[논문]방기복령탕(防己茯苓湯)이 백서에서 LPS로 유도된 우울증에서 면역 조직학적 변화에 미치는 효과

박성준; 이태희

doi:10.14374/hfs.2020.28.1.53

방기복령탕(防己茯苓湯)이 백서에서 LPS로 유도된 우울증에서 면역 조직학적 변화에 미치는 효과
Effect of Banggibongnyeongtang on the immunohistological change in LPS-induced depression rats 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.28 no.1, 2020년, pp.53 - 62

박성준 (가천대학교 한의과대학 방제학교실) , 이태희 (가천대학교 한의과대학 방제학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : This study is accomplished in order to investigate the effect of banggibongnyeongtang on the immunohistological change in LPS-induced depression rats to confirm the histological result of the previous behavioral and biochemical effect. Methods : LPS 5 ㎍ was injected to lateral ventricle and experimental groups were administered BBT intraperitoneally. The concentration of 5-HT in the Medial Prefrontal Cortex, Striatum, Hippocampus, Amygdala was measured by ELISA. IL-1β, TNF-α mRNA and BDNF mRNA expression in the hippocampus was examined by RT-PCR. Result : BBT enhanced 5-HT concentration at all part of brain but no significantly difference at medial prefrontal cortex and striatum. LPS+BBT400 group increased 5-HT concentration significantly than LPS group at hippocampus and amygdala (p<0.05). BBT decreased IL-1β mRNA expression dose dependently but only with significantly decrease in LPS+BBT400 group than LPS group's in Hippocampus (p<0.05). But BBT did not decrease TNF-α mRNA expression significantly in Hippocampus. BBT increased the expression of BDNF mRNA at hippocampus and LPS+BBT400 group significantly increased comparing with LPS group does (p<0.05). Conclusion : It is postulated that the anti-depressant effect of BBT can be validated through the anti-inflammatory effect, 5-HT concentration increase, and the neuro-protective effect mediated by BDNF by combining the results of the previous report about the behavioral and biochemical effect.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Experimental schedule for developing lipopolysaccharide-induced depression-like behaviors, and BBT treatment in rats.
그림 Fig. 2. Effects of BBT on the 5-HT concentration in the medial prefrontal cortex, striatum, hippocampus, amygdala of rats after lipopolysaccharide injection.
그림 Fig. 3. Effects of BBT on Interleukin-1β (IL-1β) mRNA (A) and Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) mRNA (B) expression in the Hippocampus after lipopolysaccharide injection.
그림 Fig. 4. Effects of BBT on BDNF mRNA expression in the hippocampus of rats with LPS-induced depression-like symptoms.

AI 본문요약
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문제 정의

박 등5)은 방기복령탕이 항 염증 효과를 통하여 항 우울 효과를 보고한 바 그 내용은 LPS를 투여하여 개방장 행동 실험(open field test)과 강제수영부하실험(forced swimming test)을 통하여 우울행동을 확인한 후 혈장에서 IL-1β, TNF-α 농도 그리고 CRH(cotritotropin relasing hormone), ACTH(adenocorticotropic hormone), Cort(corticosteron)의 농도를 확인하였는데, 본 논문에서는 Medical Prefrontal Cortex, Hippocampus, Amygdala, Striatum에서 5-hydroxytryptamine (5-HT)의 농도 변화, Hippocampus에서 Interleukin-1 beta (IL-1β), Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α), BrainDerived Neurotrophic Factor (BDNF) mRNA의 발현을 면역조직학적으로 측정하여 이미 발표한 내용의 조직학적 소견에 대해 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

