조군과 시험군 모두 낮은 생존율을 나타내었으며 특히 대조군에서 생존율이 현저히 낮았다 (대조군 5.
성장은 종료시점에 무작위로 일부 채취한 흰다리새우로 최종무게(final weight, g)와 단위면적당 생산량(harvest weight, g/m³)을 측정한 뒤 시험 개시시점과 종료시점의 체중 차이로부터 증체량 (weight gain, g/shrimp)과 일일성장률(SGR; specific growth rate, %/day = log_e(final weight) - loge(initial weight)/days × 100)를 계산하여 평가하였다.
수질 측정에서 용존산소와 수온은 다목적 수질 측정기(556MPS, YSI, Ohio, USA)로 측정하였으며, 암모니아(NH3), 아질산(NO₂^-) 및 질산이온(NO₃^-)은각각 Hanna Instruments (Woonsocket, USA)의 ammonia low range portable photometer (HI96700), nitrite photometer (HI96707) 및 nitrate photometer (HI96786)로 측정하였다.
시험에 사용된 probiotics는 수질개선제(수중 살포)와 사료첨가제(사료 흡착)의 형태로 동시에 투입되었다(Table 1). 수질개선제는 사육수 1 톤당 1 g의 비율로 매주 1회 사육수에 직접 가하였고, 사료 첨가제는 배합사료(명품S, Purina, Korea) kg당 0.1 g을 흡착하였으며 체중의 3%를 급이하였다. 총 73일간의 시험기간 중 연속적으로 probiotics를 공급하였고 급이량은 14일 마다 무작위로 20마리를 채취하여 체중을 측정하여 생산량을 측 산하면서 조절하였다.
시험 종료 후 total hemocyte (THC), respiratory burst activity (ROS) 및 phenol oxidase (PO)를 측정하기 위해 Chen et al. (2011) 방법을 일부 변형하여 혈 림프를 채취하였다. 즉, 살아있는 흰다리새우를 얼음으로 마취한 뒤 항응고제(10 mM EDTA Na2, 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM HEPES, 850 nM Glucose, pH 7.
(2011) 방법을 일부 변형하여 혈 림프를 채취하였다. 즉, 살아있는 흰다리새우를 얼음으로 마취한 뒤 항응고제(10 mM EDTA Na2, 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM HEPES, 850 nM Glucose, pH 7.3, Gollas-Gal.,án et al., 1997)를사용하여 혈림프를 채취하고, 혈림프 채취 후 superoxide dismutase (SOD) 측정을 위해 간췌장을 채취하였다.
1 g을 흡착하였으며 체중의 3%를 급이하였다. 총 73일간의 시험기간 중 연속적으로 probiotics를 공급하였고 급이량은 14일 마다 무작위로 20마리를 채취하여 체중을 측정하여 생산량을 측 산하면서 조절하였다.
3×10⁵CFU/shrimp)하였다. 항병력 측정 기간 동안 새우는 FRP수조(수량 300 L, 수온 28℃) 에 유지한 후 14일간 누적폐사율을 측정하였다. 시험은 단회 수행되었으며 대조군과 시험군 각각 29 마리로 수행하였다.
마쇄액은 10, 000×g 4℃에서 60분간 원심분리 한 뒤 상층액을 상업용 kit (SOD assay kit-WST, Dojindo, Kumamoto, Japan)로 분석하였다. 항병력의 측정을 위하여 동결 보존(-70℃)되어있는 Vibrio alginolyticus ATCC 17749 균주를 BHIA에 도말한 뒤 25℃에서 24시간 동안 배양하여 단일 집락을 획득하였다. 획득한 세균 집락을 BHI에 접종하여 shaking incubator (Vision, Korea) 에서 48시간(100 rpm, 25℃)동안 배양하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 시약 중 구입처가 따로 기술된 것들 이외의 것은 모두 Sigma (Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
시험기간 중 사육수의 교환은 최소로 하여 총 3회 각각 사육수의 20%에 해당하는 양을 환수하였다. 시험에 사용된 probiotics는 수질개선제(수중 살포)와 사료첨가제(사료 흡착)의 형태로 동시에 투입되었다(Table 1). 수질개선제는 사육수 1 톤당 1 g의 비율로 매주 1회 사육수에 직접 가하였고, 사료 첨가제는 배합사료(명품S, Purina, Korea) kg당 0.
항병력 측정 기간 동안 새우는 FRP수조(수량 300 L, 수온 28℃) 에 유지한 후 14일간 누적폐사율을 측정하였다. 시험은 단회 수행되었으며 대조군과 시험군 각각 29 마리로 수행하였다.

