RAW264.7 대식세포에서 MAPK 및 NF-κB 신호전달 경로 억제를 통한 황기 및 지치 복합물의 항염증 효과 Anti-inflammatory effect of a mixture of Astragalus membranaceus and Lithospermum erythrorhizon extracts by inhibition of MAPK and NF-κB signaling pathways in RAW264.7 cells원문보기
최두진
(Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA)
,
김금숙
(Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA)
,
최보람
(Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA)
,
이영섭
(Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA)
,
한경숙
(Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA)
,
이동성
(College of Pharmacy, Chosun University)
,
이대영
(Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA)
본 연구는 황기와 지치 복합물인 ALM16이 lipopolysaccharide 처리에 의해 자극된 RAW264.7 대식세포의 염증반응에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. ALM16은 RAW264.7 대식세포에 대하여 최대 200 ㎍/mL의 농도까지 독성은 보이지 않았다. 항염증 활성을 검정하기 위해 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) 및 pro-inflammatory cytokines 생성량을 측정한 결과, ALM16은 각각의 생성량을 농도의존적으로 감소시켰다. 또한 ALM16은 NO와 PGE2 생성에 관여하는 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 단백질 발현을 억제하였다. 한편, 항염증 활성 조절 기전을 확인하기 위하여 NK-κB의 핵으로의 이동과 DNA-binding activity 및 MAPK 신호전달 경로에 대한 ALM16의 영향을 확인한 결과, ALM16은 NF-κB의 핵으로 이동과 DNA-binding activity를 유의적으로 억제하였으며, JNK와 ERK 특이적으로 인산화를 억제함으로써 MAPK 신호전달 경로 활성을 억제하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 ALM16이 MAPK와 NF-κB의 신호전달 경로 억제를 통한 iNOS와 COX-2의 발현을 조절하고, 이로 인하여 NO, PGE2 및 pro-inflammatory cytokines의 생성이 감소하여 염증 반응을 조절하는 능력이 있는 것으로 판단된다.
본 연구는 황기와 지치 복합물인 ALM16이 lipopolysaccharide 처리에 의해 자극된 RAW264.7 대식세포의 염증반응에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. ALM16은 RAW264.7 대식세포에 대하여 최대 200 ㎍/mL의 농도까지 독성은 보이지 않았다. 항염증 활성을 검정하기 위해 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) 및 pro-inflammatory cytokines 생성량을 측정한 결과, ALM16은 각각의 생성량을 농도의존적으로 감소시켰다. 또한 ALM16은 NO와 PGE2 생성에 관여하는 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 단백질 발현을 억제하였다. 한편, 항염증 활성 조절 기전을 확인하기 위하여 NK-κB의 핵으로의 이동과 DNA-binding activity 및 MAPK 신호전달 경로에 대한 ALM16의 영향을 확인한 결과, ALM16은 NF-κB의 핵으로 이동과 DNA-binding activity를 유의적으로 억제하였으며, JNK와 ERK 특이적으로 인산화를 억제함으로써 MAPK 신호전달 경로 활성을 억제하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 ALM16이 MAPK와 NF-κB의 신호전달 경로 억제를 통한 iNOS와 COX-2의 발현을 조절하고, 이로 인하여 NO, PGE2 및 pro-inflammatory cytokines의 생성이 감소하여 염증 반응을 조절하는 능력이 있는 것으로 판단된다.
This study investigated a mixture of Astragalus membranaceus (AM) and Lithospermum erythrorhizon (LE) extracts (ALM16), exerts anti-inflammatory effects in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 macrophage cells, and its underlying mechanism. ALM16 was prepared by mixing AM and LE extracts in a r...
