팔미지황탕(八味地黃湯)의 ROS 생성 및 p53 활성 조절을 통한 시스플라틴 신장독성 완화효과 Palmijihwang-tang Alleviates Cisplatin-induced Nephrotoxicity through Inhibiting ROS Production and p53 Activation원문보기
Palmijihwang-tang is an herbal formula frequently used to treat many symptoms, such as lumbago, pollakiuria, cold hands and feet, nephritis, sterilitas virilis, and prostatic disorders. The aim of this study was to investigate the effects of Palmijihwang-tang on cisplatin-induced nephrotoxicity in r...
Palmijihwang-tang is an herbal formula frequently used to treat many symptoms, such as lumbago, pollakiuria, cold hands and feet, nephritis, sterilitas virilis, and prostatic disorders. The aim of this study was to investigate the effects of Palmijihwang-tang on cisplatin-induced nephrotoxicity in rat kidney proximal tubular NRK-52E cells. NRK-52E cells were treated with Palmijihwang-tang in absence or presence of 30 µM cisplatin for 12 or 24 h. Palmijihwang-tang at concentrations of 50-800 ㎍/ml did not change the cell viability in NRK-52E cells, and showed no significant toxicity. Palmijihwang-tang at concentrations of 400 and 800 ㎍/ml significantly increased the cell viability and reduced apoptotic cells in NRK-52E cells exposed to cisplatin. Also, Palmijihwang-tang markedly inhibited cisplatin-induced caspase-3 activation, PARP cleavage, ROS production and p53 activation in NRK-52E cells. Furthermore, Palmijihwang-tang did not interfere with the antitumor activity of cisplatin in AGS and A549 cancer cells. Particularly, Palmijihwang-tang enhanced antitumor activity of cisplatin in A549 cells. Taken together, these results suggest that Palmijihwang-tang ameliorated cisplatin-induced nephrotoxicity through reduction of ROS production and p53 activation, and did not interrupt antitumor efficacy of cisplatin against cancer cells.
Palmijihwang-tang is an herbal formula frequently used to treat many symptoms, such as lumbago, pollakiuria, cold hands and feet, nephritis, sterilitas virilis, and prostatic disorders. The aim of this study was to investigate the effects of Palmijihwang-tang on cisplatin-induced nephrotoxicity in rat kidney proximal tubular NRK-52E cells. NRK-52E cells were treated with Palmijihwang-tang in absence or presence of 30 µM cisplatin for 12 or 24 h. Palmijihwang-tang at concentrations of 50-800 ㎍/ml did not change the cell viability in NRK-52E cells, and showed no significant toxicity. Palmijihwang-tang at concentrations of 400 and 800 ㎍/ml significantly increased the cell viability and reduced apoptotic cells in NRK-52E cells exposed to cisplatin. Also, Palmijihwang-tang markedly inhibited cisplatin-induced caspase-3 activation, PARP cleavage, ROS production and p53 activation in NRK-52E cells. Furthermore, Palmijihwang-tang did not interfere with the antitumor activity of cisplatin in AGS and A549 cancer cells. Particularly, Palmijihwang-tang enhanced antitumor activity of cisplatin in A549 cells. Taken together, these results suggest that Palmijihwang-tang ameliorated cisplatin-induced nephrotoxicity through reduction of ROS production and p53 activation, and did not interrupt antitumor efficacy of cisplatin against cancer cells.
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문제 정의
그러나 八味地黃湯의 시스플라틴 신장독성에 대한 완화 효과가 시스플라틴의 항암활성을 저해하는 효과를 나타낼 수 있기 때문에 八味地黃湯이 시스플라틴의 항암 활성에 어떤 영향을 주는지 조사하였다. AGS 위암세포와 A549 폐암세포는 八味地黃湯 물 추출물을 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도로 1시간 전처리 후, 40 μ M 농도의 시스플라틴을 24시간 처리하여 caspase-3의 활성 및 발현과 PARP 절편화를 분석하였다.
