[국내논문]미토콘드리아 활성화를 통한 양파(Allium Cepa L.) 과육 및 과피의 Amyloid-β 유도성 인지손상에 대한 개선효과 Ameliorative effect of onion (Allium Cepa L.) flesh and peel on amyloid-β-induced cognitive dysfunction via mitochondrial activation원문보기
본 연구에서는 양파(Allium Cepa L.) 과육과 과피를 이용하여 in vitro 신경세포 보호효과 및 Aβ로 유도된 인지기능 장애 마우스 모델에서의 개선효과를 검증하고자 하였다. 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 모두 PC-12 세포에서 Aβ로 유도된 세포 독성에 대하여 신경세포 보호효과(세포 내 산화적 스트레스 억제, 세포 생존율 및 세포막 보호효과)를 나타냈다. Aβ로 유도된 인지장애 마우스 모델에서의 행동실험(Y-미로, 수동회피 및 Morris 수중 미로 시험) 결과 또한 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 모두 효과적인으로 학습 및 기억능력을 개선시키는 것으로 나타났다. 행동실험 후 마우스 뇌조직에서의 산화적 스트레스에 대한 생체 방어 기작의 일종인 SOD 함량의 증가, oxidized GSH/총 GSH 및 MDA 함량 감소를 나타냄에 따라 산화적 스트레스에 대한 우수한 항산화효과가 긍정적인 영향을 미친 것으로 판단된다. 또한, 뇌조직으로부터 분리한 미토콘드리아에 대하여 막 전위(MMP) 보호 및 ATP 함량 증가를 나타냈으며, 미토콘드리아와 관련된 apoptosis 경로에서 BAX의 감소 및 cytochrome c 방출 억제를 통해 caspase 3/7의 활성을 억제하는 것으로도 나타났다. 결국, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP)은 AChE의 활성 억제 및 ACh의 함량을 증가시킴으로써 효과적인 콜린성 시스템 보호효과를 나타냄에 따라, Aβ로 유도된 인지기능 장애를 예방할 수 있는 고부가가치 건강기능식품 소재로의 활용 가능성이 기대된다.
본 연구에서는 양파(Allium Cepa L.) 과육과 과피를 이용하여 in vitro 신경세포 보호효과 및 Aβ로 유도된 인지기능 장애 마우스 모델에서의 개선효과를 검증하고자 하였다. 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 모두 PC-12 세포에서 Aβ로 유도된 세포 독성에 대하여 신경세포 보호효과(세포 내 산화적 스트레스 억제, 세포 생존율 및 세포막 보호효과)를 나타냈다. Aβ로 유도된 인지장애 마우스 모델에서의 행동실험(Y-미로, 수동회피 및 Morris 수중 미로 시험) 결과 또한 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 모두 효과적인으로 학습 및 기억능력을 개선시키는 것으로 나타났다. 행동실험 후 마우스 뇌조직에서의 산화적 스트레스에 대한 생체 방어 기작의 일종인 SOD 함량의 증가, oxidized GSH/총 GSH 및 MDA 함량 감소를 나타냄에 따라 산화적 스트레스에 대한 우수한 항산화효과가 긍정적인 영향을 미친 것으로 판단된다. 또한, 뇌조직으로부터 분리한 미토콘드리아에 대하여 막 전위(MMP) 보호 및 ATP 함량 증가를 나타냈으며, 미토콘드리아와 관련된 apoptosis 경로에서 BAX의 감소 및 cytochrome c 방출 억제를 통해 caspase 3/7의 활성을 억제하는 것으로도 나타났다. 결국, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP)은 AChE의 활성 억제 및 ACh의 함량을 증가시킴으로써 효과적인 콜린성 시스템 보호효과를 나타냄에 따라, Aβ로 유도된 인지기능 장애를 예방할 수 있는 고부가가치 건강기능식품 소재로의 활용 가능성이 기대된다.
In this study, in order to confirm the ameliorative effects of onion (Allium cepa L.) flesh and peel on amyloidbeta (Aβ)-induced cognitive dysfunction, we evaluated their in vitro neuroprotection and in vivo cognitive functions. As the result of in vitro neuroprotection, the protective effect...
