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문제 정의
- 이때 F510/F580의 상대적인 비율을 구함으로써 GSH 양의 변화를 측정한다. 본 연구에서는 F510/F580 비율을 이용하여 세포 내 GSH의 평균값 (Glutathione mean, GM)과 세포간 GSH의 분포양상(Glutathione heterogeneity, GH)을 측정할 수 있는 분석 방법을 개발했다. GMe F510/F580 비율의 평균값을 계산하여 측정할 수 있으며, GH는 F510/F580 비율값의 표준편차를 평균에 대한 백분율로 계산하여 얻을 수 있다.
제안 방법
- 그런 다음, 15μM MitoFreSHtracer로 1시간 동안 37oC에서 염색했다. 1시간 후 MitoFreSHtracer를 제거하고, HBSS 100μL를 넣은 채로 operetta high-content imaging system (HH12000000, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 510nm와 580 nm에서의 형광 intensity를 측정하였다. 추출물을 처리하지 않은 대조군의 GM, GH값을 기준으로 추출물에 의해 달라진 GM, GH값을 비교하여 GSH 회복능을 확인하였다.
- 이 세포를 96 well optically clear bottom plate (6055300, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에 3×104 cells/mL로 100μL씩 분주하고 24시간 동안 10% fetal bovine serum (16000044, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)+1% penicillin-streptomycin (15140122, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 든 Minimum Essential Medium α (12561056, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 조건에서 배양한 후 토마토 추출물을 첨가한 배지를 농도별(5, 10, 20μg/mL)로 제조한 후 세포에 처리하고 24 시간동안 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, LB 003-02, WELGENE, Gyeongsan, Korea)로 2회 세척하여 남아있는 성분을 최대한 제거했다. 그런 다음, 15μM MitoFreSHtracer로 1시간 동안 37oC에서 염색했다.
- GSH 회복능 측정은 미토콘드리아 내의 GSH와 반응하는 MitoFreSHtracer probe (M-377, Cell2in, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다[6]. 사용된 세포는 인간의 탯줄 유래 중간엽줄기세포(Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, hUC-MSC) passage number 15로, 분열과 성장이 더딘 노화 상태의 세포이다.
- 기기 및 시약 Column chromatography용 silica gele silica gel 60 (63-200 μm) (Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였고, thin layer chromatography (이하 TLC라고 함)는 silica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. NMRe 400 MHz FT-NMR spectrometer (Varian Inova AS 400, Varian, Palo Alto, CA, USA)로 측정하였고, infrarad (IR) spectrume Perkin model 599B (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) 로측정하였다. UV는 Spectroline (Model ENF-240 C/F, Spectronics Corporation, Westbury, NY, USA)을 사용하였으며, 융점은 Fisher-Johns 융점측정기(Fisher Scientific, Miami, FL, USA)를사용하여 측정하였고, 미보정하였다.
- 각 층을 감압농축하여 EtOAc (TME, 120g), n-BuOH (TMB, 245g) 및 H2O (TMW, 545g) 분획을 얻었다. TME 분획(120g)에 대하여 silica gel (SiO2) column chromatography (CC) (ϕ5×22cm, n-hexane-EtOAc=10:1→5:1→3:1→1:1→ CHCl3:MeOH=10:1→7:1→5:1→3:1→2:1→1:1)를 실시하여 20개의 분획물 (TME-1~TME-21)을 얻었다. 이 중에서 TME-10 (1.
- TME층으로부터 SiO2 CC (ϕ5×22cm, n-hexane-EtOAc 10:1→5:1→3:1→1:1→CHCl3:MeOH=10:1→7:1→5:1→ 3:1→2:1→1:1)를 실시하여 21개의 분획물(TME-1~TME-21)을 얻어 상기 실험방법과 동일하게 GSH 회복능을 평가하였다. 먼저, TME-7, TME-12, TME-13, TME-14-1, TME-14-2, TME-15, TME-16, TME-17-2, TME-18, TME-19, TME-20, TME-21 그룹에서는 어떠한 처리농도에서도 추출물을 처리하지 않은 대조군 대비 유의적인 변화가 나타나지 않았다(Fig.