그러나 신장 기능이상 및 신부전에 대해 우수한 신장보호 효과를 나타내는 八味地黃湯은 시스플라틴의 신장독성에 미치는 효과에 대해선 현재까지 알려지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 八味地黃湯이 시스플라틴에 의해 유도된 NRK-52E 신장세포의 손상에 미치는 영향을 평가하기 위하여 독성이 거의 없는 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도의 八味地黃湯 물 추출물과 시스플라틴을 NRK-52E 세포에 병용 처리하여 세포생존율, Sub-G1 세포수, caspase-3 활성, PARP 절편화의 변화를 관찰하였다. 시스플라틴만 처리한 세포에서 현저한 세포생존율 감소 및 Sub-G1 세포수 증가와 caspase-3 활성 및 PARP 절편화 증가가 관찰되었지만, 八味地黃湯 물추출물에 의하여 시스플라틴에 의해 감소한 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로써 sub-G1 세포 수의감소가 확인되었으며, 시스플라틴의 아폽토시스 유도에 따른 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화 증가는 八味地黃湯 물 추출물에 의해 감소하는 것이 확인되었다.
따라서 항암제의 부작용을 경감시키면서 화학요법의 항암효능을 저해시키지 않는 항암 보조제의 개발하는 것이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서는 종양세포에서 八味地黃湯이 시스플라틴의 항암 활성에 미치는 효과를 평가하기 위해 AGS 위암세포 및 A549 폐암 세포를 이용하여 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화의 변화를 관찰하였다. 양쪽 AGS 위암세포와 A549 폐암세포에서 시스플라틴에 의해 유도된 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화는 八味地黃湯 물추출물에 의해 감소하는 것이 관찰되지 않았으며, 특히 A549 폐암세포에서는 八味地黃湯 물추출물이 시스플라틴에 의해 증가한 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화보다 더욱 증가하는 것이 관찰되었다.
따라서 본 연구에서는 항암제 부작용을 완화하는 효능을 가진 熟地黃을 군약으로 하는 처방 중 신장보호 효과를 나타내는 八味 地黃湯 물추출물을 제조하여 시스플라틴으로 유도한 정상 쥐 신장 세포주인 NRK-52E 세포의 신장독성에 대한 보호 효능을 분석하였고, AGS 위암세포 및 A549 폐암세포에서 시스플라틴 항암 활성에 대한 효과를 분석하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구는 腎陽虛證의 한방방제로 사용되는 八味地黃湯을 이용하여 시스플라틴의 신장독성에 대한 완화 효과를 규명하고자 하였다. 八味地黃湯 물추출물은 시스플라틴 처리된 NRK-52E 신장 세포에서 ROS 생성 및 p53 활성을 감소시켜 신장독성을 완화했으며, AGS 위암세포 및 A549 폐암세포에서 시스플라틴의 항암 활성을 방해하지 않았다.
따라서 산화적 스트레스 감소는 시스플라틴에 의해 유도된 신장독성을 완화하는 효과적인 전략으로 제시되고 있다. 본 연구에서는 八味地黃湯 물 추출물이 시스플라틴에 의해 유도되는 ROS 생성과 p53 활성 및 발현에 미치는 효과를 평가하기 위해 ROS 생성량과 p53 인산화 및 총발현량을 분석하였다. NRK-52E 신장세포에서 시스플라틴에 의해 유도된 ROS 생성은 八味地黃湯 물추출물에 의해 유의적으로 감소하는 것이 관찰되었으며, 八味地黃湯 물추출물의 p53 인산화 억제에 따른 p53의 총발현량이 감소하는 것이 확인되었다.
가설 설정
Fig. 2. The effects of Palmijihwang-tang on cisplatin-induced apoptosis in NRK-52E cells. The cells were treated with 400 and 800 μ g/ml Palmijihwang-tang (PMJHT) in the absence or presence of 30 μM cisplatin for 24 h.
