[논문]구제역바이러스의 FMDV 2C 단백질은 소포체 스트레스를 통해서 염증 유도 사이토카인 TNFα의 발현을 증가시킴

강효린; 성미소; 나진주; 류소연; 구복경; 정재훈

doi:10.5352/jls.2020.30.3.285

[국내논문] 구제역바이러스의 FMDV 2C 단백질은 소포체 스트레스를 통해서 염증 유도 사이토카인 TNFα의 발현을 증가시킴
FMDV 2C Protein of Foot-and-mouth Disease Virus Increases Expression of Pro-inflammatory Cytokine TNFα via Endoplasmic Reticulum Stress 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.3, 2020년, pp.285 - 290

강효린 (부산대학교 분자생물학과) , 성미소 (부산대학교 분자생물학과) , 나진주 (농림축산검역본부 구제역진단과) , 류소연 (농림축산검역본부 구제역진단과) , 구복경 (농림축산검역본부 구제역진단과) , 정재훈 (부산대학교 분자생물학과)

초록
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구제역바이러스(FMDV)는 Picornaviridae 과의 Aphthovirus 속의 한 종류이며, 야생과 가축의 소와 돼지에 감염한다. FMDV는 감염 조직에서 중증의 염증반응을 포함한 다양한 임상적 증후들을 일으킨다. FMDV 게놈 RNA는 약 8.3 kb 길이의 양성-단일 가닥을 가지고 있으며, 하나의 긴 단백질 번역틀(ORF)을 만든다. 이 ORF는 바이러스의 단백질가수분해효소에 의해서 구조단백질과 비구조단백질로 나누어진다. FMDV의 FMDV 2C 단백질은 FMDV 유전자에서 만들어지는 비구조단백질로서 염증과 세포사를 포함한 FMD 병리 과정과 바이러스 복제에서 중요한 역할을 한다. 이 연구에서 우리는 FMDV 2C가 염증 유도 사이토카인인 tumor necrosis factor alpha (TNFα)의 세포내 발현을 유도하는 가능성을 검토하였다. FMDV 2C의 돼지 세포인 IBRS-2 세포내 발현은 TNFα의 유전자 발현 조절 부위인 프로모터의 활성화를 이용하여 전사수준에서 TNFα의 mRNA와 단백질 생성을 증가시켰다. 추가적으로, 소포체 스트레스를 감소시키는 화학물질인 4-phenylbutyric acid (4-PBA) 처리는 FMDV 2C에 의해 유도된 TNFα 발현을 감소시켰다. 소포체 스트레스 반응을 매개하는 전사인자의 한 종류인 ATF4는 TNFα 프로모터의 활성을 유도하고, TNFα의 mRNA와 단백질 발현을 증가시켰다. 하지만, ATF4의 기능 결핍 돌연변이체 단백질의 발현은 FMDV 2C에 의한 TNFα 생성을 유도하지 못하였다. 이들 결과들은 FMDV FMDV 2C 단백질이 ATF4-매개 TNFα 발현을 통해 임상적 염증반응을 증가시키고, 이는 소포체 스트레스의 유도와 연관되어있음을 제시한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a member of the genus Aphthovirus in the Picornaviridae family, affects wild and domesticated ruminants and pigs. FMDV causes various clinical symptoms, including severe inflammation in infected tissue. Genome RNA of FMDV shows a positive single-strand chain approximately 8.3 kb long and encodes a single long open reading frame (ORF). The ORF is translated into structural and non-structural proteins by viral proteases. The FMDV 2C protein is one of the non-structural proteins encoded by FMDV and plays a critical role in FMD pathogenesis, including inflammation, apoptosis, and viral replication. In this study, we examined whether FMDV 2C induces intracellular expression of pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha (TNFα). FMDV 2C expression in pig IBRS-2 cells increased mRNA and protein expression of TNFα at the transcriptional level via activation of TNFα promoter. Treatment with 4-phenylbutyric acid, an endoplasmic reticulum (ER) stress reducer, decreased TNFα expression induced by FMDV 2C. Activating transcription factor 4 (ATF4), a transcription factor mediating ER stress response, induced transactivation of TNFα promoter and expression of mRNA and protein of TNFα. However, the dominant negative mutant of ATF4 did not induce FMDV 2C-mediated TNFα expression. The results indicate that FMDV 2C protein increases clinical inflammation via ATF4-mediated TNFα expression and is associated with ER stress induction.