데이터처리

통계처리를 위해 GraphPad Prism program ver 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하였으며 Student’s t-test 검정을 하여 P 값이 0.05 이하 일 때 유의성이 있다고 판정하였다.

이론/모형

L-dihydrox-yphenylalanine을 (3 mg/mL CAC buffer) 50 ㎕ 첨가한 뒤 25℃에서 10분간 반응시켜 microplate reader (Tecan Sunrise, Salzburg, Austria)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ROS는 Song and Hsieh (1994) 의 방법에 따라 nitoblue tetrazolium (NBT) 환원 능으로 측정하였다. 96-well의 평바닥 plate에 혈림프 100 ㎕와 poly-L-lysine (2 mg/mL) 50 ㎕를 분주하였다.

성능/효과

비특이적 면역력 측정 결과 SOD를 제외하고 THC, ROS, PO 모두 probiotics 첨가로 인해 증가하였다. V. alginolyticus 항병력 측정시 14일 이내 폐사가 나타났기 때문에 이 결과는 V. alginolyticus의 감염에 따른 의한 폐사로 판단하였으며 시험군에서 약 20%의 폐사 저감효과를 나타내었다. 그러나 초기에는 시험군에서 폐사하는 새우가 대조군 보다 더 많아 2일 만에 50%의 폐사가 발생하였고 대조군에서는 4일 만에 50% 폐사가 발생하였다.
79%). 결과적으로 저염도(3 psu)에서 양식된 흰다리새우의 생산은 저염도에서 생존 가능한 프로바이오틱스에 의해 증가 될 수 있을 것이다.
사육수의 염도는 주기적으로 소금을 첨가하여 3 psu를 유지하였다. 그 결과 73일간 사육 후 생존율이 크게 증가하였으며 (5.6 vs. 15.4%), reactive oxygen species (ROS) 생산과 phenol oxidase (PO) 활성의 유의성있는 증가가 확인되었다. 대조적으로 superoxide dismutase (SOD) 활성은 영향을 받지 않았다.
4 %/day로 대조군에서 더 높은 성장을 나타냈다. 그러나 생존율은 각각 5.6 및 15.4%로 시험군에서 약 3배 가까이 증가하여 수확량 또한 현저히 증가하였다(55.64 vs. 132.98 g/m³).
생존율 측정시 지수식 양식의 특성상 일별 폐사율은 측정하지 못하였으나 시험 종료시에 사육 수를 전부 제거하여 최종적인 생존율을 측정하였다. 대조군과 시험군 모두 낮은 생존율을 나타내었으며 특히 대조군에서 생존율이 현저히 낮았다 (대조군 5.6%, 시험군 15.4%). 반면 증체량은 probiotics를 투여하지 않은 대조군에서 더 높이 나타났는데 이는 시험군에 비교하여 대조군에서 현저히 낮은 생존율을 나타냈고 적응하여 살아남은 소수의 개체들이 빠르게 성장한 것으로 추정된다.
Table 2에 나타내었다. 대조군과 시험군의 증체량은 각각 19.86과 17.25 g/shrimp으로 측정되었으며 일일성장률은 각각 9.6과 9.4 %/day로 대조군에서 더 높은 성장을 나타냈다. 그러나 생존율은 각각 5.
3). 대조군은 6일 이후 전량 폐사하였지만 시험 군은 시험종료 14일 경과 후 약 21%가 생존하여 미약하지만 폐사 저감 효과가 확인되었다(100 vs. 79%).
