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문제 정의
- 이에 저자들은 결핵균을 신속하게 진단할 수 있는 각 PCR, LCR, PCR-Hybridization 검사법을 항산 성 염색 음성인 임상검체를 대상으로 결핵균 검출에 적용하여 배양법을 기준으로 민감도와 특이도를 구하고 그 임상적 유용성과 정도관리 등 결핵 검출의 표준 화된 방법에 대해 알아보고자 하였다.
- 최근에 개발된 LCR법 과 PCR-Hybridizatione PCR법 보다도 민감하게 결핵균을 검출할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이에 저자들은 항산균 배양을 기준으로 in house PCR, LCR 및 PCR-Hybridization 각각의 임상적 유용성 을 알아보고자 한다.
제안 방법
- 각각 10" molecule/reaction 이상되는 4개의 oligonucleotide probe, lunit 열내성 DNA polymerase, 14, 000 unit 이상의 열내성 DNA ligase, 각각 3 M 이상의 두 dNTPs, 15 M 이상의 nicotinamide adenine dinucleotide(NAD)7\ 들어있는 반응혼합 물(MTB amplification vial) 100 M에 DNA 추출 물 100 M을 가하여 94℃에서 1초, 64。(3에서 1초, 69 ℃ 에서 40초로 37주기를 Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer Medical Instruments, Pomona, Calif)을 이용하여 증폭시켰으며 매 실시 때마다 양성 대조와 음성 대조를 같이 실시하였다. 증폭된 산물은 LCx analyzer.
- 1998년 8월에 결핵진단을 위해 세브란스 병원 임상 병리과에 의뢰된 75검체를 대상으로 AFB 도말 염색 검사, 결핵균 배양 검사(3% Ogawa 배지, 8주간), in house PCR, LCR(Abbott LCx kit) 및 PCR- Hybridization을 시행하여 각각의 민감도와 특이도를 평가해보았다.
- 9必의 반응 산물에 loading dye 侦/L를 섞어 1.5% agarose gel에서 전기영동하였으며 ethidium bro- mide로 염색하여 UV transilluminator에서 반응 산 물을 확인하였다. Size marker.
- 객담 59 검체, bronchial washing 6 검체, 흉 막액 4 검체, 뇌척수액 2 검체, 소변 2 검체였고 복수, 기타 체액 1 검체씩이었다. 각각 PCR, LCR, PCR-hybridization 법을 시행하여 배양법을 기준으로 민감도와 특이도를 구하였다.
- 검체와 동량의 4% NaOH를 넣고 vortex로 충분히 섞은 후 실온에서 20분간 방치하여 오염을 제거하였고 3400 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물로 도말 슬라이드를 만들어 열판 위에서 고정시킨 후 Zeihl-Neelsen 항산성염색을 시행한 후 현미경으로 300시야 이상을 관찰하였다. 항산성 도말 염색법의 보고 방법은 WHO 보고 방법을 따랐다.
- 모든 재료는 Roche사의 AMPLICOR M. tuberculosis test kit( Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ, USA) 내에 포함된 것을 사용하였고 전 과정은 제조회사의 지시에 따라 시행하였는데 아래의 4단계로 나누어 실시하였다.
- 미리 가열된 heating나)lock에서 95℃, 20분간 처리 하여 비활성화 시킨 후 실온에서 10분간 방치한 다음 초음파 분쇄기 (Abbott, LCx Lysor)을 이용하여 결 핵균의 DNA를 분리하였다.
- ) 등으로 구성되어 있다. 반응 혼 합물 50心가 들어있는 시험관에 DNA추출이 된 검 체 50山를 가하여 98莒 에서 20초간 2주기 열변성 (dgaturation)하고 62C에서 20초간 결합(ar卜 nealing), 72P에서 45초간 연장航xte応ion)시킨 다음 94℃ 20초, 62℃ 20초, 75℃ 45초로 35주기 를 증폭시켰으며 검사 때마다 양성 및 음성 대조를 포 함시켰다 . 중합효소연쇄반응에 사용한 시발체는 Mycobacterium 16S ribosomal RNA 의 conserved region에 있는 genus specific DNA region 으로 584 bp였으며 이미 증폭된 반응산물의 오염으로 인한 위양성을 막기 위해서 AmpErase를 반웅 혼합 물에 첨가하였다.
