선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 환자로부터 채취한 가검물을 직접 처리하여 항산균 도말검사(acid fast bacillus stain, AFB stain) 와 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) Ct 값과의 정량적 연관성을 증명하고, 결핵균 검출을 위한 각 검사법의 측정 한계를 측정하고 그에 따른 CTM의 Ct 값과 AFB stain 등급을 기준으로 반정량적인 진단의 판단에 도움을 주고자 하였다.
- 본 연구는 Cobas TaqMan MTB 검사(CTM test, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)와 항산균 도말염색검사의 연관성을 확인하고 그에 따른 반정량적 판정기준을 확립하고자 하였다. 2015년 1월부터 2015년 12월까지 삼성서울병원 진단검사의학과에 의뢰된 8, 389개의 검체에 대해 결핵균 도말 검사, 배양 검사 및 CTM 검사를 동시에 실시하였으며, 그 결과를 분석하여 AFB 염색과주기의 연관성을 후향적으로 분석하였다.
제안 방법
- 2015년 1년간 삼성서울병원에 의뢰된 CTM의 양성 검체 135건에 대한 항산균 도말 염색 결과는 ATS/CDC guidelines 기준에 따라 negative, trace 및 positive는 1+에서 4+까지 구분하는 6 grade 기준으로 판정하였다. 첫째, low 40∼47 Ct 값 기준에 해당하는 항산균 도말검사 gradee − (66.
- 2015년 1월부터 2015년 12월까지 삼성서울병원 진단검사의학과에 의뢰된 8, 389개의 검체에 대해 결핵균 도말 검사, 배양 검사 및 CTM 검사를 동시에 실시하였으며, 그 결과를 분석하여 AFB 염색과주기의 연관성을 후향적으로 분석하였다. CTM 검사의 임계 값(Ct)값으로, 결핵균 검출방법의 반정량적판정기준을 설정 하였다.
- 하였다. Bactec MGIT 960 system 이용하여 M. tuberculosis H37Rv를 액체배지에 100 μL를 분주하여 배양시킨 후 배양되는 시점에서 결핵균 양을 106 CFU /mL의 기준으로 10배율씩 5단으로 희석하여 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105와 1×106 CFU/mL를 포함한 6단계의 세균 희석액을 준비하여 항산균 도말검사를 각 단계별 10회 실시하고, 액체 배양과 CTM을 단계별 3회를 시행하여 양성 배양시간과 Ct값을 확인 하였다. 각 검사별 측정한계치는 50% 이상 검출된시점에 cut-off를 적용하였다.
- 01). CTM 검사와 항산균 염색 등급의 음의 상관관계가 입증되었으며, 임상 기준에 이러한 기준을 적용하여 임상적 의의를 검증하였다. 이 연구의 반정량적 기준은 병원에서활동성 결핵 및 감염을 일으킬 수 있는 환자의 빠른 진단의 판단에 도움이 될 것으로 사료된다.
- 2015년 1월부터 2015년 12월까지 삼성서울병원 진단검사의학과에 의뢰된 8, 389개의 검체에 대해 결핵균 도말 검사, 배양 검사 및 CTM 검사를 동시에 실시하였으며, 그 결과를 분석하여 AFB 염색과주기의 연관성을 후향적으로 분석하였다. CTM 검사의 임계 값(Ct)값으로, 결핵균 검출방법의 반정량적판정기준을 설정 하였다. CTM 검사의 135개의 양성 표본에 대한 Ct값은 항산균 도말염색과 반비례적 상관관계가 있었다(rs= −0.
- tuberculosis H37Rv를 액체배지에 100 μL를 분주하여 배양시킨 후 배양되는 시점에서 결핵균 양을 106 CFU /mL의 기준으로 10배율씩 5단으로 희석하여 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105와 1×106 CFU/mL를 포함한 6단계의 세균 희석액을 준비하여 항산균 도말검사를 각 단계별 10회 실시하고, 액체 배양과 CTM을 단계별 3회를 시행하여 양성 배양시간과 Ct값을 확인 하였다. 각 검사별 측정한계치는 50% 이상 검출된시점에 cut-off를 적용하였다.
- 결핵균 배양 검사는 고체배지 배양으로 3% Ogawa 배지 (Asan Pharmaceutical Co., Seoul, Korea)와 액체배지 배양으로 Bactec MGIT (Mycobacterium Growth Indicator Tube) 960 system (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, MD, USA)을 이용하여 최대 6주까지 배양하였다.
- 결핵균 양에 대한 반정량적으로 Ct 값을 very low 28∼38, low 22∼28, medium 16∼22, high <16 이하의 값으로 항산균 도말검사와 비교하여 4단계 grade 정하여 진료에 도움을 주고자 했던 GeneXpert system (Cepheid, Sunnyvale, CA)의자료[9, 12]를 토대로 새로운 장비의 도입이 아닌 기존에 사용하던 검사법을 반정량적으로 구분하여 진료에 도움을 주기 위한방향을 모색하였다.