Keyword

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. FMDV FMDV 2C increases expression of pro-inflammatory cytokine TNFα.
그림 Fig. 2. ATF4 increases transcriptional activation and gene expression of TNFα.
그림 Fig. 3. FMDV 2C increases expression of TNFα and SDF-1α via ATF4 activation.

AI 본문요약
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가설 설정

이 결과는 소포체 스트레스가 FMDV 2C에 의한 TNFα 발현 유도에 연관되어있음을 가르킨다.

제안 방법

이 연구에서 FMDV의 FMDV 2C 발현이 염증 유도 사이토카인 TNFα의 발현 유도함을 확인하고 TNFα의 발현을 증가시키는 전사인자를 분석하였다.
FMDV 2C 또는 3B에 의한 TNFα 발현 유도는 TNFα 프로모터 활성으로 인한 luciferease 생성 차이로 측정하였다.
FMDV 2C 단백질이 염증 반응에 관여하는 사실을 알아보기 위해서, 염증 유도 사이토카인으로 알려진 TNFα의 발현을 조사하였다.
전체 RNA를 oligo–dT와 MMLV 역전사효소(Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 단일 가닥 cDNA로 변환시켰다.
luciferase 활성은 β-galactosidase 활성을 이용하여 유전자 도입 효율을 맞추었다.
세포들을 24-칸 배양 용기에 나누어서 배양하고 레포터 벡터와 β-galactosidase 발현 플라스미드를 각각 실험에 필요한 발현 플라스미드와 함께 세포 내에 도입하였다.
pCMV5-Myc-ATF4DN은 ATF4-full-F, 5’-CCT CTA GAA TGA CCG AAA TGA GCT TCC T-3’; ATF4-mutant-R, 5’-CGC CGC CGC TTC CAG GTA CCC AGT GGC TGC TGT CTT GTT TTG CTC-3’; ATF4-mutant-F, 5’-GGG TAC CTG GAA GCG GCG GCG GCG GAG CAG GAG GCT CTT ACT G GT-3’; ATF4-full-R, 5’-AAG GAT CCC TAG GGG ACC CTT TTC TTC CC-3’ 프라이머 세트로 PCR로 증폭하여 XbaI과 BamHI 제한효소 자리를 이용하여 pCMV5-Myc 벡터에 클로닝하여 제작하였다.
pCMV5-Myc-ATF4DN은 ATF4-full-F, 5’-CCT CTA GAA TGA CCG AAA TGA GCT TCC T-3’; ATF4-mutant-R, 5’-CGC CGC CGC TTC CAG GTA CCC AGT GGC TGC TGT CTT GTT TTG CTC-3’; ATF4-mutant-F, 5’-GGG TAC CTG GAA GCG GCG GCG GCG GAG CAG GAG GCT CTT ACT G GT-3’; ATF4-full-R, 5’-AAG GAT CCC TAG GGG ACC CTT TTC TTC CC-3’ 프라이머 세트로 PCR로 증폭하여 XbaI과 BamHI 제한효소 자리를 이용하여 pCMV5-Myc 벡터에 클로닝하여 제작하였다. 모든 plasmid들은 DNA 서열 분석을 통해서 확인하였다. 4-phenylbutyrate는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)으로 부터 구입하였으며, 유전자 도입을 위한 PolyFect, jetPEI/jetPRIME and Lipofectamine는 각각 Qiagen (Hilden, Germany), PolyPlus Transfection (New York, NY, USA)과 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입 하였다.
유전자 도입 24시간 후에 세포에 4-PBA를 12시간 동안 처리하였다. 유전자 도입 36시간 후에 세포들을 세포 용해완충액으로 용해시키고 luciferase 활성을 형광측정기를 이용하여 측정하였다. luciferase 활성은 β-galactosidase 활성을 이용하여 유전자 도입 효율을 맞추었다.
전체 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포와 동물 조직으로부터 분리하였다. 전체 RNA를 oligo–dT와 MMLV 역전사효소(Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 단일 가닥 cDNA로 변환시켰다.
전체 RNA를 oligo–dT와 MMLV 역전사효소(Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 단일 가닥 cDNA로 변환시켰다. real-time PCR의 반응 혼합물은 SYBR Green I에 맞는 LightCycler Fast DNA master mixture를 이용하여 준비하였다. PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다: ATF4 F, 5’-GGT CAG TCC CTC CAA CAA CAG C-3’; ATF4 R, 5’-GGA GTG GAG GAC AGG ACC CCT-3’; GAPDH F, 5’-GTG GTC TCC TCT GAC TTC AAC-3’; GAPDH R, 5’-TCT CTT CCT CTT GTG CTC TTG-3’.
세포는 PBS 완충액으로 씻고 용해시켜서 준비하였다. 단백질 농도는 BSA를 비교 군으로 하여 Bradford 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 결정하였다. 동량의 단백질들을 SDSPAGE에서 분리하여 젤은 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막 (Millipore)으로 이동시켰다.
FMDV 2C와 3B 발현 유전자를 세포 내에 도입한 후 ATF4와 TNFα의 발현 차이를 측정하였다.
Fig. 1B에 보듯이, 소포체 스트레스 매개 인자인 Xbox-binding protein 1 (XBP1), ATF4, activating transcription factor 6 (ATF6)와 CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein (CHOP)의 유전자들의 세포내 발현 벡터들을 TNFα 프로모터 레포터 유전자와 함께 세포 내로 도입하였다.
FMDV 2C 단백질이 소포체에 존재하고, FMDV 감염세포 에서 소포체 스트레스 발생이 알려져 있고 TNFα 발현도 소포체 스트레스 반응과 연관이 있기 때문에, 다음 실험으로 TNFα 의 전사 활성을 담당하는 소포체 스트레스 세포 인자를 탐색 하였다.
TNFα의 발현 유도에 소포체 스트레스가 관여할 수 있는 가능성을 검토하기 위하여, 세포에 단백질 폴딩을 도와주는 4-PBA를 처리하였다.
ATF4가 TNFα 발현 유도에 기능하는 가능성을 검증하기 위하여 ATF4에 의한 TNFα 프로모터 활성화를 위한 luciferase 레포터 분석 실험을 시도 하였다.
TNFα 발현 유도를 위한 FMDV 2C와 ATF4의 기능적 연합을 증명하기 위해서, FMDV 2C와 ATF4 세포내 mRNA와 단백질 발현을 각각의 유전자들을 세포 내에 도입한 후에 RT-PCR 과 Western blot 분석을 수행하였다.
TNFα 전사 활성에 전사 조인자(coactivator)들의 기능이 알려져 있기 때문에, ATF4와 여러 전사조인자의 상호작용이 TNFα 발현에 미치는 영향을 분석하였다.
ATF4가 TNFα의 전사 활성을 조절하는 전사인장로서의 기능을 검토하기 위하여 ATF4의 발현 유전자를 세포 내로 도입한 후 TNFα 프로모터의 활성화를 luciferase 생성으로 측정하였다(Fig. 2A).
TNFα 이외의 다른 종류의 염증 유도 chemokine인 SDF-1α의 발현도 함께 분석하였다.
mRNA 생성 효과와 더불어서 TNFα와 SDF-1α 단백질의 발현 효과도 확인하였다.