This study investigated a mixture of Astragalus membranaceus (AM) and Lithospermum erythrorhizon (LE) extracts (ALM16), exerts anti-inflammatory effects in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 macrophage cells, and its underlying mechanism. ALM16 was prepared by mixing AM and LE extracts in a ratio of 7:3 (w/w). Cytotoxicity of ALM16 in RAW264.7 cells was not shown up to 200 ㎍/mL of ALM16. The results of this study showed that ALM16 does-dependently inhibits the production of nitric oxide, prostaglandin E2 and pro-inflammatory cytokines (interleukin-1β, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α) in LPS-induced RAW264.7 cells. ALM16 not only markedly reduced the protein expression levels of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 (COX-2) in LPS-stimulated RAW264.7 cells, but also inhibited the nuclear translocation and DNA-binding activity of nuclear factor-kappa B (NF-κB). In addition, ALM16 specifically inhibited the phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase and extracellular signal-regulated kinases in LPS-stimulated RAW264.7 cells. In conclusion, these results suggest that ALM16 may exert anti-inflammatory effect by modulating mitogen-activated protein kinase and NF-κB signaling pathways.
This study investigated a mixture of Astragalus membranaceus (AM) and Lithospermum erythrorhizon (LE) extracts (ALM16), exerts anti-inflammatory effects in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 macrophage cells, and its underlying mechanism. ALM16 was prepared by mixing AM and LE extracts in a ratio of 7:3 (w/w). Cytotoxicity of ALM16 in RAW264.7 cells was not shown up to 200 ㎍/mL of ALM16. The results of this study showed that ALM16 does-dependently inhibits the production of nitric oxide, prostaglandin E2 and pro-inflammatory cytokines (interleukin-1β, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α) in LPS-induced RAW264.7 cells. ALM16 not only markedly reduced the protein expression levels of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 (COX-2) in LPS-stimulated RAW264.7 cells, but also inhibited the nuclear translocation and DNA-binding activity of nuclear factor-kappa B (NF-κB). In addition, ALM16 specifically inhibited the phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase and extracellular signal-regulated kinases in LPS-stimulated RAW264.7 cells. In conclusion, these results suggest that ALM16 may exert anti-inflammatory effect by modulating mitogen-activated protein kinase and NF-κB signaling pathways.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
또한, ALM16은 고지방식이로 인한 비 알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 동물 모델에서 간 지방증(hepatic steatosis) 억제 효과가 있는 것을 확인하였다[29]. 골관절염과 비알콜성 지방간 질환은 만성 염증 반응과 관련이 있기 때문에 본 연구에서 ALM16의 항염증 활성 및기전 연구를 확인하고자 하였다.
대한 효과를 나타냄을 보고한 바 있다[27]. 따라서, 염증에 효과가 있는 성분을 함유하고 있는 황기 및 지치의 추출물을 혼합한 복합물(ALM16)이 LPS 처리에 의해 염증반응이 유도된 RAW264.7 대식세포에서 NF-κB 및 MAPK signaling pathway 조절을 통한 항염증 효능을 나타내는지 분자 수준에서 규명하고자 하였다.
따라서 염증 조절 연구에 있어서 NF-κB의 활성화 및 핵 안으로 이동에 대한 조절은 가장 중요한 요소이다. 본 연구에서는 ALM16이 대식세포에서 LPS에의한 NF-κB의 활성 및 핵 안으로의 이동을 억제할 수 있는지 확인 하였다. Fig.
제안 방법
48 well plate에 5×105 cells/well로 분주하고, 12시간 배양하였다. ALM16을 10, 25, 50, 100, 200㎍/mL 농도로 48시간 동안 처리하였다. 배지를 제거한 후 MTT 시약(5mg/mL)을 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다.
7 세포를 이용하여 5×105 cells/well 농도로 48 well plate에 분주하고 12시간 배양하였다. ALM16을 각 농도별로 3 시간 전처리 한 후, LPS (1㎍/mL)를 24시간 처리하였다. 세포 배양액으로 분비된 NO의 양은 Griss 시약(0.
ALM16의 RAW264.7 세포에 미치는 세포독성(cytotoxicity)을 확인하고자 세포 생존율을 측정하였다. ALM16의 경우 최고 농도 200㎍/mL까지 아무것도 처리하지 않은 정상군(100%)과 비교하여 유의적인 세포 생존율의 차이가 없는 것을 확인하였으며, 최대 실험농도를 200㎍/mL로 설정하였다.
