[논문]Reversine과 세포의 역분화 및 교차분화

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doi:10.5352/jls.2020.30.4.394

Reversine과 세포의 역분화 및 교차분화
Reversine, Cell Dedifferentiation and Transdifferentiation 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.4, 2020년, pp.394 - 401

초록
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배아줄기세포는 만능세포이기 때문에 동물에게 주입되면 종양으로 발달할 수도 있다. 따라서 연구자들은 종양 형성으로부터 비교적 자유로운 성체세포로부터 세포 특이적 줄기세포(성체줄기세포)를 확보하는데 관심을 두고 있다. 성체줄기세포는 제한적으로 세포분열을 할 수 있고 지정된 특정 세포로만 발달할 수 있다. 포유동물에서 각 조직의 세포들은 자연적 생리조건하에서는 역분화 혹은 교차분화에 의해 성체줄기세포로 전환되지 않는다. 따라서 일본 연구자들에 의하여 2006년 성체세포의 리프로그램에 의한 유도만능줄기세포(iPSCs) 기술이 소개되어 성체줄기세포 연구의 새로운 장을 열었다. 비록 연구현장에서 iPSCs 기술이 폭 넓게 이용되지만, 리프로그램의 안정성뿐만 아니라 유전체에 외래유전자의 도입 등의 문제점도 있다. Reversine은 iPSCs 보다 2년 앞서 발견된 작은 화학적 합성 분자인 퓨린 유사체이다. Reversine은 분화된 세포를 리프로그램에 의한 역분화를 유도하여 다능성 줄기세포로 전환시킬 수 있으며, 적절한 분화조건하에서 다른 세포로 교차분화를 유도할 수도 있다. 따라서 reversine은 iPSCs가 가지고 있는 문제점을 극복하고 화학적인 방법을 이용하여 성체세포를 다능성 줄기세포로 전환시킬 수 있는 물질로 활용될 수 있다. Reversine이 백색지방세포를 갈색지방형세포(beige cell)로 전변시켜 열발산에 의한 에너지소비를 촉진함을 제시하여 항비만인자로서 그 가능성을 열어 놓았다. Reversine은 세포 역분화의 기능적 역할 이외에 항암 인자로서 또 다른 기능들이 보고되고 있어 앞으로 여러 분야에서 그 이용성이 기대되는 물질이다.

Abstract ▼ AI-Helper

As embryonic stem cells become pluripotent, they may cause tumor development when injected into a host. Therefore, researchers are focusing heavily on the therapeutic potential of tissue-specific stem cells (adult stem cells) without resultant tumor formation. Adult stem cells can proliferate for a limited number of generations and are restricted to certain cell types (multipotent). Mature tissue cell types in mammals cannot be intrinsically dedifferentiated or transdifferentiated to adult stem cells. Hence, the technology of induced pluripotent stem cells (iPSCs) for reprogramming adult somatic cells was introduced in 2006, ushering in a new era in adult stem cell research. Although iPSCs have been widely used in the field, the approach has several limitations: instability of the reprogramming process, risk of incomplete reprogramming, and exposure to transgenes integrated into the cell genome. Two years before the introduction of the iPSC technique, the synthetic small molecule 2,6-disubstituted purine, called reversine, was introduced. Reversine can induce the dedifferentiation of committed cells into multipotent progenitor-type cells by reprogramming and converting adult cells to other cell types under appropriate stimuli. Thus, it can be used as a chemically induced multipotent cell agent to overcome the limitations of iPSCs. Also, as an alternative therapeutic approach for treating obesity, it can be used to generate beige cells by browning white adipocytes. While reversine has the potential to act as an anti-cancer agent, this review focuses on its role in differentiation, dedifferentiation, and transdifferentiation in somatic cells.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Chemical structure of reversine [2-(4-Morpholinoanilino)-6-cyclohexylaminopurine] [5].
그림 Fig. 2. Dedifferentiation and transdifferentiation of C2C12 myoblasts induced by reversine.
그림 Fig. 3. Schematic representation of the pathway involving reversine-mediated dedifferentiation and subsequent transdifferentiation.
표 Table 1. Comparisons of reversine studies for cell dedifferentiation, transdifferentiation and differentiation
그림 Fig. 4. Schematic representation of reversine-mediated dedifferentiation of C2C12 myoblasts.