제안 방법

적출한 뇌 샘플에서 5-HT를 분석하기 위해서, medical prefrontal cortex, hippocampus, amygdala, striatum에서 분리하여, 4개의 뇌 부위에서 5-HT를 측정하였다. 5-HT는 rabbit polyclonal 5-HT antibody (Abcam) 프로토콜을 이용하여 competitive enzyme-linked immunoassay (ELISA)로 측정하였다. 표본은 판에 옮겨져서 한 시간 동안 실온에서 공기에 노출시켜 배양하였다.
LPS로 유도된 우울증 동물모델에서 BBT를 투여한 후 뇌의 Medial prefrontal cortex, Striatum, Hippocampus, Amygdala에서 5-HT의 농도를 측정하였다. Medial prefrontal cortex에서 SAL group에서 237.
실험쥐는 무작위적로 몸무게에 따라 6마리씩으로 6그룹으로 나누었다. LPS를 투여하지 않고 약재 대신 생리식염수를 주사한 군(0.9% NaCl, i.p., SAL group, n=6), LPS를 투여하고 매일 14일 동안 생리식염수를 주사한 군(0.9% NaCl, i.p., LPS group, n=6), LPS를 투여하고 매일 14일 동안 100 mg/kg의 防己茯苓湯 (BBT)을 주사한 그룹(i.p., LPS+BBT100 group, n=6), LPS를 투여하고 매일 14일동안 200mg/kg의 防己茯苓湯 (BBT)을 주사한 그룹(i.p., LPS+BBT200 group, n=6), LPS를 투여하고 매일 14일 동안 400 mg/kg의 防己茯苓湯 (BBT)을 주사한 그룹(i.p., LPS+BBT400 group, n=6) 으로 나누었다. 防己茯苓湯 (BBT)과 식염수는 14일간 복강 내로 주사하였다.
PCR 반응은 10 mM Tris-Hcl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM dNTP, 1 unit Taq polymerase, 10 pmol의 5‘과 3’의 BDNF (brain-derived neurotrophic factor) primer 그리고 RT product를 첨가하고 PCR을 수행하였다.
PCR을 이용하여 Hippocampus에서 BDNF mRNA 발현을 측정하였다. SAL group에서 38.
RT 반응은 65°C에서 10분 동안 RNA를 변성시키고, 42°C에서 1시간 동안 역전사하여 cDNA를 합성하고, 95°C에서 5분 동안 MuLV reverse transcriptase를 불활성화시키는 과정으로 진행되었다.
RT-PCR을 이용하여 상대적 IL-1β mRNA 발현을 측정하였다.
, LPS+BBT400 group, n=6) 으로 나누었다. 防己茯苓湯 (BBT)과 식염수는 14일간 복강 내로 주사하였다.
防己茯苓湯(BBT) 204 g을 가루내어 섞어 정확히 200 g으로 평량한 후, 85% 메탄올을 사용하여 3 회 추출하였으며, 추출물을 감압 농축한 후, 그 추출물을 동결 건조시켜 분말 건조하였다. 건조시켜 얻은 양은 25 g으로써, 수율은 12.
또한 동일한 방법으로 IL-1β와 TNF-α를 측정하였다.
(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 모든 실험은 동물이 실험실에 도착한 7일 이후, 환경에 적응시켜 실험에 사용하였다. 주령은 7주이고 체중은 210-230g이다.
각 손상군에 대한 약 물처치는 그 다음날부터 시행하였다. 모의 시술군은 손상 약물 대신 140 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM Na2HPO4로 만든 인공뇌척수액 (artificial CSF)을 같은 방식으로 주입하였다. 이 모든 실험 과정은 다음과 같다.
실험실 온도는 22±2°C, 습도는 55±15%가 유지되도록 조절하였고, 매일 12시간 동안 인공 햇빛을 쐬어 주었다.
1) 실험군

