[논문]수산가공품에서 분리한 Listeria sp.에 대한 구아바(Psidium guajava)잎과 현초(Geranium thunbergii) 추출물의 항균활성

김양호; 김태용; 김진수; 최재우; 이수정; 차소영; 신소담; 전미현; 노다인; 이은우

doi:10.5657/kfas.2020.0237

[국내논문] 수산가공품에서 분리한 Listeria sp.에 대한 구아바(Psidium guajava)잎과 현초(Geranium thunbergii) 추출물의 항균활성
Anti-bacterial Effect of Psidium guajava and Geranium thunbergii Extracts on Listeria sp. Isolated from Fishery Products 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.53 no.2, 2020년, pp.237 - 243

김양호 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 김태용 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 김진수 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 최재우 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 이수정 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 차소영 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 신소담 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 전미현 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 노다인 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공) , 이은우 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부 바이오의약공학전공)

Abstract ▼ AI-Helper

Listeria sp. is one of the pathogenic bacteria causes the infection listeriosis, through mainly raw food such as fishery food, dairy food and vegetables. Listeria sp. is a Gram-positive, non-spore-forming, motile, and facultative anaerobic bacterium. Because of the tolerance of Listeria sp. to low temperature and high salt concentration, it is very difficult to prevent them contaminated in the food, which do not require heating, especially, such as raw fishery products. So prevention and removal of bacterial contamination at the food manufacturing stage is the best method. In this study, therefore, several natural products including Psidium guajava and Geranium thunbergii were screened to investigate the antibacterial activity against Listeria sp., with expectation of fewer side effects and fewer resistance problems. Significant effects of two extracts were confirmed by well diffusion assay, MIC assay, and growth inhibition assay. P. guajava and G. thunbergii showed MIC values at 64-256 ㎍/mL meaning strong antibacterial activities against 6 kind of Listeria sp. tested. And the growth of Listeria sp. in the liquid media was actually inhibited by the addition of these two extracts.

주제어

표/그림 (4)

표 Table 1. Used parts of natural products and extraction yields
표 Table 2. Anti-Listeria activity of extracts by well-diffusion assay
표 Table 3. MIC values of each extracts against Listeria monocytogenes (μg/mL)
그림 Fig. 1. Growth inhibition of extract against Listeria monocytogenes strains (A) KCTC 3569, (B) DEU1, (C) DEU2, (D) DEU3, (E) DEU4, (F) DEU5.

AI 본문요약
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문제 정의

monocytogenes의 위해요소를 가식성 천연물로 제어하고자 하는 연구 사례는 충분히 보고되어 있지 않다. 본 연구에서는 식용으로 사용하는 천연식물 9종의 추출물로부터 L. monocytogenes를 저해하는 활성을 확인하였으며, 이에 그 결과를 보고한다.
본 연구에서는 표준균주와 분리균주 등 6종의 L. monocytogenes를 대상으로 구아바와 현초의 추출물로 항균활성을 확인하였다. Listeria sp.