- , USA)와 시발체 각 以L를 넣어 총 용량이 20 也가 되도록 하였다. 이 혼합액을 GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer, Foster City, CA., USA)을 이용하여 9¥C에서 2분간 처리한 후 다음 반응(94Q에서 10초, 65℃에서 10초, 72笔에서 15초)을 35회 반복하고 72℃에서 5분간 연장처리 하였다.
- 전 처리가 끝난 검체 100也를 50(也L의 세척액(tris -HC1 solution with 1% solubilizer)에 가하여 12, 500xg에서 10분 동안 원침한 후 상층 액을 버리고 100也 용해액(1% solubilizer, 0.4% NaOH)을 가하여 60'C에서 45분간 둔 다음 100如의 중화 용액 (tris-HCl solution)을 가하였다.
- 전 처리가 끝난 검체 100必를 500位의 세척액(tris -HC1 solution with 1% solubilizer)0]] 가하여 12, 500xg에서 10분 동안 원침한 후 상층 액을 버리고 10(成L용해액 (1 % solubilizer, 0.4% NaOH)을 가하여 60, C에서 45분간 둔 다음 10(也L 의 중화 용액 (tris-HCl sohition)을 가하였다.
- 항산성 도말 염색법에서와같이 만들어진 검체 침전물을 3% Ogawa 배지에 접종하여 37笆에서 배양하였으며 1주일 간격으로 관찰하여 8주간 배양 관찰하였다.
대상 데이터
- 1998년 8월 한달 동안 영동세브란스 병원을 방문하여. 항산균 검사가 의뢰된 외래환자 및 입원환자 중 항산성 염색이 음성인 62명으로부터 75 검체를 채취하였다.
- In house PCR에서는 항산균 배양양성 5 검 체 중 2 검체가 PCR양성이었고 3 검체는 PCR 음 성이었다. 배양음성 70 검체 중 PCR 양성인 검체는 1 검체였다. LCR에서는 배양양성 5 검체 중 4 검체 가 양성이었고 배양음성인 70 검체 중 LCR 양성은 4 검체였다.
- 시발체는 M. Mberc 恨Is代에 특이도를 보이는 IS6110 insertion sequence인 P1(5'-CCTGCGA- GCGTAGGCGTCGG-3')과 P2(5-CTCGTCCA- GCGCCGC TTCGG-3')4를 사용하여 증폭하였다. 반응 혼합액은 PCR 완충액(50 mM KC1, 2.
- 는 100 bp ladder (Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 크기를 비교하였다. 예상되는 반응 산물의 크기는 123bp이다.
- 반응 혼 합물 50心가 들어있는 시험관에 DNA추출이 된 검 체 50山를 가하여 98莒 에서 20초간 2주기 열변성 (dgaturation)하고 62C에서 20초간 결합(ar卜 nealing), 72P에서 45초간 연장航xte応ion)시킨 다음 94℃ 20초, 62℃ 20초, 75℃ 45초로 35주기 를 증폭시켰으며 검사 때마다 양성 및 음성 대조를 포 함시켰다 . 중합효소연쇄반응에 사용한 시발체는 Mycobacterium 16S ribosomal RNA 의 conserved region에 있는 genus specific DNA region 으로 584 bp였으며 이미 증폭된 반응산물의 오염으로 인한 위양성을 막기 위해서 AmpErase를 반웅 혼합 물에 첨가하였다.
- 추출된 DNA 의 증폭은 COBAS Amplicor™ (Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ, USA)을 이용하였고 반옹혼합물을 AmpliTaq(Taq polymerase), biotin이 부착된 시발체, nucleotides, uracil-N -glycosylase (AmpErese : Roche Molecular Systems, Inc.) 등으로 구성되어 있다. 반응 혼 합물 50心가 들어있는 시험관에 DNA추출이 된 검 체 50山를 가하여 98莒 에서 20초간 2주기 열변성 (dgaturation)하고 62C에서 20초간 결합(ar卜 nealing), 72P에서 45초간 연장航xte応ion)시킨 다음 94℃ 20초, 62℃ 20초, 75℃ 45초로 35주기 를 증폭시켰으며 검사 때마다 양성 및 음성 대조를 포 함시켰다 .