- 결핵균 양의 측정을 통하여 각 검사법에 대한 검출 한계를 확인하고 항산균 도말검사의 검출 가능한 값과 CTM의 Ct값으로 반정량적 판정 기준을 설정하였다. 판정기준에 따라 본 연구에서 진행된 CTM 양성 검체의 Ct값과 항산균 도말검사 grade에 적용하여 유용성을 파악하였다.
- 결핵균 표준균주인 H37Rv를 6단계로 희석하여 AFB stain, 결핵 액체 배양 검사와 실시간 중합효소연쇄반응 CobasⓇ TaqManⓇ MTB (CTM; Roche Diagnostics, Basel, Switzer land)를 3회씩 진행하여 균의 검출 한계를 측정하고, 항산균 도말 검사와 CTM 값의 연관성으로 반정량 기준을 정하였다.
- 20분간 원심 분리하여 농축하였다. 농축된 침사는 항산균도말 검사 및 결핵균 배양 검사, 실시간 중합효소연쇄반응 검사에 사용하였다. 항산균 도말 검사는 형광염색(fluorochrome stain)으로 양성을 선별하고 Ziehl-Neelsen 염색법을 확인하였다.
- 동일한 검사실내에서 항산균 도말검사의 grade에 대해 예측되는 CTM의 Ct 값과 액체배양을 시행하여 세균의 양을 측정하고자 하였다. Bactec MGIT 960 system 이용하여 M.
- 반정량 기준을 2015년 삼성서울병원에서 보고된 양성 검체 135건을 대상으로 항산균 도말검사 등급과 CTM과의 연관성을 후향적 분석방법으로 유용성을 확인하였다.
- 배양과정에서 자란 균주는 Genedia MTB/NTM detection kit (Green Cross Medical Science Co., Yongin, Korea) 결핵균과 비정형 항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 으로 각각 확인하였다.
- 수행하였다. 양성 결과는 내부 정도관리 물질(internal quality control, IQC)의 양성표준물질의 Ct값과 비교했을 때 그 이하의 값을 양성, 그 이상의 Ct값인 경우 invalid로 판정하고, 측정 증폭 대상이 없는 경우 음성으로 판정하였다.
- 판정 기준을 설정하였다. 판정기준에 따라 본 연구에서 진행된 CTM 양성 검체의 Ct값과 항산균 도말검사 grade에 적용하여 유용성을 파악하였다.
- 항산균 도말 검사는 형광염색(fluorochrome stain)으로 양성을 선별하고 Ziehl-Neelsen 염색법을 확인하였다. 항산균 도말 염색 결과는 ATS/CDC guidelines 기준에따라 negative, trace 및 양성은 1+에서 4+까지 구분하는 6 grade 기준으로 판정하였다(Table 1) [13].
이론/모형
- 모든 임상 검체는 N-acetyl-L-cysteine-NaOH (NALC-NAOH) 방법을 이용하여 융화, 오염제거과정을 진행 후 3, 000 G로 20분간 원심 분리하여 농축하였다. 농축된 침사는 항산균도말 검사 및 결핵균 배양 검사, 실시간 중합효소연쇄반응 검사에 사용하였다.
- 농축된 침사는 항산균도말 검사 및 결핵균 배양 검사, 실시간 중합효소연쇄반응 검사에 사용하였다. 항산균 도말 검사는 형광염색(fluorochrome stain)으로 양성을 선별하고 Ziehl-Neelsen 염색법을 확인하였다. 항산균 도말 염색 결과는 ATS/CDC guidelines 기준에따라 negative, trace 및 양성은 1+에서 4+까지 구분하는 6 grade 기준으로 판정하였다(Table 1) [13].
- 항산균 도말검사 및 배양 검사 후 남은 침사를 CTM을 이용하여 핵산을 추출 과정을 거친 후 CobasⓇ TaqManⓇ 48 analyzer (Roche Diagnostic)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 양성 결과는 내부 정도관리 물질(internal quality control, IQC)의 양성표준물질의 Ct값과 비교했을 때 그 이하의 값을 양성, 그 이상의 Ct값인 경우 invalid로 판정하고, 측정 증폭 대상이 없는 경우 음성으로 판정하였다.
성능/효과
- Bactec 960 MGIT를 사용한 자동화 액체 배양 검사의 검출한계가 가장 적은 수의 결핵균을 검출할 수 있음을 다시 한 번 확인하고, 결핵균의 수와 TTP는 상관관계가 있음을 확인하였다.
