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제안 방법
- 이 중에서 MiSeq 장비의 경우, 가장 보편적으로 사용되며, Illumina 장비 중에서 가장 긴 염기서열(300 bp)을 분석할 수 있는 장비이기 때문에 미생물 유전체 연구에서 저렴한 가격으로 draft genome을 분석하기 용이하다. Illumina 장비를 사용하기 위해 각 장비에서 사용할 수 있는 일정한 크기의 DNA 파편에 adapter를 붙여 library를 제작하고, flow cell에 각 DNA 파편이 adapter에 의해 고정되고, library DNA를 증폭시켜 cluster를 만든다. 각 library cluster로부터 DNA 염기서열을 빛 에너지를 이용하여 빠르게 분석하게 된다(Ravi et al, 2018).
- 이 방법의 경우, 모든 DNA로부터 NGS library를 제작하고 염기서열을 분석하여 특정 유전자의 분포나 어떠한 기능의 유전자를 갖는 미생물이 존재하는지 확인이 가능하기 때문에 앞서 16S rRNA amplicon을 기반으로 한 기능 분석 프로그램(PICRUSt, Tax4Fun 등)보다 더욱 정확한 결과를 얻을 수 있다. 따라서 Shotgun Metagenomic Sequencing 분석을 위해 시료의 total DNA를 추출한 후 사용하고자 하는 NGS 분석 장비에 맞게 일정한 크기로 분쇄(shearing)하고 library를 제작하여 NGS 분석을 수행한다. 이렇게 얻어진 염기서열 정보로부터 contig를 assembly하여 해당 군집이 갖는 유전자를 분석할 수 있으며, 특정 기능을 나타내는 유전자들의 분포가 확인이 가능하고 해상도 높은 군체의 구성을 분석할 수 있다.
- Ion Torrent의 경우, 다른 장비들과 다르게 광학에 의한 탐지를 이용하지 않는 최초의 NGS 장비이다. 염기서열 분석 신호 발생을 위해 형광물질을 사용하는 대신, 각 dNTP가 끼어들 때 발생하는 H+이온을 탐지하여 결과적으로 pH의 변화가 발생하고, 이를 염기서열 정보로 변환하는 방법으로 분석한다(Pen nisi et al, 2010). 하지만 pH의 변화는 결합하는 염기 수에 정비례하지 않기 때문에 homopolymer (단일중합체)를 포함하는 염기서열을 분석함에 있어 정확성이 떨어지는 단점을 갖고 있다.
- 유전체 분석을 위해 유전자가 될 수 있는 ORF(Open reading frame)를 얻어진 DNA 염기서열로부터 탐색하고, 각 ORF에 대하여 단백질 정보 데이터베이스 (BLAST, PANTHER, UniProt, Pfam 등)로부터 그 기능을 예측하여 정보를 확보할 수 있다. 이러한 미생물의 유전정보를 바탕으로 Pan-genome 분석, ANI (Average Nucleotide Identity) 분석 등과 같은 비교 유전체 분석이나 대사회로분석, 네트워크분석 등을 통해 한가지의 미생물뿐만 아니라, 여러 미생물들과의 관계와 생물학적 계통 분석에 활용할 수 있다.
- 이렇게 얻어진 염기서열 정보는 유전체 정보를 바탕으로 mapping이 이루어지게 되고, 발현량 비교분석을 위해 normalization을 수행하게 된다. 이때 RPKM, TMM, EDAseq, CQN 등의 알고리즘을 활용하며, edgeR, baySeq, DESeq 등의 통계학적 모델링에 의하여 조건에 따른 유전자 발현량을 분석한다. NGS를 활용하여 하나의 미생물의 발현량뿐만 아니라, 특정 환경에서의 미생물 군체의 발현량 변화를 분석할 수 있는데, 이를 Meta-transcriptome (whole transcriptome shotgun sequencing)이라 일컫는다.
- 나타낸다. 특정 환경 속에 존재하는 미생물의 균주 조성을 확인하기 위해서 모든 미생물이 공통적으로 갖는 유전자인 16S rRNA의 염기서열을 증폭시켜 각각의 염기서열을 NGS를 사용하여 분석한다(16S rRNA amplicon sequencing). 16S rRNA는 미생물마다 다른 부분(variable region)과 다양한 미생물과 높은 유사성을 갖는 부분(conserved region)으로 구성되어 있는데, variable region을 증폭하여 염기서열을 분석할 경우, 주어진 환경에 존재하는 미생물들을 16S rRNA database(SILVA, Greengenes, EzBioCloud, RDP, NCBI 등)를 토대로 동정할 수 있으며, 확보된 염기서열의 개수로부터 그 비율을 예측할 수 있다(그림 3).
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