대상 데이터

모든 plasmid들은 DNA 서열 분석을 통해서 확인하였다. 4-phenylbutyrate는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)으로 부터 구입하였으며, 유전자 도입을 위한 PolyFect, jetPEI/jetPRIME and Lipofectamine는 각각 Qiagen (Hilden, Germany), PolyPlus Transfection (New York, NY, USA)과 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입 하였다. 그 외의 시약들은 Sigma (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다.
돼지 신장상피세포주인 IBRS-2는 농림축산검역본부(김천, 대한민국)에서 얻었으며 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지를 이용하여 37℃과 5% CO 2 조건에서 배양하였다. 돼지의 FMDV 감염 조직도 농림축산검역본부에서 같은 돼지의 비감염조직과 함께 받아서 실험에 이용하였다.
돼지 신장상피세포주인 IBRS-2는 농림축산검역본부(김천, 대한민국)에서 얻었으며 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지를 이용하여 37℃과 5% CO 2 조건에서 배양하였다. 돼지의 FMDV 감염 조직도 농림축산검역본부에서 같은 돼지의 비감염조직과 함께 받아서 실험에 이용하였다.
이에 대한 보강 실험으로서 ATF4의 DNA 결합 영역 (294RYRQKKR300 –> 294GYLEAAA300)에서 6개 아미노산을 치환한 ATF4-비활성화 단백질(ATF4 DN)을 이용하였다.