ALM16의 항염증 효과를 확인하기 위하여 염증반응의 대표적인 지표인 NO와 PGE2의 생성량을 측정하였다. 염증반응에 의해 활성화된 대식세포에서 iNOS와 COX-2 효소에 의해 NO와 PGE2 생성이 촉진되며 초기 염증반응에 중요한 역할을 한다.
4)을 첨가한 후, 16, 000 rpm, 4oC, 15분간 원심분리하여 상등액만을 얻었다. 각 시료의 단백질은 Bradford assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하였고, 7.5%와 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis에서 분리시킨 후 Hybond enhanced chemiluminescence (ECL) nitrocellulose membrane (Bio-Rad)에 transfer하였다. Membrane을 5% 무지방유(skim milk)가 포함된 blocking 완충액에서 blocking 하였다.
방법으로 제조되었다[27]. 간단하게, 황기 및 지치 건재 시료를 조분쇄한 후(직경 0.5cm 이하), 황기는 50% 주정(시료 중량의 15배 용량), 지치는 70% 주정(시료 중량의 15배 용량)을 이용하여 80oC, 4시간 총 2회 환류추출을 하였다. 각 추출물은 1μm 필터로 여과한 후 감압농축하여 얻어진 황기 추출물(50±1 brix) 및 지치 추출물(66±1 brix)은 80-90oC에서 1시간 살균한 후 건조하였다.
기존 항염증 약물들의 주요 작용기전은 선택적인 COX-2 의 발현 및 활성 저해에 의한 PGs 합성을 억제하는 것으로 보고되었다[39]. 따라서, 본 실험에서는 LPS 처리에 의해 염증 매개 물질의 생성량 증가에 따른 관련 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과 LPS 처리에 의해 증가된 iNOS 단백질 발현량은 ALM16 50, 100, 200㎍/mL 처리에 의해 각각 23.
선행연구에서 황기 및 지치 추출물을 혼합비율별로 제조한 복합물의 MMPs 저해 활성을 비교하여 가장 효과적인 혼합비(7:3, w/w, ALM16) 선별하였고, 활성지표성분으로서 calycosin, calycosin-7-O-β-D-glucoside 및 lithospermic acid에 대한 HPLC 정량 분석을 실시하였다[27]. 추후 연구에서, ALM16은 MIA에 의한 골관절염 동물 모델에서 진통 및 연골 보호 효과가 있음을 입증하였다[28].
ALM16을 각 농도별로 3 시간 전처리 한 후, LPS (1㎍/mL)를 24시간 처리하였다. 세포 배양액으로 분비된 NO의 양은 Griss 시약(0.1% N-(1-naphathyl)-ethylenediamine, 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)을 사용하여 측정하였다. 세포의 상층액 배지와 Griess 시약을 1:1로 혼합하여 차광상태에서 10분간 반응시킨 후 ELISA microplate reader를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrite를 이용하여 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 계산하였다.
이후 ALM16을 농도별로 3시간 전처리하고, LPS (1㎍/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포의 상층액 배지 100μL 를 취하여 IL-1β, IL-6, TNF-α 분비량을 ELISA assay kit (R&D system)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.
1% N-(1-naphathyl)-ethylenediamine, 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)을 사용하여 측정하였다. 세포의 상층액 배지와 Griess 시약을 1:1로 혼합하여 차광상태에서 10분간 반응시킨 후 ELISA microplate reader를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrite를 이용하여 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 계산하였다. 세포 배양액으로 분비된 PGE2의 양은 PGE2 enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.
배지를 제거한 후 MTT 시약(5mg/mL)을 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 형성된 formazane 200μL의 DMSO를 첨가하여 녹인 후, ELISA microplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 아무것도 처리하지 않은 정상군(control)의 흡광도 값을 기준으로 상대적인 세포 생존율을 비교하였다.