제안 방법
그러나 八味地黃湯의 시스플라틴 신장독성에 대한 완화 효과가 시스플라틴의 항암활성을 저해하는 효과를 나타낼 수 있기 때문에 八味地黃湯이 시스플라틴의 항암 활성에 어떤 영향을 주는지 조사하였다. AGS 위암세포와 A549 폐암세포는 八味地黃湯 물 추출물을 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도로 1시간 전처리 후, 40 μ M 농도의 시스플라틴을 24시간 처리하여 caspase-3의 활성 및 발현과 PARP 절편화를 분석하였다. 八味地黃湯 물추출물은 AGS 위암 세포 및 A549 폐암세포에서 시스플라틴에 의해 유도된 caspase-3 활성과 PARP 절편화를 감소시키지 않았다(Fig.
4)로 2회 세척하여 1 ml의 PI (10 μg/ml)/RNase A (100 μ g/ml) 용액으로 재부유시켜 37℃에서 암실 조건으로 1시간 배양하였다. DNA 양은 FACS-Calibur (BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 세포주기는 CellQuest Pro (BD Biosciences, CA, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
八味地黃湯 물추출물에 대한 NRK-52E 신장세포에 대한 세포 생존율 및 세포독성을 평가하기 위해 세포는 24 well 플레이트에 24시간 전배양 후, 八味地黃湯 물추출물을 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도로 24시간 처리하여 MTT 환원검사와 LDH 활성검사를 실시하였다. 八味地黃湯 물추출물은 NRK-52E 신장세포의 세포 생존율에 대해 대조군과 비교하여 유의적인 감소를 나타내지 않았으며(Fig.
八味地黃湯 물추출물에 대한 세포독성을 측정하기 위해 lactose dehydrogenase (LDH) cytotoxicity assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 세포는 24 well 플레이트에 24시간 전배양 후, 八味地黃湯 물추출물을 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도로 24시간 처리하였다.
제조사의 방법에 따라 각각의 샘플배지 50 μl와 Reacture Mixture 용액 50 μl를 혼합하여 암실 조건에서 30분간 방치시킨 후, 50 μl의 Stop 용액을 첨가하여 반응을 종료하였다. 그 후 SpectraMAX 250 microplate spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 490 nm와 680 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 다음과 같이 계산하여 백분율(%)로 나타내었다.
24). 따라서 八味地黃湯 물추출물의 시스플라틴 신장독성에 대한 억제 효과가 ROS 생성 및 p53 활성과 연관되어 있는지 조사하기 위해 NRK-52E 세포는 八味地黃湯 물추출물을 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도로 1시간 전저리 후, 30 μM 농도의 시스플라틴을 12시간 처리하여 ROS 생성과 p53의 인산화 및 발현을 분석하였다. 시스플라틴만 처리한 세포에서 ROS 생성은 1.
05% Tween-20)으로 비특이 결합을 차단시킨 후, 1차 항체(1:1000)를 결합시켰다. 면역 활성은 peroxidase가 붙어있는 anti-rabbit 또는 anti-mouse 2차 항체(1:2000)를 사용하여 SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)에 의해 탐지하였고, FluorChem E System (ProteinSimple, San Jose, CA, USA)을 이용하여 이미지화하였다. 특정단백질 밴드의 강도는 Quantity One 4.
방법을 이용하여 측정하였다. 세포는 24 well 플레이트에 24 시간 전배양 후, 八味地黃湯 물추출물을 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도로 24시간 처리하였다. 0.
방법을 이용하여 측정하였다. 세포는 24 well 플레이트에 24 시간 전배양 후, 八味地黃湯 물추출물을 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도로 24시간 처리하였다. 0.