- CTM 검사의 임계 값(Ct)값으로, 결핵균 검출방법의 반정량적판정기준을 설정 하였다. CTM 검사의 135개의 양성 표본에 대한 Ct값은 항산균 도말염색과 반비례적 상관관계가 있었다(rs= −0.545, P<0.01). CTM 검사와 항산균 염색 등급의 음의 상관관계가 입증되었으며, 임상 기준에 이러한 기준을 적용하여 임상적 의의를 검증하였다.
- tuberculosis H37Rv (CFU/mL)를 6단계로 희석하여 시행한 항산균 도말검사에서 각 단계별 10회씩 시행한 결과는 1×106에서 10/10 (100%); 1×105에서 10/10 (100%); 1×104에서 7/10 (70%); 1×103에서 3/10 (30%); 1×102에서 0/10 (0%); 1×101에서 0/10 (0%)으로 검출되었다. Cut-off를 산정을 위한 기준으로 정성검사의 양성 기준값인 50%를 적용하였을 때 항산균 도말검사의 결핵균의 최소검출농도가 1,000∼10, 000 CFU/mL에서 검출됨을 확인하였다 (Table 2, Figure 1).
- M. tuberculosis H37Rv (CFU/mL)를 6단계 희석한 세균액을 CTM test로 단계별 각 3회씩 진행하였으며, 모든 검사는양성을 확인하였고, 그에 따른 Ct 값(cycles)의 평균은 1×106 에서 31.4, 1×105에서 34.4, 1×104에서 38.2, 1×103에서 40.4, 1×102에서 44.3, 1×101에서는 검출되지 않았다. 본원기준 환자대상 검체의 결핵균 양성 Ct 판정 기준 25∼45 cycles 기준으로 비교했을 때 결핵균의 농도가 높을수록 Ct값이 낮음을 확인하였으며, CTM의 검출 최소 농도는 100 CFU/mL 임을확인하였다(Figure 3).
- M. tuberculosis H37Rv (CFU/mL)를 6단계로 희석하여 시행한 항산균 도말검사에서 각 단계별 10회씩 시행한 결과는 1×106에서 10/10 (100%); 1×105에서 10/10 (100%); 1×104에서 7/10 (70%); 1×103에서 3/10 (30%); 1×102에서 0/10 (0%); 1×101에서 0/10 (0%)으로 검출되었다. Cut-off를 산정을 위한 기준으로 정성검사의 양성 기준값인 50%를 적용하였을 때 항산균 도말검사의 결핵균의 최소검출농도가 1,000∼10, 000 CFU/mL에서 검출됨을 확인하였다 (Table 2, Figure 1).
- M. tuberculosis H37Rv (CFU/mL)를 6단계로 희석하여 액체 배지에 각각 3회씩 배양한 세균 액은 모두 배양되었으며, 평균 배양 소요일은 1×106에서 4.8일, 1×105에서 5.7일, 1×104에서 7.8일, 1×103에서 11.1일, 1×102에서 13.6일, 1×101에서 16.1일의 결과를 얻었다. 가장 낮은 농도인 10 CFU/mL에서 배양됨을 확인하였고 최소검출농도가 10 CFU/mL 이하에서 배양될 수 있음을 확인하였다(Figure 2).
- 1일의 결과를 얻었다. 가장 낮은 농도인 10 CFU/mL에서 배양됨을 확인하였고 최소검출농도가 10 CFU/mL 이하에서 배양될 수 있음을 확인하였다(Figure 2).
- 결핵균의 양 측정을 위한 검사법으로 항산균 도말검사는 검출 한계치가 1,000∼10, 000 CFU/mL를 확인하였고, 액체배지 배양법은 10 CFU/mL 이하에서도 가능하고, CTM test는 10∼100 CFU/mL의 검출한계를 확인하였다.
- 1%)의 분포를 보였다. 둘째, medium 35∼40 Ct값 기준에 해당하는 AFB gradee − (18.0%), ± (39.3%), 1+ (24.6%), 2+ (13.1%), 3+ (3.3%), 4+ (1.6%)의 분포를 보였다. 셋째, high ≤34 Ct 값 기준에 해당하는 항산균 도말검사 gradee − (3.
- Bactec 960 MGIT 장비를 이용하여 결핵균을 배양시킨 뒤 검출된 시점을 106 CFU/mL으로 진행을 하여 장비 검출 특성상 반비례적 측정으로 결핵균의 수의 측정오차가 발생할 수 있었다. 둘째, 결핵균 양의 측정을 위한 단계별 희석법에서 시행 횟수가 적어 전체를 대표할 수는 없으며, 항산균 도말검사의 한계점인 검사자의 숙련도와 검사실의 여러가지 특성에 의한 변수는 배제할 수 없다. 셋째, 임상환자 대상 결핵균 양성 검체 수가 작아(N=135), 낮은 양성 예측도를 나타낼 수 있다.