제안 방법

37°C에서 24시간 배양한 후 대상 세균의 생육이저해된 최저 농도를 MIC로 결정하였다.
BHI 액체 배지에 같은 농도의 L. monocytogenes를 접종하고구아바와 현초 추출물을 최종농도 1 mg/mL로 접종하여 실제배양과정에서 항균활성을 나타내는지를 확인하였다(Fig. 1). 1시간 간격으로 측정한 균수의 변화에서 표준균주인 L.
재료는 대한생약제품(주) (Busan, Korea)에서 검정된 소재를 건조된 형태로 구입하였으며, -80°C에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 건조된 재료를 세절하고 잘게부수어 여러 농도의 ethanol (70%, 80%, 90%, 100%)과 열수추출을 실시하여 사전 실험을 실시한 결과, 가장 높은 추출수율을 나타낸 80% ethanol을 본 추출실험에 사용하였다(결과 미제시). 3배(v/v)의 80% ethanol에 24시간 실온에서 침지한 후, 여과지(No.
미생물 균주를 BHI (brain heart infusion) 배지에 배양하고(37°C, 24시간) BHI 배지를 이용하여 개체수를105-106 cell/mL로 보정하였다.
배양액에 최종농도 1 mg/mL로추출물을 처리하고 진탕배양하였다(37°C, 160 rpm). 배양 시작 후 1시간 간격으로 시료를 수집하여 660 nm에서 분광광도계(Amersham Biosciences, UK)로 L. monocytogenes의 증식정도를 측정하였다.
액체배지 상에서 추출물을 처리 시 미생물 균주가 사멸하는양상은 time-kill curve assay (Al-Ani et al., 2015)방법을 변형하여 측정하였다. 미생물 균주를 BHI (brain heart infusion) 배지에 배양하고(37°C, 24시간) BHI 배지를 이용하여 개체수를105-106 cell/mL로 보정하였다.
)와 현초(Thunberg's geraniumGeranium thunbergii)에서 64-256 µg/mL의 MIC를 나타내어강한 항균활성을 나타내었다. 이후 실험에는 이 2종의 추출물의 활성을 측정하였다.
즉, 적정배지에서 하룻밤 배양한 대상균주 배양액200 µL를 한천 배지 상에 멸균된 면봉으로 3회에 걸쳐 고르게도말하고 지름 8 mm의 well을 한천배지 상에 만든 후, 각 추출물을 100 µL씩 흡수시켜 37°C의 incubator (Emtech, Changwon, Korea)에서 18시간 배양 후 well 주위의 생육 저해환의크기를 측정하였다.
활성정도는 L.monocytogenes가 자라지 못하는 저해환의 직경을 측정하여 일정간격으로 나누어 상호비교하여 표기하였다. 표준균주 1종과분리균주 5종의 L.

대상 데이터

L. monocytogenes 균주들은 총 6종의 균주를 사용하였다.표준 균주는 L.
사용 균주들은 Brain Heart Infusion (BHI, DifcoCo., New Jersey, NJ, USA) 배지에 접종하여 37°C에서 배양하였다.
즉, 적정배지에서 하룻밤 배양한 대상균주 배양액200 µL를 한천 배지 상에 멸균된 면봉으로 3회에 걸쳐 고르게도말하고 지름 8 mm의 well을 한천배지 상에 만든 후, 각 추출물을 100 µL씩 흡수시켜 37°C의 incubator (Emtech, Changwon, Korea)에서 18시간 배양 후 well 주위의 생육 저해환의크기를 측정하였다. 양성 대조군으로는 ampicillin (10 mg/mL,Oxoid Ltd., UK)을 이용하였다.
37°C에서 24시간 배양한 후 대상 세균의 생육이저해된 최저 농도를 MIC로 결정하였다. 양성 대조군으로는ampicillin을 이용하였다.
그람 양성세균에 활성이 보고 되었거나 항균활성이 있다고 보고 된 가식성 천연식물 소재 중에서 Listeria sp.에 대한 항균활성 탐색이아직 보고되지 않은 소재들을 문헌검색을 통하여 선정하였다.사용한 부위는 생리활성물질이 많이 포함되어 있다고 보고된 부분을 사용하였다.
재료는 대한생약제품(주) (Busan, Korea)에서 검정된 소재를 건조된 형태로 구입하였으며, -80°C에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
monocytogenes 균주들은 총 6종의 균주를 사용하였다.표준 균주는 L. monocytogenes KCTC 3569를 생물자원센터(Korean collection for type cultures, KCTC, Daejeon, Korea)에서 구입하였으며, 분리균주 5종(L. monocytogenes DEU1-DEU5)은 수산가공품에서 분리 동정하여 실험실에서 보관 중인 균주들을 사용하였다. 분리균주는 16S rRNA 서열분석과listeriolysin 검출을 위한 PCR 동정방법(Jung et al.

데이터처리

SPSS Ver. 23 (SPSS Inc., IL, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA test)하였고, 각 처리구간의 유의성은 Duncan의다중위검정법으로 P<0.05 수준에서 실시하였다.
데이터의 통계처리는 각 시료에 대한 평균±표준편차를 나타내었다.