- NMRe 400 MHz FT-NMR spectrometer (Varian Inova AS 400, Varian, Palo Alto, CA, USA)로 측정하였고, infrarad (IR) spectrume Perkin model 599B (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) 로측정하였다. UV는 Spectroline (Model ENF-240 C/F, Spectronics Corporation, Westbury, NY, USA)을 사용하였으며, 융점은 Fisher-Johns 융점측정기(Fisher Scientific, Miami, FL, USA)를사용하여 측정하였고, 미보정하였다.
- 얻어진 여액을 45oC에서 감압농축하고, 이 농축물을 물과 ethyl acetate로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-butanol로 분배 추출 하였다. 각 층을 감압농축하여 EtOAc (TME, 120g), n-BuOH (TMB, 245g) 및 H2O (TMW, 545g) 분획을 얻었다. TME 분획(120g)에 대하여 silica gel (SiO2) column chromatography (CC) (ϕ5×22cm, n-hexane-EtOAc=10:1→5:1→3:1→1:1→ CHCl3:MeOH=10:1→7:1→5:1→3:1→2:1→1:1)를 실시하여 20개의 분획물 (TME-1~TME-21)을 얻었다.
- 표품은 경희대학교 피부 생명공학센터 천연물화학 실험실(KHU-1906)에 보관되어 있다. 기기 및 시약 Column chromatography용 silica gele silica gel 60 (63-200 μm) (Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였고, thin layer chromatography (이하 TLC라고 함)는 silica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. NMRe 400 MHz FT-NMR spectrometer (Varian Inova AS 400, Varian, Palo Alto, CA, USA)로 측정하였고, infrarad (IR) spectrume Perkin model 599B (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) 로측정하였다.
- 또한, 이 방법을 이용하여 항산화 기능을 가지는 물질의 효능 평가에도 활용할 수 있다. 따라서 항산화 기능을 가진다고 잘 알려진 토마토에서 얻어진 추출물과 분획물에 대해 GSH 항산화 효과를 확인하였고, 그 주요성분을 분리 동정하였다.
- 4 Hz, H-5') 를 통해 1, 2, 4-trisubstituted benzene 구조가 존재함을 예상하였다. 또한 2개의 olefin methine proton signal 6.54 (1H, d, J=1.6 Hz, H-8), 6.30 (1H, d, J=1.6 Hz, H-6)을 통해 1, 2, 3, 5-tetrasubstituted benzene 구조가 존재함을 예상하였다. 이를 통해 이 화합물이 flavonol 화합물임을 예상하였다.
- 95)을 확인하였다. 위의 data 를 문헌값[9, 10]과 비교하여 화합물 1을 3', 4', 5, 7-tetrahydroxyflavonol, quercetin 으로 구조 동정 하였다. Quercetin 은 다양한 문헌에서 항산화 활성, 항염 활성, 미백 활성[18] 등이 보고되어 있다.
- 사용된 세포는 인간의 탯줄 유래 중간엽줄기세포(Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, hUC-MSC) passage number 15로, 분열과 성장이 더딘 노화 상태의 세포이다. 이 세포를 96 well optically clear bottom plate (6055300, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에 3×104 cells/mL로 100μL씩 분주하고 24시간 동안 10% fetal bovine serum (16000044, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)+1% penicillin-streptomycin (15140122, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 든 Minimum Essential Medium α (12561056, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 조건에서 배양한 후 토마토 추출물을 첨가한 배지를 농도별(5, 10, 20μg/mL)로 제조한 후 세포에 처리하고 24 시간동안 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, LB 003-02, WELGENE, Gyeongsan, Korea)로 2회 세척하여 남아있는 성분을 최대한 제거했다.