AI 본문요약
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문제 정의

약 15년 전에 reversine이 처음 소개된 이후 약 80여편 이상의 논문이 발표되 었으며, 이들 중 약 절반은 세포의 역분화, 교차분화 및 분화에 관련된 것이며, 나머지 반은 항암인자[16, 17]로서 암과 관련된 논문이다. 여기서는 reversine에 의한 세포의 역분화, 교차분화 및 분화를 중심으로 하여 최근까지 연구동향을 소개하고자 한다.

제안 방법

2004년 reversine이 처음 소개된 이후 각 세포에 대한 reversine의 처리시기는 세포배양 초기에 1-4일간 이루어지고, 처리에 대한 세포의 역분화를 연구하였다. 그러나 Kim 등[10] 은 지방전구세포(3T3-L1)가 100% confluence된 2일 후 지방분 화 유도배지와 동시에 reversine을 6일간 처리하여 지방세포의 분화에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다.
배양된 세포에 reversine (0.3 μM)을 4일간 전처리를 하여 다능성 전구세포로 역분화를 유도한 후 지방, 뼈 그리고 연골분화를 각각의 유도배지로 배양하였을 때 각 세포들로 교차분화가 일어났다.
섬유아세포에 reversine (5 μ M)을 4일간 전처리 한 후 다능성 전구세포로 유도하였다.