각 추출물은 1μm 필터로 여과한 후 감압농축하여 얻어진 황기 추출물(50±1 brix) 및 지치 추출물(66±1 brix)은 80-90oC에서 1시간 살균한 후 건조하였다. 황기 추출분말(AM, yield 24%)과 지치 추출 분말(LE, yield 42%)은 7:3 (w/w)의 비율로 혼합하여 황기, 지치복합 추출물(ALM16)을 제조하였다.
대상 데이터
세포 배양에 사용한 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, fetal bovine serum (FBS), Streptomycin-penicilline Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, LPS와 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Western blot에 사용한 b-actin, proliferating cell nuclear antigen (PCNA)에 대한 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 사에서 구입하였고, COX-2에 대한 1차 항체는 Abcam (Cambridge, UK)사에서 구입하였고, iNOS에 대한 1차 항체는 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)사에서 구입하였고, p65, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38에 대한 1차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, anti-mouse, anti-rabbit의 2차 항체는 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입하였다.
본 실험에 사용한 RAW264.7 마우스 대식세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 세포 배양을 위해 10% FBS 및 100units/mL penicillin G, 100mg/mL streptomycin 및 2mM L-glutamine 을 함유한 RPMI 1640 배지에서 37oC, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
본 연구에서 사용한 황기(A. membranaceus) 및 지치(L. erythrorhizon) 는 충북 제천에서 재배된 것을 구매하여 사용하였다. 표본 시료로서 황기(MPS005087)와 지치(MPS004961)는 국립 원예특작 과학원 인삼특작부에 보관되어 있다.
표본 시료로서 황기(MPS005087)와 지치(MPS004961)는 국립 원예특작 과학원 인삼특작부에 보관되어 있다. 세포 배양에 사용한 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, fetal bovine serum (FBS), Streptomycin-penicilline Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, LPS와 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Western blot에 사용한 b-actin, proliferating cell nuclear antigen (PCNA)에 대한 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 사에서 구입하였고, COX-2에 대한 1차 항체는 Abcam (Cambridge, UK)사에서 구입하였고, iNOS에 대한 1차 항체는 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)사에서 구입하였고, p65, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38에 대한 1차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, anti-mouse, anti-rabbit의 2차 항체는 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
본 실험의 결과는 means±SD로 나타내었고(n=3), Graph-padprism (Ver 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 를 사용하여 ANOVA 분산분석과 Tukey’s multiple comparison test로 유의성 검정을 시행하였다(p<0.05).
이론/모형
7 cells were incubated for 24 h with various concentrations of ALM16. Cell viability was determined using MTT assay. All data represent means ± standard deviation (SD) (n=3)
RAW264.7 세포에 대한 ALM16의 세포독성(cytotoxicity)을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 48 well plate에 5×105 cells/well로 분주하고, 12시간 배양하였다.
세포의 상층액 배지와 Griess 시약을 1:1로 혼합하여 차광상태에서 10분간 반응시킨 후 ELISA microplate reader를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrite를 이용하여 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 계산하였다. 세포 배양액으로 분비된 PGE2의 양은 PGE2 enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.
4), 50mM glycerophosphate, 20mM NaF, 20mM ethylene glycol tetraacetic acid, 1mM dithiothreitol, 1mM Na3VO4, protease inhibitors를 포함한 RIPA buffer를 첨가하여 혼합한 후, 16, 000×g, 4oC, 5분간 원심 분리 하여 핵 분획물(Nucleus fraction)을 얻었다. 핵 분획물의 NF-κB DNA-binding activity는 NF-κB (p65) Transcription Factor Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.
성능/효과
[30, 31]. ALM16을 100, 200㎍/mL 처리하였을 때 NO의 생성량은 LPS 단독 처리군 대비 각각 31.7, 46.2% 유의적으로 감소하였고(Fig. 2A), PGE2 생성량은 LPS 단독 처리군과 비교하여 각각 22.6, 42.1% 유의적으로 감소하였다(Fig. 2B).