이론/모형

monocytogenes DEU1-DEU5)은 수산가공품에서 분리 동정하여 실험실에서 보관 중인 균주들을 사용하였다. 분리균주는 16S rRNA 서열분석과listeriolysin 검출을 위한 PCR 동정방법(Jung et al., 2003; Osman et al., 2014)으로 L. monocytogenes로 동정 및 검증 후사용하였다. 사용 균주들은 Brain Heart Infusion (BHI, DifcoCo.
추출액은 rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan)로 90°C에서진공 감압 농축하여 용매를 완전 제거하였으며, 각각의 농축물을 다시 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 200 mg/mL의 농도로 용해시켜 -20°C에 보관하면서 각 세균별 항균활성 측정을 위한 stock solution으로 사용하였다. 추출 수율은 용매가 완전 건조된 시료의 무게를 측정하여 중량법을 이용하여 계산하였다.실험에 사용된 기타 시약들은 분석용 grade를 Sigma Co.
추출물의 최소 생육저해 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 96-well plate와 Muller-Hinton 배지(DifcoCo., USA)를 이용한 표준 2배 희석 방법으로 측정하였다(Leeet al., 2003). 37°C에서 24시간 배양한 후 대상 세균의 생육이저해된 최저 농도를 MIC로 결정하였다.
항균활성은 clinical and laboratory standards institute (CLSI,2019)의 표준방법에 따라 well diffusion method를 사용하여 측정하였다. 즉, 적정배지에서 하룻밤 배양한 대상균주 배양액200 µL를 한천 배지 상에 멸균된 면봉으로 3회에 걸쳐 고르게도말하고 지름 8 mm의 well을 한천배지 상에 만든 후, 각 추출물을 100 µL씩 흡수시켜 37°C의 incubator (Emtech, Changwon, Korea)에서 18시간 배양 후 well 주위의 생육 저해환의크기를 측정하였다.