성능/효과

Beige 지방세포의 확인은 대표적 표지인자 UCP1와 Pgc1α의 발현 증가와 흰색지방세포의 표지 인자인 FASN, Leptin, AdipoQ 등의 발현 감소로 지방세 포의 갈색지방화를 증명하였다.
C2C12세포에 reversine (5μM)을 4일간 처리한 후 신경분화 배지에 배양하여 신경세포 특이적 표지 유전자(Tuj1)와 교세포(glial cell)의 표지유전자인 GFAP의 mRNA와 단백질 수준에서 높은 발현을 보임으로서 C2C12세포에서 신경계 세포로의 교차분화를 보여주었다.
Reversine을 처리 받은 세포는 myotube형성이 완전히 사라지고 미분화된 형태의 세포 리프로그램 현상이 나타났다. Osteogenesis유도 조건에서는 세포의 약 35%가 alkaline phosptatase (ALP)의 활성으로 뼈의 특성을 보였으며, adipogenesis 유도 조건에서는 약 40%의 세포의 세포질에서 oil-red O 염색으로 지방구의 형성을 확인하여 지방세포의 특성을 확인하였다(Fig. 2). 섬유아세포, C2C12, 3T3-L1 등을 포함한 reversine을 전처리 받은 세포들은 세포의 형태가 급진적으로 변하는데, 최고 36배까지 크고 납작하게 배양용기에 부착된 모양을 보이면서 세포의 증식은 완전히 억제된다[2, 15, 19, 20].
이러한 체중감소는 reversine 주입 후 체온 증가에 의한 열발생(thermogenesis)으로 확인할 수 있었다고 한다. Reversine 처리를 받은 생쥐의 지방조직에서도 3T3-L1세포에서처럼 Ucp1, Prdm16의 증가와 miR-133a의 발현 감소를 볼 수 있어 지방세포의 갈색지방형으로의 전환을 확인하였다. 이는 reverisne이 세포주에서만 국한되지 않고 포유동물에서도 흰색 지방의 갈색지방형 유도로 열생산에 의한 비만억제에 쓰일 수 있는 가능성을 제시하였다는데 그 의미가 크다고 할 수 있다.
이러한 결과는 reversine을 처리 받은 세포에서 histone H3 lysine의 acetylation의 증가와 DNA methylation수준의 감소와 관계가 있음을 제시하였다. Reversine에 의한 세포의 역분화와 교차분화와 관련된 연구들을 종합해 보면, reversine 을 처리 받은 세포는 G2/M단계에서 growth arrest가 일어나면서 역분화가 진행되는데, 이를 조절하는 유전자들 즉, 세포 주기와 세포증식과 관련된 유전자들은 그 발현이 억제되고, growth arrest을 유도하는 유전자들은 증가된다. 다능성 전구 세포에서 다른 세포로 교차 분화가 일어날 때에는 chromatin remodeling 즉, 유도세포 관련 유전자들의 프로모터 부위의 histone modification의 활성이 동반됨을 알 수 있다.
배양된 세포에서 뼈와 지방세포 특이적 마커 유전자를 분석한 결과 2-(4-morpholinoanilino)-6-cyclohexyaminopurine analog (reversine)가 가장 강력하게 myotubes형성을 억제하고 mononucleated cell을 형성하였다. Reversine을 처리 받은 세포는 myotube형성이 완전히 사라지고 미분화된 형태의 세포 리프로그램 현상이 나타났다. Osteogenesis유도 조건에서는 세포의 약 35%가 alkaline phosptatase (ALP)의 활성으로 뼈의 특성을 보였으며, adipogenesis 유도 조건에서는 약 40%의 세포의 세포질에서 oil-red O 염색으로 지방구의 형성을 확인하여 지방세포의 특성을 확인하였다(Fig.
5 μM)을 함께 처리한 경우 지방세포분화가 억제되고, 지방분화 마커 유전자들(PPARγ, C/EBPα, FAS, resistin)의 발현과 세포내 지방구(lipid droplets) 형성 등이 감소하였다[15]. Reversine의 처리 시기를 분화유도배지 배양 전에 2일간 reversine을 처리하여도 지방세포의 분화억제효과는 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 3T3L-1 세포에서 reversine에 의한 지방세포분화 억제작용은 TGF-β1 활성화와 연관된 신호체계임을 제시하였다.
돼지 근육유래 satellites 세포에 reversine을 4일간 처리하였을 때, C2C12세포 혹은 3T3-L1 세포에서 보고되었던 것과 유사하게 크고, 납작한 유형의 세포 변화와 더불어 약 56%의 세포증식이 감소되었다. 다능성 (pluripotency)세포 마커 유전자인 Oct4유전자의 발현은 약 7배 증가한 반면 세포증식 마커 유전자인 PCNA은 크게 감소한 것으로 보아 reversine에 의한 세포의 다능성 기능의 증가와 세포증식 감소를 확인하였다. 근육유래 satellite cell에 reversine을 2일간 처리한 후 20% bovine follicular fluid가 포함된 배양조건에서 10일간 추가 배양하였을 때, 크고 둥근 혹은 타원형 female germ-like cell들이 형성되었다.
섬유아세포에서 신경세포로의 전환은 약 39~53% 수준이었다. 또한 섬유아세포를 myogenic 배양액에 21일간 처리한 결과 myotube 의 형성을 보여주었으며, 간원성(hepatogenic) 유도배지에 14 일간 배양하였을 때는 glycogen 흡수와 입방형(cuboidal)의 간세포 모양을 보였으며, 간세포 마커 유전자 ALB, AFP 등의 발현을 나타내었다.
또한 역분화된 세포를 TGF-β가 함유된 평활근(smooth muscle) 유도배지에 5일간 배양하였을 때 약 20%의 세포에서 교차분화가 확인되었다.
Chen 등[5]은 약 50,000개의 각기 다른 합성 분자를 C2C12 mouse myoblasts에 4일간 처리하여 역분화를 유도하였으며, 이후 뼈 혹은 지방분화 배지를 7일간 처리에 의하여 osteoblasts와 adipocytes로 교차분화를 유도하였다. 배양된 세포에서 뼈와 지방세포 특이적 마커 유전자를 분석한 결과 2-(4-morpholinoanilino)-6-cyclohexyaminopurine analog (reversine)가 가장 강력하게 myotubes형성을 억제하고 mononucleated cell을 형성하였다. Reversine을 처리 받은 세포는 myotube형성이 완전히 사라지고 미분화된 형태의 세포 리프로그램 현상이 나타났다.
섬유아세포에 reversine (5 μ M)을 4일간 전처리 한 후 다능성 전구세포로 유도하였다. 역분화된 세포를 osteogenic medium에 7일간 배양하였을 때 ALP염색에서 약 45%의 세포가 뼈로 교차분화가 일어났다. 또한 역분화된 세포를 TGF-β가 함유된 평활근(smooth muscle) 유도배지에 5일간 배양하였을 때 약 20%의 세포에서 교차분화가 확인되었다.
위의 연구결과들을 종합해 보면 세포주(C2C12, 3T3-L1), 섬유아세포(primary fibroblasts), 준줄기세포(muscle satellites, mescenchymal stem cells) 등 다양한 세포에서 reversine을 처리하여 역분화 및 교차분화를 유도할 수 있음을 보여 주었다. 근육세포로 운명이 결정된 C2C12세포의 경우 reverine에 의하여 지방, 연골, 뼈와 같이 동일 배엽 유래 세포뿐만 아니라 neuron 같이 다른 배엽 유래 세포까지 교차분화가 유도됨을 볼 수 있다(Fig.
장기간 초저온에 보관된 somatic cell인 bovine fibroblasts에 reversine을 처리하고 각 세포 유형 즉, mesoblasts로부터 osteoblasts와 adipocytes, ectoderm 으로부터 neurocytes, 그리고 endoderm으로부터 smooth muscle cell과 hepatocytes로 분화시킨 경우[12], reversine에 의해 fibroblast세포는 G2/M단계에서 growth arrest가 일어 난다. 이러한 결과는 reversine을 처리 받은 세포에서 histone H3 lysine의 acetylation의 증가와 DNA methylation수준의 감소와 관계가 있음을 제시하였다. Reversine에 의한 세포의 역분화와 교차분화와 관련된 연구들을 종합해 보면, reversine 을 처리 받은 세포는 G2/M단계에서 growth arrest가 일어나면서 역분화가 진행되는데, 이를 조절하는 유전자들 즉, 세포 주기와 세포증식과 관련된 유전자들은 그 발현이 억제되고, growth arrest을 유도하는 유전자들은 증가된다.
이러한 마커 유전자들의 발현 양상은 돼지의 oocytes에서와 유사한 결과임을 보여 reversine에 의한 근육 satellite cell을 이용한 돼지의 암컷 생식세포로의 교차 분화 가능성을 보여주었다.
5 μM)와 지방세포의 분화도의 차이로 설명하기에는 부족한 면이 있기 때문에 보다 더 체계적인 연구가 필요한 것으로 사료된다. 이에 저자의 연구실에서 지방세포의 분화단계별 reversine 처리가 지방세포의 분화에 미치는 영향을 연구한 결과 reversine은 clonal expansion 단계 즉 분화유도 초기에 가장 강력하게 지방세포의 분화를 억제하였으며, 이후 reversine에 의한 분화 억제효과는 감소하였고, 처리 기간에 비례하여 분화 억제 효과도 있음을 확인할 수 있었다(Y. S. Moon, unpublished data). 최근 연구에 의하면, 완전히 분화된 3T3-L1세포에 reversine을 처리하면 백색지방세포가 갈색지방형 세포로 전환된다고 한다[8].