1배 증가하였고, MAPK 신호 전달 경로가 활성화된 것을 확인하였다. ALM16을 50, 100, 200㎍/ mL 처리했을 경우 JNK의 인산화가 LPS 단독 처리군 대비 각각 29.3, 39.5, 43.0% 유의하게 감소하였다. LPS처리에 의해증가된 인산화된 ERK는 ALM16 100, 200㎍/mL 처리하였을 때 각각 19.
0% 유의하게 감소하였다. LPS처리에 의해증가된 인산화된 ERK는 ALM16 100, 200㎍/mL 처리하였을 때 각각 19.0, 28.3% 유의적인 감소를 보였다. 하지만 p38 인산화에 대해서는 유의적인 변화를 관찰할 수 없었다.
따라서, 본 실험에서는 LPS 처리에 의해 염증 매개 물질의 생성량 증가에 따른 관련 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과 LPS 처리에 의해 증가된 iNOS 단백질 발현량은 ALM16 50, 100, 200㎍/mL 처리에 의해 각각 23.9, 32.8, 37.3% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4A). COX-2의 경우, LPS 단독 처리군에 비해 ALM16 100, 200㎍/mL 처리한 경우 각각 19.
나타낸다고 보고하였다. 따라서, 이러한 결과들은 ALM16이 LPS 처리된 대식세포에서 NO 및 PGE2와 같은 염증 매개 물질과 pro-inflammatory cytokine의 생성을 억제하여 염증반응을 조절할 수 있음을 의미한다.
하지만 p38 인산화에 대해서는 유의적인 변화를 관찰할 수 없었다. 따라서, 이러한 결과를 통해 ALM16이 인산화된 JNK, ERK 특이적인 MAPK 신호전달 경로를 억제함을 확인하였다. Lee 등[45]은 치자 추출물이 특이적으로 JNK 활성과 NF-κB 활성 억제를 통한 항염증 활성을 보고하였고, Choi 등[5]은 rebaudioside A가 MAPK 중 특이적으로 ERK의 인산화를 감소시켜 NF-κB 조절기작에 관여한다고 보고하였다.
1% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, NF-κB의 활성화를 측정하기 위해 DNA-binding activity를 측정한 결과, LPS 처리된 대식 세포의 NF-κB DNA-binding activity는 아무것도 처리하지 않은 세포와 비교하여 약 2.7배 증가하였다. 이와는 대조적으로 ALM16 100, 200 mg/mL 처리한 경우 LPS 단독 처리군과 비교하여 NF-κB의 DNA-binding activity가 각각 30.
ERK 및 p38의 활성화는 pro-inflammatory cytokine의 생성 및 방출에 관여하며, JNK의 활성화는 iNOS 및 COX-2 발현에 관여한다고 보고되었다[44]. 본 연구에서 ALM16이 LPS 자극에 의한 대식세포에서 MAPK에 미치는 영향을 알아본 결과(Fig. 6A, B), LPS 처리에 의해 인산화된 JNK, ERK, p38은 아무것도 처리하지 않은 세포 대비 각각 2.5, 20.8, 16.1배 증가하였고, MAPK 신호 전달 경로가 활성화된 것을 확인하였다. ALM16을 50, 100, 200㎍/ mL 처리했을 경우 JNK의 인산화가 LPS 단독 처리군 대비 각각 29.
본 연구에서 LPS 처리된 대식세포의 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량은 각각 753.20, 1348.10, 4533.85pg/mL로 아무것도 처리하지 않은 세포(19.35, 126.45, 119.32pg/mL)에 비해 현저히 증가하였으나, ALM16을 200㎍/mL 처리했을 경우 각각 415.16, 865.24, 2416.57 pg/mL로 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 3A-C).