- 1998년 8월 한달 동안 영동세브란스 병원을 방문하여. 항산균 검사가 의뢰된 외래환자 및 입원환자 중 항산성 염색이 음성인 62명으로부터 75 검체를 채취하였다. 객담 59 검체, bronchial washing 6 검체, 흉 막액 4 검체, 뇌척수액 2 검체, 소변 2 검체였고 복수, 기타 체액 1 검체씩이었다.
이론/모형
- LCR 검사는 Abbott 사의 LCx kit( Abbott Laboratories, North Chicago, Ill)를 사용하여 제조사에서 제공한 사용지침에 따라 시행하였다. 구체적인 검사 시행 방법은 다음과 같다.
- 증폭된 산물은 LCx analyzer.를 이용충}■여 anti-capture hapten (izbbit) 으로 coatinge microparticle sandwich EIA 법으로 검출하였다.
- 검체와 동량의 4% NaOH를 넣고 vortex로 충분히 섞은 후 실온에서 20분간 방치하여 오염을 제거하였고 3400 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물로 도말 슬라이드를 만들어 열판 위에서 고정시킨 후 Zeihl-Neelsen 항산성염색을 시행한 후 현미경으로 300시야 이상을 관찰하였다. 항산성 도말 염색법의 보고 방법은 WHO 보고 방법을 따랐다.
성능/효과
- LCR에서는 배양양성 5 검체 중 4 검체 가 양성이었고 배양음성인 70 검체 중 LCR 양성은 4 검체였다. 그리고 PCR-Hybridiz&tion에서는 배양 양성 5 검체 모두에서 PCR-Hybridization 양성이었 고 배양음성 70 검체 중 4 검체에서 PCR-Hybri- dization 양성이었다, In house PCR, LCR, PCR- Hybridizatione] 민감도는 44 40%, 80%, 100% 였고, 특이도는 각각 98.6%, 94.3%, 94.3%였다 (「1匀비£2).
- 본 연구에서 결핵의 확진법인 결핵균 배양법을 기준으로 판단할 때 in hoouse PCR, LCR법및 PCR- Hybridization의 민감도는 각각 40%, 80%, 100% 로 in house PCR 법이 특이하게 낮았고 LCR 법과 PCR-Hybridizatione 다른 보고자들과 비슷한 결과를 보였다. 하지만 결핵균 배양양성이 5검체로 매우 작아서 배양양성 검체가 많을 경우 in house PCR의 경우 민감도가 향상될 것으로 생각된다.
- 하지만 결핵균 배양양성이 5검체로 매우 작아서 배양양성 검체가 많을 경우 in house PCR의 경우 민감도가 향상될 것으로 생각된다. 세가지 검사 모두에서 특이도는 98.6%, 94.3%, 94.3%로 모두 우수한 결과를 보였으며 다른 보고자들의 결과와 비슷 하였다.
- 이상의 결과에서 LCR 법과 PCR-Hybridizatione 결핵균 검출에 있어 우수한 민감도와 특이도 보여 신 속하게 진단할 수 있어 결핵의 조기진단에 유용할 것으로 사료되며 in house PCR 의 경우 민감도가 검체 수를 늘려 평가할 경우 민감도가 향상될 것으로 생각된다.
- 항산균 배양과 PCR-Hybridization 양성이 면서 LCR 및 in h이!蹌 PCR 음성인 검체가 1개였 고 항산균 배양음성이면서 in house PCR, LCR, PCR-Hybridization 양성인 검체가 1 개였다. 항산 균 배양, LCR, PCR-Hybridization 양성이면서 出 house PCR음성인 검체가 2개였고 항산균 배양과 in house PCR음성이면서 LCR 혹은 PCR-Hybridization 양성인 검체가 3개였다(Table 3).
- 항산균 배양법을 기준으로 판단할 때 in house PCR, LCR(Abbott LCx kit) 및 PCR-Hybridization의 민감도는 각각 40%, 80%, 100%였고 특이도는 98. 6%, 94.
후속연구
- LCR법과 PCR-Hybridizatione 결핵균 검출에 있어 우수한 민감도와 특이도를 보여 결핵의 조기진단에 유용할 것으로 사료된다.
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