- 1g) 분획에 대하여 SiO2 CC (ϕ4×13cm, CHCl3:MeOH=7:1)를 실시하여, 17개의 분획물 (TME-10-1~TME-10-17)을 얻었다. 이 중 TME-10-8 (9), TME-10-12 (26), TME-10-13 (34), TME-10-13 (37)의 4 가지 분획물로부터 항산화 활성을 조사하였다. 활성시료 분획물을 동일한 방법으로 GSH 회복능을 측정하였다.
- TME 분획(120g)에 대하여 silica gel (SiO2) column chromatography (CC) (ϕ5×22cm, n-hexane-EtOAc=10:1→5:1→3:1→1:1→ CHCl3:MeOH=10:1→7:1→5:1→3:1→2:1→1:1)를 실시하여 20개의 분획물 (TME-1~TME-21)을 얻었다. 이 중에서 TME-10 (1.1g) 분획에 대하여 SiO2 CC (ϕ4×13cm, CHCl3-MeOH= 7:1)를 실시하여, 17개의 분획물 (TME10-1~TME1-10-17)을 얻었으며, 화합물 1 (quercetin, TME10-13(37), 53mg, Ve/Vt 0.614-0.705, Rf=0.56 on SiO2 TLC 60 F254S, CHCl3-MeOH-H2O=7:3:1)을 분리 하였다.
- 발견하였다. 이를 바탕으로 TME-10 (1.1g) 분획에 대하여 SiO2 CC (ϕ4×13cm, CHCl3:MeOH=7:1)를 실시하여, 17개의 분획물 (TME-10-1~TME-10-17)을 얻었다. 이 중 TME-10-8 (9), TME-10-12 (26), TME-10-13 (34), TME-10-13 (37)의 4 가지 분획물로부터 항산화 활성을 조사하였다.
- 1시간 후 MitoFreSHtracer를 제거하고, HBSS 100μL를 넣은 채로 operetta high-content imaging system (HH12000000, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 510nm와 580 nm에서의 형광 intensity를 측정하였다. 추출물을 처리하지 않은 대조군의 GM, GH값을 기준으로 추출물에 의해 달라진 GM, GH값을 비교하여 GSH 회복능을 확인하였다. 실험결과는 각각의 시료에 대한 Mean±SEM으로 나타내었으며, 통계분석에 의한 유의성 검증은 Graph Pad Prism (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA 분석을 시행하였다.
- 토마토 추출물의 항산화 활성을 알아보기 위해 hUC-MSC에 추출물을 5, 10, 20μg/mL 농도 별로 처리하여 GSH 회복 능을 비교하였다(Fig. 2). 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때, 토마토추출물은 5μg/mL 농도에서 GM 1.
- 토마토에서 항산화능을 가지는 화합물을 탐색하기 위해 추가적인 추출 공정을 통하여 극성차이를 이용한 EtOAc층, n-BuOH 층, H2O층으로 계통분획을 진행하여 TME, TMB, TMH의 분획물을 얻은 뒤에 TME, TMB 분획물의 GSH 회복능을 평가하였다. TMB의 경우, 20μg/mL 농도를 처리한 실험군은 GM 1.
- 항산화 활성이 높았던 TME-10-13 (37) 분획에 대하여 NMR, IR, FAB/MS를 측정하여 구조동정을 실시하였다. 화합물 1은 대표적인 flavonol 화합물로 TLC 확인시 UV (254/365nm)에서 강한 UV 흡수를 보였으며, 10% 황산 발색 시 노란색으로 발색 되었다.
- 이 중 TME-10-8 (9), TME-10-12 (26), TME-10-13 (34), TME-10-13 (37)의 4 가지 분획물로부터 항산화 활성을 조사하였다. 활성시료 분획물을 동일한 방법으로 GSH 회복능을 측정하였다. TME-10-8 (9) 의 경우, 처리농도 5μg/mL에서 GM 1.
대상 데이터
- 본 실험에서는 2019년 6월 셀투인에서 제공된 토마토(Lycopersicon esculentum)를 실험 재료로 사용하였다. 표품은 경희대학교 피부 생명공학센터 천연물화학 실험실(KHU-1906)에 보관되어 있다.