DNA 양은 FACS-Calibur (BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 세포주기는 CellQuest Pro (BD Biosciences, CA, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
시스플라틴에 의한 NRK-52 신장세포의 세포사멸에 대한 八味 地黃湯의 효과를 조사하기 위해 NRK-52E세포는 八味地黃湯 물 추출물을 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도로 1시간 전저리 후, 30 μM 농도의 시스플라틴을 24시간 처리하였다. MTT 환원 검사를 통한 세포 생존율 측정 결과에서 八味地黃湯 물추출물은 시스플라틴에 의해 감소된 세포생존율을 증가시켰다(Fig.
세포는 24 well 플레이트에 24시간 전배양 후, 八味地黃湯 물추출물을 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도로 24시간 처리하였다. 제조사의 방법에 따라 각각의 샘플배지 50 μl와 Reacture Mixture 용액 50 μl를 혼합하여 암실 조건에서 30분간 방치시킨 후, 50 μl의 Stop 용액을 첨가하여 반응을 종료하였다. 그 후 SpectraMAX 250 microplate spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 490 nm와 680 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
Halt protease&phosphatase inhibitor cocktail와 RIPA lysis buffer 등은 Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA) 로부터 구입하였다. Anti-cleaved caspase-3, anti-PARP, anti-p53, anti-phospho-p53 (Ser15) 등의 항체들은 Cell Signaling Technology INC. (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다.
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride), 2’, 7’-Dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA), dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), propidium iodine (PI), ribonuclease A (RNase A), anti-β-actin 항체 등은 Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Halt protease&phosphatase inhibitor cocktail와 RIPA lysis buffer 등은 Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA) 로부터 구입하였다.
Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Halt protease&phosphatase inhibitor cocktail와 RIPA lysis buffer 등은 Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA) 로부터 구입하였다. Anti-cleaved caspase-3, anti-PARP, anti-p53, anti-phospho-p53 (Ser15) 등의 항체들은 Cell Signaling Technology INC.
NRK-52E, AGS, A549 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로 부터 분양받았고, 10% FBS (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin이 포함된 DMEM 배지 및 F-12K 배지(Gibco/Thermo Fisher Scientific, Inc., Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃와 5% CO2 상태에서 배양하였다. 세포는 1×105 cells/ml로 seeding 하여 24시간 전배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 및 F-12K 배지에서 八味地黃湯 물 추출물과 함께 시스플라틴을 처리하였다.
본 실험에 사용한 八味地黃湯의 구성약재인 熟地黃, 山藥, 山 茱萸, 白茯苓, 澤瀉, 牧丹皮, 肉桂, 炮附구는 인삼당제약(목포, 한국)에서 구입한 후 정선하여 사용하였고, 八味地黃湯의 구성 약재는 漢代 張仲景의 『金匱要略』에 준하였으며, 총 1첩 분량 54g을 사용하였다(Table 1).
데이터처리
Values are means ± SD, N = 3. The statistically significant differences compared with cisplatin-treated cells were calculated by Student’s t-test. *p<0.
(B) Apoptotic cells were quantified by flow cytometry following staining with propidium iodide. Values are means ± SD, N = 3. The statistically significant differences compared with cisplatin-treated cells were calculated by Student’s t-test. *p<0.
모든 데이터의 결과는 그래프패드 프리즘 6(La Jolla, CA) 프로그램을 통하여 통계처리 하여 mean±standard deviation (SD) 로 기록하였다. 실험군간의 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해 분석하였으며, p<0.
기록하였다. 실험군간의 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해 분석하였으며, p<0.05의 경우에서 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
Caspase-3 활성측정은 Colorimetric caspase-3 assay kit를 이용하여 측정하였다. 제조사의 방법에 따라서 세포용해물을 추출하였고, Bradford 검사법을 이용하여 단백질농도를 측정하였다.
八味地黃湯 물추출물에 대한 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT 방법을 이용하여 측정하였다. 세포는 24 well 플레이트에 24 시간 전배양 후, 八味地黃湯 물추출물을 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도로 24시간 처리하였다.