성능/효과

1). 1시간 간격으로 측정한 균수의 변화에서 표준균주인 L. monocytogenes KCTC 3569와 분리균주 5종 등 총 6종의 대상 균주들은 배양 대수증식기에서 7시간 내에 성장 정체기에 들어가는성장곡선을 보였다. 정체기는 측정한 24시간까지 지속되었으며, DEU1과 DEU2, 그리고 DEU3 균주는 20시간 이후부터 추출물이 포함된 실험구에서 약간의 사멸현상을 나타내었다.
1%저해하였다. 24시간 동안의 성장저해활성은 균주에 따라 차이를 나타내었으나, 실험한 6종의 모든 L. monocytogenes에 대해 구아바와 현초 추출물은 성장저해활성을 가지고 있음을 확인하였다.
상대적으로 현초 추출물 보다 구아바 추출물에서더 강한 저해활성을 나타내었다. 24시간 째 측정한 수치를 대조구의 성장 정도를 100% 기준으로 환산해 보았을 때, 구아바 추출물은 DEU3 균주에서 최고 37.3% 저해하였고, DEU1 균주에 대해 최저 18.6% 저해하였다. 또한 현초 추출물은 DEU3 균주에서 최고 21.
6% 저해하였다. 또한 현초 추출물은 DEU3 균주에서 최고 21.1% 저해하였고, DEU1 균주에 대해 최저 5.1%저해하였다. 24시간 동안의 성장저해활성은 균주에 따라 차이를 나타내었으나, 실험한 6종의 모든 L.
전체적으로 추출물이 포함된 모든 실험구에서 성장 저해활성을 나타내었다. 상대적으로 현초 추출물 보다 구아바 추출물에서더 강한 저해활성을 나타내었다. 24시간 째 측정한 수치를 대조구의 성장 정도를 100% 기준으로 환산해 보았을 때, 구아바 추출물은 DEU3 균주에서 최고 37.
MIC 농도는 각 추출물을 측정된 농도로 사용하였을 경우에 대상 세균의 성장을 저해시킬 수 있는 최소의 농도를 의미하므로 수치가 작을수록 강한 활성을 의미한다. 앞선well-diffusion assay에서의 결과(Table 2)에서 활성을 나타내지 않은 3종의 추출물은 여전히 최고값 이상의 MIC를 나타내어 항균활성이 없음을 재확인하였다. 활성을 나타내었던 6종 중에서는 각각 서로 다른 MIC 값을 나타내었는데, 그 중에서 구아바(Guava Psidium guajava L.
정체기는 측정한 24시간까지 지속되었으며, DEU1과 DEU2, 그리고 DEU3 균주는 20시간 이후부터 추출물이 포함된 실험구에서 약간의 사멸현상을 나타내었다. 전체적으로 추출물이 포함된 모든 실험구에서 성장 저해활성을 나타내었다. 상대적으로 현초 추출물 보다 구아바 추출물에서더 강한 저해활성을 나타내었다.
monocytogenes KCTC 3569와 분리균주 5종 등 총 6종의 대상 균주들은 배양 대수증식기에서 7시간 내에 성장 정체기에 들어가는성장곡선을 보였다. 정체기는 측정한 24시간까지 지속되었으며, DEU1과 DEU2, 그리고 DEU3 균주는 20시간 이후부터 추출물이 포함된 실험구에서 약간의 사멸현상을 나타내었다. 전체적으로 추출물이 포함된 모든 실험구에서 성장 저해활성을 나타내었다.
추출물의 제조 과정 중에 진공감압 농축을 90°C에서 실시하였으나, 결과적으로 추출물의 활성이 유지되는 것으로 볼 때, 본 추출물의 활성성분은 어느 정도 내열성을 가질 것으로 추측된다.
표준균주 1종과분리균주 5종의 L. monocytogenes를 대상으로 항균활성을 측정한 결과를 양성대조군인 ampicillin의 활성과 비교한 결과, 사용한 천연물 9종 중 3종(Balloon flower, Fish mint, Melia)에서는 항균활성이 전혀 나타나지 않았으며, 다른 6종(Chineseplum, Chinese twinleaf, Guava, Japanese plum, Magnoliavine, Thunberg's geranium)에서는 항균활성을 나타내었다.
monocytogenes를 대상으로 항균활성을 측정한 결과를 양성대조군인 ampicillin의 활성과 비교한 결과, 사용한 천연물 9종 중 3종(Balloon flower, Fish mint, Melia)에서는 항균활성이 전혀 나타나지 않았으며, 다른 6종(Chineseplum, Chinese twinleaf, Guava, Japanese plum, Magnoliavine, Thunberg's geranium)에서는 항균활성을 나타내었다. 표준균주와 분리균주 사이의 활성의 차이나 균주별 활성차이는크지 않은 것으로 관찰되었다. 추출물의 제조 과정 중에 진공감압 농축을 90°C에서 실시하였으나, 결과적으로 추출물의 활성이 유지되는 것으로 볼 때, 본 추출물의 활성성분은 어느 정도 내열성을 가질 것으로 추측된다.
활성을 나타내었던 6종 중에서는 각각 서로 다른 MIC 값을 나타내었는데, 그 중에서 구아바(Guava Psidium guajava L.)와 현초(Thunberg's geraniumGeranium thunbergii)에서 64-256 µg/mL의 MIC를 나타내어강한 항균활성을 나타내었다.

후속연구

또한 향후 병원성 세균으로 새로운 문제가 될 수도 있다고 보고되고 있는 L. ivanovii와 L. innocua 등에 대한 항균활성 연구도 시도되어야 한다고 판단한다.
연구에서 발견한 구아바와 현초의 항리스테리아 활성성분을 분리 정제, 구조동정 등을 통해 확인하고, 훈제연어 등 수산물의 표면에서 항균활성을 나타내는지에 대한 연구가 필요하다고 사료된다. 또한 향후 병원성 세균으로 새로운 문제가 될 수도 있다고 보고되고 있는 L.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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