7 세포에서 암대극 추출물 처리에 따라 NO와 PGE2 의 생성이 감소되었으며, 이는 iNOS와 COX-2 단백질 발현의 조절에 의한 것임을 보고하였다. 본 연구에서도 ALM16이 NO, PGE2와 같은 염증 매개체 생성과 관련 있는 효소의 발현을 조절하여 염증반응을 억제할 수 있음을 확인하였다.
Lee 등[45]은 치자 추출물이 특이적으로 JNK 활성과 NF-κB 활성 억제를 통한 항염증 활성을 보고하였고, Choi 등[5]은 rebaudioside A가 MAPK 중 특이적으로 ERK의 인산화를 감소시켜 NF-κB 조절기작에 관여한다고 보고하였다. 이러한 결과들을 종합해보면, ALM16은 JNK, ERK 특이적인 MAPK 신호전달 경로와 NF-κB의 활성 억제를 통해 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하여 염증 매개체와 pro-inflammatory cytokine의 생성을 감소시켜 항염증 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 토대로 ALM16은 염증 조절 효능을 통해 만성 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있는 유용한 소재임을 확인하였다.
이러한 결과들을 종합해보면, ALM16은 JNK, ERK 특이적인 MAPK 신호전달 경로와 NF-κB의 활성 억제를 통해 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하여 염증 매개체와 pro-inflammatory cytokine의 생성을 감소시켜 항염증 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 토대로 ALM16은 염증 조절 효능을 통해 만성 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있는 유용한 소재임을 확인하였다.
7배 증가하였다. 이와는 대조적으로 ALM16 100, 200 mg/mL 처리한 경우 LPS 단독 처리군과 비교하여 NF-κB의 DNA-binding activity가 각각 30.8, 40.8% 감소하였다(Fig. 5B). 이러한 결과는 ALM16은 LPS와 같은 외부 자극에 의한 염증반응을 조절하는 주요 인자인 NF-κB의 활성에 대한 조절 효과가 있음을 시사한다.
1배 증가하였다. 하지만 ALM16 50, 100, 200㎍/mL 처리시 핵으로 이동한 NF-κB의 단백질 양이 LPS 단독 처리군 대비 각각 34.3, 47.6, 50.1% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, NF-κB의 활성화를 측정하기 위해 DNA-binding activity를 측정한 결과, LPS 처리된 대식 세포의 NF-κB DNA-binding activity는 아무것도 처리하지 않은 세포와 비교하여 약 2.
참고문헌 (45)
Medzhitov R (2010) Inflammation 2010: new adventures of an old flame. Cell 140: 771-776
Zhou Y, Hong Y, Huang H (2016) Triptolide attenuates inflammatory response in membranous glomerulo-nephritis rat via downregulation of NF-κB signaling pathway. Kidney Blood Press Res 41: 901-910
Arulselvan P, Fard MT, Tan WS, Gothai S, Fakurazi S, Norhaizan ME, Kumar SS (2016) Role of antioxidants and natural products in inflammation. Oxid Med Cell Longev 2016: 5276130
Lee EH, Park HJ, Kim BO, Choi HW, Park KI, Kang IK, Cho YJ (2020) Anti-inflammatory effect of Malus domestica cv. Green ball apple peel extract on Raw 264.7 macrophages. J Appl Biol Chem 63: 117-123
Choi DH, Cho UM, Hwang HS (2018) Anti-inflammation effect of rebaudioside A by inhibition of the MAPK and NF-κB signal pathway in RAW264.7 macrophage. J Appl Biol Chem 61: 205-211
Takeuchi O, Akira S (2010) Pattern recognition receptors and inflammation. Cell 140: 805-820
Sharif O, Bolshakov VN, Raines S, Newham P, Perkins ND (2007) Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol 8: 1
Cagiola M, Giulio S, Miriam M, Katia F, Paola P, Macri A, Pasquali P (2006) In vitro down regulation of proinflammatory cytokines induced by LPS tolerance in pig CD14+ cells. Vet Immunol Immunopathol 112: 316-320
Yoon YK, Woo HJ, Kim Y (2015) Orostachys japonicus inhibits expression of the TLR4, NOD2, iNOS, and COX-2 genes in LPS-stimulated human PMA-differentiated THP-1 cells by inhibiting NF-κB and MAPK activation. Evid Based Complement Alternat Med 2015: 682019
Kim GS, Lee DY, Lee SE, Noh HJ, Choi JH, Park CG, Choi SI, Hong SJ, Kim SY (2013) Evaluation on extraction conditions and HPLC analysis method for bioactive compounds of Astragali radix. Korean J Medicinal Crop Sci 21: 486-492