4)로 세척하고, 1% halt protease&phosphatase inhibitor cocktail이 포함된 RIPA lysis buffer로 부유시킨 후 얼음 위에서 30분간 용해하였다. 세포용 해물들은 4℃에서 14, 000 rpm으로 15분간 원심분리하였고, 단백질농도는 Bradford 검사법을 이용하여 측정하였다. 총 40 μg의 단백질 샘플을 SDS-PAGE 젤로 분리하였고, 40V에서 3시간 nitrocellulose막 위로 단백질을 전이시켰다.
측정하였다. 제조사의 방법에 따라서 세포용해물을 추출하였고, Bradford 검사법을 이용하여 단백질농도를 측정하였다. 50 μl의 세포용해물(총 50 μg의 단백질)과 50 μl의 2× Reaction buffer 및 5 μl의 4 mM DEVD-p-NA substrate를 혼합하여 3 7℃에서 1시간 배양하였다.
활성산소종(ROS)는 DCFH-DA fluorescence assay에 의해 측정하였다. NRK-52E 세포는 HBSS (pH 7.
성능/효과
본 연구에서는 八味地黃湯 물 추출물이 시스플라틴에 의해 유도되는 ROS 생성과 p53 활성 및 발현에 미치는 효과를 평가하기 위해 ROS 생성량과 p53 인산화 및 총발현량을 분석하였다. NRK-52E 신장세포에서 시스플라틴에 의해 유도된 ROS 생성은 八味地黃湯 물추출물에 의해 유의적으로 감소하는 것이 관찰되었으며, 八味地黃湯 물추출물의 p53 인산화 억제에 따른 p53의 총발현량이 감소하는 것이 확인되었다. 따라서 이 결과들은 八味地黃湯 물추출물이 시스플라틴 처리된 NRK-52E 세포에서 ROS 생성과 p53의 활성 및 발현 감소를 통해 신장독성을 완화한다는 것을 제시하고 있으며, 八味地黃湯 물추출물의 p53의 활성 및 발현 감소 효과는 ROS 생성 억제와 관련되어 있을 것으로 판단되고 있다.
3A). p53 인산화 및 총발현량 분석에서도 시스플라틴에 의한 p53의 인산화 수준(12배) 및 총발현 수준(4.5배)이 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도에서 p53 인산화는 각각 8.8배와 7.4배로 감소하였으며, p53 총발현은 3.2배와 2.7 배로 감소하였다(Fig. 3B).
실시하였다. 八味地黃湯 물추출물은 NRK-52E 신장세포의 세포 생존율에 대해 대조군과 비교하여 유의적인 감소를 나타내지 않았으며(Fig. 1A), LDH 활성에서도 八味地黃湯 물추출물의 농도증가에 따른 NRK-5E 신장세포의 세포독성 증가가 나타나지 않았다 (Fig. 1B).
시스플라틴만 처리한 세포에서 현저한 세포생존율 감소 및 Sub-G1 세포수 증가와 caspase-3 활성 및 PARP 절편화 증가가 관찰되었지만, 八味地黃湯 물추출물에 의하여 시스플라틴에 의해 감소한 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로써 sub-G1 세포 수의감소가 확인되었으며, 시스플라틴의 아폽토시스 유도에 따른 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화 증가는 八味地黃湯 물 추출물에 의해 감소하는 것이 확인되었다. 따라서 이 결과들은 八味 地黃湯 물추출물이 시스플라틴에 의해 유도된 NRK-52E 신장 세포의 아폽토시스를 효과적으로 억제함으로써 신장독성을 완화 시킬 수 있다는 것을 제시하고 있다.