실험쥐는 무작위적로 몸무게에 따라 6마리씩으로 6그룹으로 나누었다. LPS를 투여하지 않고 약재 대신 생리식염수를 주사한 군(0.
염증에 의한 우울증 동물모델을 만들기 위해서, 쥐에 sodium pentobarbital (50 mg/kg, i.p.)로 마취 시킨 후 stereotaxic technique를 이용하여 lateral ventricle (AP: -0.2, L: ±0.3, H: -6.2)위치에 LPS (Escherichia coli; 055:B5, Sigma)를 5 μg을 양쪽으로 주입하였다8,9).
GAPDH는 internal control로 수행하였다. 이렇게 얻어진 product는 1.2% agarose gel에서 전기영동하여 UV (i-MaxTM, CoreBio System Co., Seoul, Korea)에서 관찰하였다. 또한 동일한 방법으로 IL-1β와 TNF-α를 측정하였다.
뇌에서 5-HT의 농도는 쥐의 행동 변화와 관련이 깊다. 이를 확인하기 위하여 본 저자는 뇌의 각 부위에서의 5-HT의 농도를 측정하였다. Hippocampus, Medial Prefrontal Cortex, Striatum, Amygdala에서 5-HT의 농도는 우울증의 증상 중 무게 감소와 무감각증, 운동행동, 학습된 절망 그리고 공포와 긴장과 관련이 깊다¹⁵⁾ .
동일한 흰쥐의 뇌를 적출했다. 적출한 뇌 샘플에서 5-HT를 분석하기 위해서, medical prefrontal cortex, hippocampus, amygdala, striatum에서 분리하여, 4개의 뇌 부위에서 5-HT를 측정하였다. 5-HT는 rabbit polyclonal 5-HT antibody (Abcam) 프로토콜을 이용하여 competitive enzyme-linked immunoassay (ELISA)로 측정하였다.
표본은 판에 옮겨져서 한 시간 동안 실온에서 공기에 노출시켜 배양하였다. 표본을 buffers로 몇 번 씻어 내고 발색시킨 후 450 nm에서 ELISA reader (MutiRead 400; Authos Co., Vienna, Austria)로 optical density를 측정하였다⁶⁾ .
흰쥐에 LPS를 주입하여 염증을 유발한 뒤, 防己茯苓湯을 투약하여 뇌에서 5-HT 농도와 IL-1β, TNF-α, BDNF의 mRNA 발현을 측정한 결과를 통해 LPS로 유발된 염증-우울증 모델에서 방기복령탕에서 나타난 효과에 대해 다음과 같은 결론을 얻었다.
흰쥐의 적출한 뇌에서 trisol (Sigma)을 사용하여 total RNA를 분리하였다¹⁴⁾ . Reverse transcription은 DEPC-DW로 최종부피를 50μl로 맞춘 후 total RNA에 RT-premix (Bioneer, Oakland, CA, USA) 혼합용액을 사용하여 cDNA를 합성하였다.

대상 데이터

Experimental schedule for developing lipopolysaccharide-induced depression-like behaviors, and BBT treatment in rats. Separate groups of rats (n=6 animals per group) were used for all experiments.
실험 동물은 숫컷 흰쥐 成體로 Sprague-Dawley계이고 Samtaco Animal Co. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 모든 실험은 동물이 실험실에 도착한 7일 이후, 환경에 적응시켜 실험에 사용하였다.
연구에 사용한 防己 (방기), 黃芪 (황기), 茯苓 (복령), 桂枝 (계지), 甘草 (감초)는 표준품을 사용하였으며, 처방은 상한론에 기재된 防己茯苓湯으로, 처방 구성 약제는 나눔 제약㈜(영천)에서 구입한 후 사용하였다. 처방 내용은 다음과 같다.

데이터처리

각 실험군의 통계학적 분석은 window용 SPSS 이용하고 사후 Tukey’s post-hoc test로 검정하였다.
모든 측정값은 (평균값±표준오차)로 표시하였다.

이론/모형

실험동물 모두 행동 실험이 끝난 후 같은 날 decapitation 시켰다. 실험방법은 기존의 논문을 참조하였다. 동일한 흰쥐의 뇌를 적출했다.