데이터처리

통계적 분석은 엑셀 프로그램을 이용하여 unpaired 또는 paired t test로 수행하였다. 모든 실험결과들은 ±SD로 나타내었고, P 값은 <0.

이론/모형

ATF4와 TNFα의 단백질 생성 증가는 Western blot 실험을 통하여 확인하였다(Fig. 1D).

성능/효과

Fig. 1A에서 보듯이, 다른 2개의 FMDV에서 유래한 FMDV 2C 유전자의 도입은 TNFα 프로모터의 활성을 증가시킨 반면, 3B 발현은 TNFα 전사 활성 증가 효과가 거의 없었다.
그 결과로서 ATF4 전사인자가 가장 높게 TNFα 전사 활성을 증가시켰다.
그 결과, 4-PBA 처리는 FMDV 2C 에 의해서 증가한 TNFα 발현을 감소시킴을 보여주었다(Fig.1A).
그 결과로서 ATF4 전사인자가 가장 높게 TNFα 전사 활성을 증가시켰다. 이 결과를 토대로, Fig. 1C에서는 FMDV 2C가 ATF4의 발현을 유도하는 가능성을 확인하였다. FMDV 2C와 3B 발현 유전자를 세포 내에 도입한 후 ATF4와 TNFα의 발현 차이를 측정하였다.
Fig. FMDV 2C에 보듯이, 전사조인자인 CBP와 SRC1의 발현은 그 자체로는 TNFα의 전사 활성에 큰 영향이 없지만, ATF4와 함께 발현되었을 시 증가효과는 있는 것을 알 수 있었다.
세포 내에 ATF4를 과다 발현 시켰을 때 TNFα의 mRNA 생성이약 5배 증가함을 알 수 있었다.
이 연구의 결과들은 FMDV 2C의 발현이 소포체 스트레스를 매개하는 전사인자인 ATF4의 활성화를 유도하고 ATF4가 염증 유도 사이토카인 TNFα의 발현을 증가시킴으로써 FMDV 감염이 보이는 염증 증후를 발생시킴을 제시한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	구제역바이러스의 혈청형은 무엇이 있는가?	구제역바이러스(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)는 소와 돼지 등의 가축에서 심각한 질환을 일으키는 바이러스로서 Picornaviridae 과의 Aphthovirus 속에 분류가 된다. FMDV 는 항원변이성과 유전자 변이가 높은 빈도로 발생하여 현재 7개의 혈청 형(A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2와 SAT3)을 가지고 있다[1]. DNA 서열 분석의 발달은 FMDV의 유전형과 표현형 변이체의 증가함을 보여주고 있다[4].
	소포체 스트레스는 어떻게 유도되는가?	소포체는 칼슘이온의 저장, 지질 생성, 단백질 접힘의 촉진, 그리고 합성한 단백질의 수송 등 많은 중요한 기능들을 수행 한다. 소포체 스트레스는 정상적으로 접힌 구조를 가지지 않는 단백질 응집의 축적이나 바이러스 감염 등에 의한 과다하게 생성된 단백질들에 의해서 유도된다[8]. 소포체 스트레스는 신경 퇴행성 질환, 당뇨병, 동맥경화, 염증 질환, 심장 질환, 그리고 신장 질환 등 많은 질병들의 발생과 관련되어있다.
	FMD는 어떤 병징을 보이는가?	DNA 서열 분석의 발달은 FMDV의 유전형과 표현형 변이체의 증가함을 보여주고 있다[4]. FMD는 급성 발열 반응과 입과 발에 수포의 형성이 보이며 임상 조직 부위에서 현저한 염증반응이 발생하는 특징을 나타낸다[2].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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