후속연구

여기서 상반된 두 연구 결과는 reversine 농도(10 μM vs 2.5 μM)와 지방세포의 분화도의 차이로 설명하기에는 부족한 면이 있기 때문에 보다 더 체계적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.
Reversine을 미니돼지의 SCNT embryo에 처리하여 배양한 경우 배반포(blastocysts)의 형성이 크게 증가하여 체세포 핵이식이 크게 향상 되었다고 한다. 이상과 같이 reversine은 성체세포의 역분화인자, 항암인자, 항비만인자 및 SCNT 향상을 위한 물질 등으로 그 연구와 적용 범위가 확대될 것으로 기대된다.
없다. 추가적인 연구가 더 필요하겠지만 revesine에 의한 성체세포로부터 다능성 줄기세포의 유도는 유전적 조절의 iPSCs 보다 안전하고, 간단한 방법이라 할 수 있다. 또한 reversine은 지방세포 의 분화 억제 및 갈색지방화 유도에 의한 에너지 소비 촉진을 유도하여 비만억제를 위한 물질로서 활용될 가능성도 있다.
세포의 역분화를 유도하기 위하여 iPSCs는 Klf4, Sox2, c-Myc, Oct4 등 외래 유전자가 대상세포의 유전체에 도입되어야 하지만, 화학적 역분화의 경우 외래유전자의 도입이 없이 reversine을 직접 대상 세포에 처리한다. 화학적 역분화 방법도 세포 종류별 처리농도, 처리시점, 처리시간 등이 확립된다면 iPSCs와 마찬가지로 운명이 결정된 세포를 역분화시켜 다양한 준줄기세포의 확보에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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