- probe (M-377, Cell2in, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다[6]. 사용된 세포는 인간의 탯줄 유래 중간엽줄기세포(Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, hUC-MSC) passage number 15로, 분열과 성장이 더딘 노화 상태의 세포이다. 이 세포를 96 well optically clear bottom plate (6055300, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에 3×104 cells/mL로 100μL씩 분주하고 24시간 동안 10% fetal bovine serum (16000044, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)+1% penicillin-streptomycin (15140122, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 든 Minimum Essential Medium α (12561056, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 조건에서 배양한 후 토마토 추출물을 첨가한 배지를 농도별(5, 10, 20μg/mL)로 제조한 후 세포에 처리하고 24 시간동안 배양하였다.
- 토마토(Lycopersicon esculentum) 액상 4kg을 70% MeOH 수용액(68L×4)으로 두 차례 걸쳐 추출한 후 여과지로 여과를 하였다. 얻어진 여액을 45oC에서 감압농축하고, 이 농축물을 물과 ethyl acetate로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-butanol로 분배 추출 하였다.
데이터처리
- 추출물을 처리하지 않은 대조군의 GM, GH값을 기준으로 추출물에 의해 달라진 GM, GH값을 비교하여 GSH 회복능을 확인하였다. 실험결과는 각각의 시료에 대한 Mean±SEM으로 나타내었으며, 통계분석에 의한 유의성 검증은 Graph Pad Prism (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA 분석을 시행하였다.
성능/효과
- 이를 통해 이 화합물이 flavonol 화합물임을 예상하였다. 13C-NMR (100MHz, CD3OD, δC) spectrum에서 탄소수가 15개임을 확인하였고, 이를 통해 flavonol임을 확인하였다. 1개의 conjugated ketone carbon signal (δC 177.
- 13C-NMR (100MHz, CD3OD, δC) spectrum에서 탄소수가 15개임을 확인하였고, 이를 통해 flavonol임을 확인하였다. 1개의 conjugated ketone carbon signal (δC 177.05), 7개의 oxygenated olefin quaternary carbon signal (δC 165.26; 163.14; 157.03; 148.78; 147.85; 146.56; 137.62)을 확인하였고, 2개의 olefin quaternary carbon signal (δC 125.83; 121.91)을 확인하였으며, 5개의 olefin methine carbon signal (δC 116.34; 116.17; 104.27; 99.56; 94.95)을 확인하였다. 위의 data 를 문헌값[9, 10]과 비교하여 화합물 1을 3', 4', 5, 7-tetrahydroxyflavonol, quercetin 으로 구조 동정 하였다.
- Negative FAB/MS에서 m/z 301 [M–H]– 분자이온 peak가 관측되어 분자량을 302 로 확인하였다. IR spectrum으로부터 공역화된 카보닐기(1615cm−1), 수산기(3355 cm−1)와 이중결합(1584cm−1)이 있는 것으로 확인되었다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD, δH) spectrum에서 3개의 olefin methine proton signal 7.
- TMB의 경우, 20μg/mL 농도를 처리한 실험군은 GM 1.09±0.02로 대조군(0.89±0.04) 대비 22.5%의 증가를 보였으나 통계적으로 유의미한 차이로 나타나지 않았고, GH에서는 5μg/ mL만 처리해도 39.31±0.26으로 대조군(58.90±1.51) 대비 33.3% 감소하여 세포 간의 균질성이 향상되는 것을 확인하였다(Fig. 3). TME는 20μg/mL 농도를 처리한 실험군에서 GM 1.
- 또한, TME-1, TME-2, TME-5, TME-17-1 그룹에서는 특정 처리농도에서 대조군 대비 GSH 회복능이 감소되었다. TME-1은 처리농도 5μg/mL에서 GM 0.87±0.01로 대조군(0.94±0.01) 대비 7.4% 감소하는 경향이 보였고, TME-2는 처리농도 20μg/mL에서 GM 0.71±0.04로 대조군(0.94±0.01) 대비 24.5% 감소했다. 또한, TME-5는 처리농도 10μg/mL에서 GM 0.