NRK-52E 신장세포에서 시스플라틴에 의해 유도된 ROS 생성은 八味地黃湯 물추출물에 의해 유의적으로 감소하는 것이 관찰되었으며, 八味地黃湯 물추출물의 p53 인산화 억제에 따른 p53의 총발현량이 감소하는 것이 확인되었다. 따라서 이 결과들은 八味地黃湯 물추출물이 시스플라틴 처리된 NRK-52E 세포에서 ROS 생성과 p53의 활성 및 발현 감소를 통해 신장독성을 완화한다는 것을 제시하고 있으며, 八味地黃湯 물추출물의 p53의 활성 및 발현 감소 효과는 ROS 생성 억제와 관련되어 있을 것으로 판단되고 있다.
양쪽 AGS 위암세포와 A549 폐암세포에서 시스플라틴에 의해 유도된 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화는 八味地黃湯 물추출물에 의해 감소하는 것이 관찰되지 않았으며, 특히 A549 폐암세포에서는 八味地黃湯 물추출물이 시스플라틴에 의해 증가한 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화보다 더욱 증가하는 것이 관찰되었다. 따라서 이 결과들은 八味地黃湯이 시스플라틴의 항암 활성을 저해하지 않으면서 신장독성을 완화할 수 있다는 것을 제시하고 있다.
4A). 또한, A549 페암세포의 caspase-3 및 PARP 절편 화 분석에서도 시스플라틴만 처리한 세포의 cleaved caspase-3 발현수준(33.8배)과 cleaved PARP 발현수준(15.2배)이 400 μg/ml 농도의 八味地黃湯 물추출물에서는 각각 36.6배와 17.2배로 증가하였으며, 800 μg/ml 농도의 八味地黃湯 물추출물에서는 각각 38.5배와 20.3배로 증가하였다(Fig. 4B).
4%로 아폽토시스 세포 비율을 유의적으로 감소시켰다. 또한, 시스플라틴에 의해 증가한 caspase-3 활성은 八味地黃湯 물추출물에 의해 감소하였으며, 시스플라틴만 단독처리한 세포의 caspase-3 활성(777.5%)과 비교하여 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도의 八味地黃湯 물추출물에서 각각 475.6%와 259.1%로 유의하게 caspase-3 활성이 감소하였다 (Fig. 2C). Caspase-3 단백질 발현분석에서도 caspase-3 활성 분석 결과와 동일하게 cleaved caspase-3 발현이 八味地黃湯 물 추출물에 의해 감소하였으며, caspase-3 활성에 의한 PARP 절편화에서도 八味地黃湯 물추출물은 시스플라틴에 의해 증가한 cleaved PARP 발현을 감소시켰다(Fig.
따라서 八味地黃湯 물추출물의 시스플라틴 신장독성에 대한 억제 효과가 ROS 생성 및 p53 활성과 연관되어 있는지 조사하기 위해 NRK-52E 세포는 八味地黃湯 물추출물을 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도로 1시간 전저리 후, 30 μM 농도의 시스플라틴을 12시간 처리하여 ROS 생성과 p53의 인산화 및 발현을 분석하였다. 시스플라틴만 처리한 세포에서 ROS 생성은 1.7배 증가하였지만, 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도의 八味地黃湯 물추출물에서 각각 1.3배와 1.1배로 유의하게 감소하였다(Fig. 3A). p53 인산화 및 총발현량 분석에서도 시스플라틴에 의한 p53의 인산화 수준(12배) 및 총발현 수준(4.