- 635)를 검증한 자료도 있었다[8]. 본 연구에서의 음의 상관 관계(rs=−0.545)는 PCR Cycle의 횟수가 많아 조금 높은 값을 나타내며, 해당 논문양성 건수(N=108)보다 양성 건수(N=135)가 더 많은 점에서 신뢰도가 높다[8].
- 3, 1×101에서는 검출되지 않았다. 본원기준 환자대상 검체의 결핵균 양성 Ct 판정 기준 25∼45 cycles 기준으로 비교했을 때 결핵균의 농도가 높을수록 Ct값이 낮음을 확인하였으며, CTM의 검출 최소 농도는 100 CFU/mL 임을확인하였다(Figure 3).
- 6%)의 분포를 보였다. 셋째, high ≤34 Ct 값 기준에 해당하는 항산균 도말검사 gradee − (3.8%), ± (15.4%), 1+ (15.4%), 2+ (19.2%), 3+ (7.7%), 4+ (38.5%)의 분포를 나타냈다.
- 둘째, 결핵균 양의 측정을 위한 단계별 희석법에서 시행 횟수가 적어 전체를 대표할 수는 없으며, 항산균 도말검사의 한계점인 검사자의 숙련도와 검사실의 여러가지 특성에 의한 변수는 배제할 수 없다. 셋째, 임상환자 대상 결핵균 양성 검체 수가 작아(N=135), 낮은 양성 예측도를 나타낼 수 있다.
- 우선 결핵균 검출을 위한 CTM test검사의 Ct값과 항산균 도말검사는 음의 상관관계(rs=−0.545)가 있음을 확인하였고, 결핵균 검출을 위한 3가지 검사법으로 검출 할 수 있는 한계를 측정하였으며, 항산균 도말검사와 PCR과의 균수의 검출기준으로 1×105∼6이상의 균수일 때 high (Ct<34), 1×103∼4 medium (35∼40), 1×101∼2 low (40∼47)로 반정량적인 결과를 보고에 대한 기준을 제시하였으며, Gene Xpert system 검사에서 항산균 도말검사 grade 빈도가 높은 기준으로 very low (negative 65.0%, scanty 20.6%), low (25.5%, scanty 19.3%), medium (1+ 21.9%, 2+ 22.7%, 3+ 49.1%), high (3+ 90.5%)의 보였고[8], 본 연구의 PCR 양성 대상 항산균 도말검사 grade을 비교 했을 때 low (negative 66.7%, trace 29.2%), medium (trace 39.3%, 1+ 24.6%), high (trace 15.4, 1+ 15.4%, 2+ 19.2%)의 grade별 분포기준을 확인했을 때 low, medium의 분포는 비슷하나 high에서의 비율이 골고루 분포가 되었으나 medium보다 높은 비율의 grade를 확인할 수 있었다.
- 첫째, Ogawa 배지에 배양된 M. tuberculosis H37Rv를 0.5 McFarland 농도로 측정을 시도하였으나 결핵균이 잘 균질화되지 않아 정확한 농도의 측정이 어려웠다. Bactec 960 MGIT 장비를 이용하여 결핵균을 배양시킨 뒤 검출된 시점을 106 CFU/mL으로 진행을 하여 장비 검출 특성상 반비례적 측정으로 결핵균의 수의 측정오차가 발생할 수 있었다.
- 6 grade 기준으로 판정하였다. 첫째, low 40∼47 Ct 값 기준에 해당하는 항산균 도말검사 gradee − (66.7%), ± (29.2%), 1+ (2.1%), 2+ (2.1%)의 분포를 보였다. 둘째, medium 35∼40 Ct값 기준에 해당하는 AFB gradee − (18.
- 항산균 도말검사의 검출한계 범위로 5,000∼10, 000 CFU/mL 를 측정했던 연구[16, 24]와 비슷한 결과로 1,000∼10, 000 CFU/mL의 값을 본 연구에서 확인하고, 또한 액체배지의 검출한계는 <10 CFU/mL 이하에서 가능하였고, CTM 검사의 검출한계는 46 CFU/mL의 연구 결과[23]에 비해 본 연구에서의 검출 한계는 100 CFU/mL로 비슷한 결과를 얻을 수 있었다.
후속연구
- CTM 검사와 항산균 염색 등급의 음의 상관관계가 입증되었으며, 임상 기준에 이러한 기준을 적용하여 임상적 의의를 검증하였다. 이 연구의 반정량적 기준은 병원에서활동성 결핵 및 감염을 일으킬 수 있는 환자의 빠른 진단의 판단에 도움이 될 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.