- 4). TME-9의 경우는 처리농도 5μg/ mL부터 GM의 유의적인 변화는 없이 GH 37.58±0.83으로 대조군(43.00±1.02) 대비 12.6% 감소하여 세포 간의 균질성이 향상되는 것을 확인하였다(Fig. 4). 마지막으로, TME-3와 TME-10 그룹은 특정 처리농도에서 대조군 대비 GSH 회복능이 향상되었다.
- 3). TME는 20μg/mL 농도를 처리한 실험군에서 GM 1.29± 0.02로 대조군(0.89±0.04) 대비 44.9%의 증가를 보였고, GH에서는 TMB와 마찬가지로 5μg/mL만 처리해도 40.23±0.38로 대조군(58.90±1.51) 대비 31.7% 감소하여 TMB보다 TME가 통계적인 차이를 보이며 더 GSH 회복능을 향상시키는 것으로 나타났다 (Fig. 3).
- Quercetin 은 다양한 문헌에서 항산화 활성, 항염 활성, 미백 활성[18] 등이 보고되어 있다. 따라서 토마토 추출물과 분획물에서의 높은 GSH 회복능 또한 주요화합물 중 하나인 quercetin 에 의한 영향이 있음을 알 수 있다. 또한, 이와 같은 결과로 토마토가 항산화능을 가지는 건강식품소재로서 사용할 수 있는 가능성을 확인하였다.
- 6%의 증가를 보였다. 또한, GH도 같은 농도에서 29.96±0.06으로 대조군(50.37±2.79) 대비 40.5% 감소하여 높은 GSH 회복능을 나타내었다. 그 이상의 농도에서도 모두 유의미한 GM의 증가와 GH의 감소가 유지되었다(Fig.
- 4). 또한, TME-1, TME-2, TME-5, TME-17-1 그룹에서는 특정 처리농도에서 대조군 대비 GSH 회복능이 감소되었다. TME-1은 처리농도 5μg/mL에서 GM 0.
- 5% 감소했다. 또한, TME-5는 처리농도 10μg/mL에서 GM 0.67±0.03으로 대조군(0.85±0.02) 대비 21.2% 감소, TME-17-1은 처리농도 5 μg/mL에서 GM 0.66±0.02로 대조군(0.88±0.02) 대비 25% 감소하는 결과를 얻었다(Fig. 4). TME-9의 경우는 처리농도 5μg/ mL부터 GM의 유의적인 변화는 없이 GH 37.
- 7% 증가하는 경향을 보였다. 마지막으로, TME-10-13 (37)은 처리농도 5μg/mL에서 GM 0.96±0.02로 대조군(0.71± 0.00) 대비 35.2% 증가했고, GH는 처리농도 20μg/mL에서 26.95±2.59으로 대조군(50.73±2.15) 대비 46.9% 감소하여 비교그룹 중 두번째로 높은 GSH 회복능을 나타내었다(Fig. 5).
- 4). 마지막으로, TME-3와 TME-10 그룹은 특정 처리농도에서 대조군 대비 GSH 회복능이 향상되었다. TME-3는 처리농도 20μg/mL에서 GM 1.
- 상기의 결과를 통하여 TME-10 분획물이 적은 농도를 처리해도 세포 내 GSH 회복능을 향상시키는 데에 도움을 준다는 것을 발견하였다. 이를 바탕으로 TME-10 (1.
후속연구
- 따라서 토마토 추출물과 분획물에서의 높은 GSH 회복능 또한 주요화합물 중 하나인 quercetin 에 의한 영향이 있음을 알 수 있다. 또한, 이와 같은 결과로 토마토가 항산화능을 가지는 건강식품소재로서 사용할 수 있는 가능성을 확인하였다.
- 2). 이러한 결과를 토대로, 토마토 추출물이 세포 내 항산화능 활성에 도움을 주는 것을 확인하였으며, 본 농도 범위를 추가적인 실험에도 적용하였다.
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