따라서 본 연구에서는 八味地黃湯이 시스플라틴에 의해 유도된 NRK-52E 신장세포의 손상에 미치는 영향을 평가하기 위하여 독성이 거의 없는 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도의 八味地黃湯 물 추출물과 시스플라틴을 NRK-52E 세포에 병용 처리하여 세포생존율, Sub-G1 세포수, caspase-3 활성, PARP 절편화의 변화를 관찰하였다. 시스플라틴만 처리한 세포에서 현저한 세포생존율 감소 및 Sub-G1 세포수 증가와 caspase-3 활성 및 PARP 절편화 증가가 관찰되었지만, 八味地黃湯 물추출물에 의하여 시스플라틴에 의해 감소한 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로써 sub-G1 세포 수의감소가 확인되었으며, 시스플라틴의 아폽토시스 유도에 따른 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화 증가는 八味地黃湯 물 추출물에 의해 감소하는 것이 확인되었다. 따라서 이 결과들은 八味 地黃湯 물추출물이 시스플라틴에 의해 유도된 NRK-52E 신장 세포의 아폽토시스를 효과적으로 억제함으로써 신장독성을 완화 시킬 수 있다는 것을 제시하고 있다.
2A). 시스플라틴을 처리한 세포에서 八味地黃湯 물추출물은 시스플라틴만 처리한 세포의 세포 생존율(48.2%)과 비교하여 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도에서 각각 68.3%와 79.0%로 세포생존율을 유의하게 증가시켰다. 유세포분석을 통한 아폽토시스 세포비율 정도에서도 八味地黃湯 물 추출물은 시스플라틴에 의해 증가된 아폽토시스 세포수(Sub-G1 peak) 를 감소시켰으며(Fig.
따라서 본 연구에서는 종양세포에서 八味地黃湯이 시스플라틴의 항암 활성에 미치는 효과를 평가하기 위해 AGS 위암세포 및 A549 폐암 세포를 이용하여 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화의 변화를 관찰하였다. 양쪽 AGS 위암세포와 A549 폐암세포에서 시스플라틴에 의해 유도된 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화는 八味地黃湯 물추출물에 의해 감소하는 것이 관찰되지 않았으며, 특히 A549 폐암세포에서는 八味地黃湯 물추출물이 시스플라틴에 의해 증가한 caspase-3 활성 및 발현과 PARP 절편화보다 더욱 증가하는 것이 관찰되었다. 따라서 이 결과들은 八味地黃湯이 시스플라틴의 항암 활성을 저해하지 않으면서 신장독성을 완화할 수 있다는 것을 제시하고 있다.
지금까지의 결과들을 통해 八味地黃湯은 ROS 생성 및 p53 활성을 조절함으로써 시스플라틴의 신장독성을 완화할 수 있으며, 또한 시스플라틴의 항암효과를 저해시키지 않거나 더욱 증진 시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나 八味地黃湯을 항암 화학요법의 보조제로서 임상에 적용하기 위해서는 적절한 동물모델을 통해 in vivo 효능연구가 반드시 수반되어야 할 것이다.
4). 특히, A549 폐암세포에서 caspase-3 활성과 PARP 절편화는 八味地 黃湯 물추출물에 의해 증가하였는데, 시스플라틴만 처리한 A549 폐암세포의 caspase-3 활성(518.9%)이 400 μg/ml과 800 μg/ml 농도의 八味地黃湯 물추출물에서 각각 589.0%와 651.6%로 증가하였다(Fig. 4A). 또한, A549 페암세포의 caspase-3 및 PARP 절편 화 분석에서도 시스플라틴만 처리한 세포의 cleaved caspase-3 발현수준(33.
후속연구
것을 보여주었다. 그러나 八味地黃湯을 항암 화학요법의 보조제로서 임상에 적용하기 위해서는 적절한 동물모델을 통해 in vivo 효능연구가 반드시 수반되어야 할 것이다.
八味地黃湯 물추출물은 시스플라틴 처리된 NRK-52E 신장 세포에서 ROS 생성 및 p53 활성을 감소시켜 신장독성을 완화했으며, AGS 위암세포 및 A549 폐암세포에서 시스플라틴의 항암 활성을 방해하지 않았다. 이와 같은 결과는 八味地黃湯이 시스플라틴 기반의 항암 화학요법을 통한 치료에서 부작용을 감소시키면서 항암치료를 효과적으로 할 수 있는 항암치료 보조제로 활용될 가능성을 제시해 주고 있다.
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