성능/효과

1. 뇌에서 5-HT의 농도에 대한 防己茯苓湯의 효과는, Medial Prefrontal Cortex, Striatum 그리고 Hippocampus에서는 LPS group에 비해 저농도에서 감소하였다가 중농도와 고농도에서 증가하는 경향은 보였고, Amygdala에서는 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보이고, Hippocampus와 Amygdala의 LPS+BBT400 group에서 유의하게 증가하였다(p<0.05).
2. 防己茯苓湯은 모든 group에서 Hippocampus내의 IL-1β mRNA 발현을 억제하였으며, LPS+BBT400 group에서 농도와 발현을 유의하게 감소시켰다(p<0.05).
3. 防己茯苓湯이 Hippocampus내의 BDNF mRNA 발현에 나타내는 효과는, LPS group에 비해 저농도에서 감소하였다가 중농도, 고농도에서 증가하는 경향을 보이고, LPS+BBT400 group에서 유의하게 증가하였다(p<0.05).
BBT는 hippocampus에서 BDNF mRNA의 활성을 증가 시키는 것을 확인할 수 있었는데, 저농도에서는 감소하였지만 중농도와 고농도에서 유의한 증가가 보였다(p<0.05).
BBT를 투여한 group에서 IL-1β mRNA의 발현이 억제하는 효능이 나타났다.
BBT에서 Hippocampus의 5-HT의 농도가 저농도에서 감소하였다가 증가되는 결과가 보였고, 고농도인 BBT400에서 유의하게 증가하였다(p<0.05).
Hippocampus에서 5-HT의 농도는 SAL group에서 277.33±13.33 ng/mg, LPS group에서는 123.33±22.19 ng/mg으로 SAL group에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.01).
LPS+BBT100 group 에서 41.38±4.58 %, LPS+BBT200 group에서 38.89±5.41%로 발현이 감소하였고, LPS+BBT400 group에서는 25.52±0.78%로 발현되어 LPS group에 비하여 유의하게 감소하였다(p<0.05).
LPS+BBT100 group에서 17.43±2.65 %로 오히려 감소하였고, LPS+BBT200 group에서 27.03±3.39%, LPS+BBT400 group에서는 33.35±2.10%가 발현하여 농도 의존적으로 증가하였고, LPS+BBT400group에서 LPS group에 비하여 유의하게 증가하였다(p<0.05).
LPS+BBT100 group에서 87.33±23.25 ng/mg로 오 히려 감소하였고, LPS+BBT200 group에서 142.67±17.52 ng/mg 로 증가하였으며, LPS+BBT400 group에서는 211.33±14.11 ng/mg으로 LPS group에 비하여 유의하게 증가하며(p<0.05), 농도의존적으로 증가하는 경향을 보였다.
Medial prefrontal cortex에서 SAL group에서 237.33±35.35 ng/mg, LPS group에서 92.00±29.87 ng/mg으로 5-HT의 농도가 유의하게 감소하였다(p<0.05).
TNF-α mRNA 발현 비율을 측정한 바, SAL group에서 23.23±7.45%, LPS group에서 43.45±4.73%로 유의하게 증가하였다(p<0.05).
결론: LPS로 유발된 염증에 대한 우울증에 대하여, 防己茯苓湯으로 뇌 조직 내에서 5-HT와 IL-1β, TNF-α 그리고 BDNF에 대한 효능을 확인한 결과 항 염증 효과 5-HT 농도 증가효과와 BDNF를 통한 신경세포 보호기능을 나타내며 선행 연구 결과를 같이 고려할 때 방기복령탕이 항염증효과를 통한 항우울 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
이 밝힌 행동변화와 혈장 에서의 cytokine의 변화, 그리고 CRH, ACTH, Corticosterone의 변화의 결과와 같이 볼 때 BBT는 Hippocampus에서 IL-1β mRNA 발현을 억제하여 염증을 제어할 수 있고, Hippocampus, Amygdala에서 5-HT의 농도를 증가시켜 긴장감과 무감각증, 행동 둔마와 같은 우울증적 행동장애를 개선시킬 수 있다. 그리고 신경 보호 효과를 지는 BDNF mRNA의 발현을 촉진시켜 염증으로 인한 신경세포의 파괴를 줄여 항 우울 효과를 낼 수 있을 것으로 보인다.
또한 Amygdala에서도 농도 의존적으로 5-HT를 증가시켰고, 고농도군인 BBT400 group에서 유의한 증가를 보였다(P<0.05).

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	우울증의 치료에 사용되는 항우울제의 부작용은?	우울증의 치료는 1960년대 소개된 1세대 항우울제인 Tricyclic antidepressants (TCAs), inhibitor of monoamine oxidase (MAOI), 1990년대에 나온 2세대 항우울제 selective serotonin reuptake inhibitor(SSRI), mixed serotonin/noradrenaline reuptake inhibitor (SNRI) 류가 사용되어 왔다. 1세대 항 우울제(TCAs, MAOI)는 자율신경계와 심혈관계에 부작용을 나타내고, 2세대 항 우울제(SSRI/SNRI)는 작용까지 3~6주정도의 지연이 있고, 불면이나 구역, 성기능 장애 등의 부작용을 나타낸다3). 최근 우울증을 초례할 수 있는 가능성 높은 가설로 염증 가설이 나타났다.
	우울증의 특징은?	우울증은 기분의 뚜렷한 변화를 필요로 한다. 슬픔이나 초조함 그리고 적어도 몇 가지의 정신 생리적인 변화를 포함하는데, 수면, 식욕 혹은 성욕의 장애, 변비, 일이나 친구들과의 관계에서 즐거움 상실, 울음, 자살 충동, 그리고 말과 행동의 둔마와 같은 것을 특징으로 한다. 이러한 변화들은 반드시 적어도 2주는 지속되어야 하고, 일과 가족관계를 방해해야 한다1).
	자살이 가장 큰 사망 원인인 연령대는?	6 명으로 5위의 사망원인이다. 특히 10대에서 30대까지 자살은 가장 큰 사망 원인이다2).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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