Shahzad M, Shabbir A, Wojcikowski K, Wohlmuth H, Gobe GC (2016) The antioxidant effects of Radix Astragali (Astragalus membranaceus and related species) in protecting tissues from injury and disease. Curr Drug Targets 17: 1331-1340
Zhu H, Zhang Y, Ye G, Li Z, Zhou P, Huang C (2009) In vivo and in vitro antiviral activities of calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside against coxsackie virus B3. Biol Pharm Bull 32: 68-73
Chan JY, Lam F, Leung P, Che C, Fung K (2009) Antihyperglycemic and antioxidative effects of an herbal formulation of radix astragali, radix codonopsis and cortex lycii in a mouse model of type 2 diabetes mellitus. Phytother Res 23: 658-665
Xiao W, Han L, Shi B (2009) Isolation and purification of flavonoid glucosides from Radix Astragali by high-speed counter-current chromatography. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 877: 697-702
Zhang Y, Shi S, Guo J, You Q, Feng D (2013) On-line surface plasmon resonance-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for analysis of human serum albumin binders from Radix Astragali. J Chromatogr A 1293: 92-99
Su X, Huang Q, Chen J, Wang M, Pan H, Wang R, Zhou H, Zhou Z, Liu J, Yang F, Li T, Liu L (2016) Calycosin suppresses expression of pro-inflammatory cytokines via the activation of p62/Nrf2-linked heme oxygenase 1 in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Pharmacol Res 113: 695-704
Zhang WJ, Hufnagl P, Binder BR, Wojta J (2003) Antiinflammatory activity of astragaloside IV is mediated by inhibition of NF-kappa B activation and adhesion molecule expression. Thromb Haemost 90: 904-914
Lee DY, Noh HJ, Choi J, Lee KH, Lee MH, Lee JH, Hong Y, Lee SE, Kim SY, Kim GS (2013) Anti-Inflammatory cycloartane-type saponins of Astragalus membranaceus. Molecules. 18: 3725-3732
Kim GS, Kim HJ, Lee DY, Choi SM, Lee SE, Noh HJ, Choi JG, Choi SI (2013) Effects of supercritical fluid extract, shikonin and acetylshikonin from Lithospermum erythrorhizon on chondrocytes and MIA-induced osteoarthritis in rats. Korean J Medicinal Crop Sci 21: 466-473
Papageorgiou VP, Assimopoulou AN, Couladouros EA, Hepworth D, Nicolaou KC (1999) The chemistry and biology of alkannin, shikonin, and related naphthazarin natural products. Angew Chem Int Ed Engl 38: 270-301
Gwon SY, Ahn JY, Chung CH, Moon BK, Ha TY (2012) Lithospermum erythrorhizon suppresses high-fat diet-induced obesity, and acetylshikonin, a main compound of Lithospermum erythrorhizon, inhibits adipocyte differentiation. J Agric Food Chem 60: 9089-9096
Kim GS, Park CG, Lee KH, Choi JH, Lee SE, Noh HJ, Lee JH, Kim SY (2011) Investigation of shikonin pigments and antioxidant activity of the roots from Lithospermum erythrorhizon according to the different growth stages and areas of cultivation. Korean J Medicinal Crop Sci 19: 435-440
Kim JS, Han YS, Kang MH (2006) Identification of shikonin and its derivatives from Lithospermum erythrorhizon. J Korean Soc Food Sci Nutr 35: 177-181
Chung HS, Kang M, Cho C, Park S, Kim H, Yoon YS, Kang J, Shin MK, Hong MC, Bae H (2005) Inhibition of lipopolysaccharide and interferon-gamma-induced expression of inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor-alpha by Lithospermi radix in mouse peritoneal macrophages. J Ethonophamocol 102: 412-417