(2000)은 사육 수의 교환이 다른 두 새우 양식장을 비교하여 수질 관리에서 사육수 교환의 중요성을 보고하였다. 본연구에서 시험기간 내 대조군과 시험군 모두 질소 노폐물의 변화가 심하였는데 특히 여름 장마 기간에 온도 변화와 함께 심한 변동이 나타났다. 하지만 probiotics 제제를 사용한 시험군에서 대조군과 비교하여 질소 노폐물들의 값이 상대적으로 낮고 변화의 폭이 적어 다소 조절이 가능함을 시사하고 있다.
비특이적 면역능 측정 결과 THC, ROS 및 PO는 유의미하게 증가하였으나 SOD에는 영향이 나타나지 않았다(Fig. 2). 시험 종료 후 수행된 V.
반면 증체량은 probiotics를 투여하지 않은 대조군에서 더 높이 나타났는데 이는 시험군에 비교하여 대조군에서 현저히 낮은 생존율을 나타냈고 적응하여 살아남은 소수의 개체들이 빠르게 성장한 것으로 추정된다. 비특이적 면역력 측정 결과 SOD를 제외하고 THC, ROS, PO 모두 probiotics 첨가로 인해 증가하였다. V.
대조적으로 superoxide dismutase (SOD) 활성은 영향을 받지 않았다. 새우에서 Vibrio alginolyticus의 인위 감염 시험의 결과, 프로바이오틱스 처치구에서 약간의 폐사 감소가 관찰되었다 (100 vs. 79%). 결과적으로 저염도(3 psu)에서 양식된 흰다리새우의 생산은 저염도에서 생존 가능한 프로바이오틱스에 의해 증가 될 수 있을 것이다.
2). 시험 종료 후 수행된 V. alginolyticus에 대한 항병원성 효과에서 V. alginolyticus 투여 후 7일 이내 대량 폐사가 관찰되었다(Fig. 3). 대조군은 6일 이후 전량 폐사하였지만 시험 군은 시험종료 14일 경과 후 약 21%가 생존하여 미약하지만 폐사 저감 효과가 확인되었다(100 vs.
1에서 보여주고 있다. 즉, 암모니아, 아질산 및 질산이온 모두 대조군이 시험 군보다 높은 경향을 나타났으며 시험기간 동안 3 번의 증감 패턴을 보였다. 특히 장마기간이였던 2018년의 7월, 시험 30-40일에서 급격한 수온 변화와 함께 큰 수질의 변화가 나타났다.

후속연구

이에 대한 이유가 무엇인지는 현재의 결과로는 설명되지 못하여 추가적인 연구가 필요한 것으로 판단된다. 결론적으로 흰다리새우는 광염성으로 내륙에서 저염분으로 양식이 가능하지만 저염분의 사육은 수질 관리와 면역관리등의 유지가 요구되며 이는 probiotics 제제를 통하여 보완이 가능할 것으로 사료된다. 특히 수질관리가 어려운 양식장에서는 probiotics를 수질개선제와 경구투여제의 복합 적용이 필요할 것으로 판단되며 이로 인해 생산량이 향상될 수 있을 것이다.
그러나 초기에는 시험군에서 폐사하는 새우가 대조군 보다 더 많아 2일 만에 50%의 폐사가 발생하였고 대조군에서는 4일 만에 50% 폐사가 발생하였다. 이에 대한 이유가 무엇인지는 현재의 결과로는 설명되지 못하여 추가적인 연구가 필요한 것으로 판단된다. 결론적으로 흰다리새우는 광염성으로 내륙에서 저염분으로 양식이 가능하지만 저염분의 사육은 수질 관리와 면역관리등의 유지가 요구되며 이는 probiotics 제제를 통하여 보완이 가능할 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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