Yoshida LS, Kakegawa T, Yuda Y, Takano-Ohmuro H (2017) Shikonin changes the lipopolysaccharide-induced expression of inflammation-related genes in macrophages. J Nat Med 71: 723-734
Choi DJ, Choi BR, Lee DY, Choi SI, Lee YS, Kim GS (2019) Inhibitory effect of mixed extracts obtained from Astragali Radix and Lithospermi Radix on matrix metalloproteinases in IL-1β-induced SW1353 cells and quantitative analysis of active compounds. Korean J Medicinal Crop Sci 27: 247-258
Choi DJ, Choi SI, Choi BR, Lee YS, Lee DY, Kim GS (2019) Cartilage protective and anti-analgesic effects of ALM16 on monosodium iodoacetate induced osteoarthritis in rats. BMC complement Altern Med 19: 325
Choi DJ, Kim SC, Park GE, Choi BR, Lee DY, Lee YS, Park SB, Park YI, Kim GS (2020) Protective effect of a mixture of Astragalus membranaceus and Lithospermum erythrorhizon extract against hepatic steatosis in high fat diet-induced nonalcoholic fatty liver disease mice. Evid Based Complement Alternat Med 2020: 8370698
Hanada T, Yoshimura A (2002) Regulation of cytokine signaling and inflammation. Cytokine Growth F R 13: 413-421
Dinarello CA (1999) Cytokines as endogenous pyrogens. J Infect Dis 179: 294-304
Masters SL, Simon A, Aksentijevich I, Kastner DL (2009) Horror autoinflammaticus: The molecular pathophysiology of autoinflammatory disease. Annu Rev Immunol 27: 621-668
Chung YS, Choi M, Park I, Park KY, Kim KH (2010) Effects of chitosan on the production of TNF-α, IL-1β, and IL-6 in mice. Cancer Prev Res 15: 204-210
Park MJ, Park HJ, Lee EH, Jung HY, Cho YJ (2018) Anti-inflammatory effect potentials of ethanol extracts from fermentated Caryopteris incana by Lactobacillus plantarum in induced to LPS with Raw 264.7 cell. J Appl Biol Chem 61: 141-150
Moncada S, Palmer RM, Higgs EA (1991) Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol.Rev 43: 109-142
Liu SF, Malik AB (2006) NF-κB activation as a pathological mechanism of septic shock and inflammation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L622-L645
Chan AT (2003) Aspirin, non-steroidal anti-inflammatory drugs and colorectal neoplasia: Future challenges in chemoprevention. Cancer Causes Control 14: 413-418
Yang EJ, Kim MS, Kim SY, Hyun CG (2019) Anti-inflammatory activity of Euphorbia jolkini extract in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 cells. KSBB J 34: 120-125
Surh YJ, Chun KS, Cha HH, Han SS, Keum YS, Park KK, Lee SS (2001) Molecular mechanisms underlying chemopreventive activities of anti-inflammatory phytochemicals: down-regulation of COX-2 and iNOS through suppression of NF-κB activation. Mutat Res 480: 243-268
Roberts PJ, Der CJ (2007) Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene 26: 3291-3310
Kim HK (2014) Role of ERK/MAPK signalling pathway in anti-inflammatory effects of Ecklonia cava in activated human mast cell line-1 cells. Asian Pac J Trop Med 7: 703-708
Lee SC, Sim SY, Kim YS (2016) Effects of Gardeniae Fructus on the metabolic process of antioxidant and anti-inflammation by JNK and NF-κB. J Korean Med Ophthalmol Otolaryngol Dermatol 29: 56-64
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.