In this study, in order to confirm the ameliorative effects of onion (Allium cepa L.) flesh and peel on amyloidbeta (Aβ)-induced cognitive dysfunction, we evaluated their in vitro neuroprotection and in vivo cognitive functions. As the result of in vitro neuroprotection, the protective effect of the ethyl acetate fraction of onion flesh (EOF) on Aβ-induced cytotoxicity was similar to that of the ethyl acetate fraction of onion peel (EOP). In the behavioral tests, the EOF and EOP effectively improved the Aβ-induced learning and memory impairments. For this reason, it could be concluded that the EOF and EOP improved the antioxidant activities (superoxide dismutase, oxidized glutathione/total glutathione, and malondialdehyde) in brain tissue. In addition, the EOF and EOP effectively activated mitochondrial functions by protecting the mitochondrial membrane potential, ATP, mitochondria-mediated protein (BAX and cytochrome c), and caspase 3/7 activities. The EOF and EOP also improved the cholinergic system (acetylcholinesterase and acetylcholine). Therefore, we suggest that onion could be used for management of Aβ-induced cognitive dysfunction.
In this study, in order to confirm the ameliorative effects of onion (Allium cepa L.) flesh and peel on amyloidbeta (Aβ)-induced cognitive dysfunction, we evaluated their in vitro neuroprotection and in vivo cognitive functions. As the result of in vitro neuroprotection, the protective effect of the ethyl acetate fraction of onion flesh (EOF) on Aβ-induced cytotoxicity was similar to that of the ethyl acetate fraction of onion peel (EOP). In the behavioral tests, the EOF and EOP effectively improved the Aβ-induced learning and memory impairments. For this reason, it could be concluded that the EOF and EOP improved the antioxidant activities (superoxide dismutase, oxidized glutathione/total glutathione, and malondialdehyde) in brain tissue. In addition, the EOF and EOP effectively activated mitochondrial functions by protecting the mitochondrial membrane potential, ATP, mitochondria-mediated protein (BAX and cytochrome c), and caspase 3/7 activities. The EOF and EOP also improved the cholinergic system (acetylcholinesterase and acetylcholine). Therefore, we suggest that onion could be used for management of Aβ-induced cognitive dysfunction.
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문제 정의
따라서, 본 연구 에서는 quercetin과 같은 플라보노이드 함량이 높아 생리활성이 높은 것으로 알려진 양파과피 뿐만 아니라 가식부인 양파 과육을 비교함으로써 Aβ에 의해 손상된 인지장애에 개선효과를 확인 하고, 양파 과육의 건강기능식품 소재로의 산업적 가치를 평가하고자 하였다.
본 연구에서는 양파(Allium Cepa L.) 과육과 과피를 이용하여 in vitro 신경세포 보호효과 및 Aβ로 유도된 인지기능 장애 마우스 모델에서의 개선효과를 검증하고자 하였다.
제안 방법
5 mA, 3초)을 가하였다. 24시간 후, 실험동물이 밝은 챔버에서 어두운 챔버로 들어가는데 걸리는 시간(latency time)을 최대 300초까지측정하였다(Park 등, 2015b).
Overnight 후, membrane을 1:5000로 희석한 2차 항체(goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate, #1706516, Bio-Rad, Pierce, Rockford, IL, USA) 와 함께 실온에서 2시간 동안 반응시켰고, ProNATM ECL Ottimo (TransLab, Daejeon, Korea)를 첨가하여 ChemiDoc (Korea Biomics, Seoul, Korea)를 통해 검출하였다.
Pellet에 isolation buffer를 첨가하여 원심분리(10,000 ×g, 15분, 4℃)하여 최종 pellet을 뇌조직의 미토콘드리아로 활용하여 실험하였다(Wang 등, 2014).
Y-미로(Y-maze) 실험은 검은 플라스틱 재질로 이루어진 3개의 arm (길이 33 cm, 높이 15 cm, 너비 10 cm)이 Y자 형태로 구성된 것을 사용하였다. 각 arm 중 한 구역을 지정하여 실험동물을 놓고 8분 동안 마우스의 이동경로를 smart 3.0 video tracking system (Panlab, Barcelona, Spain)으로 기록하여 분석하였다(Park 등, 2015b).
균질액은 원심분리(13,000 ×g, 12분, 4℃)하여 상층액을 caspase 3/7 kit (Promega)를 사용하여 활성을 평가하였다.
그 후, 배지를 모두 제거한 후, 이메틸 일산화황(dimethyl sulfoxide, DMSO) 100 μL를 첨가하여 생성된 MTT formazan을 마이크로플레이트 판독기(680, Bio-Rad, Tokyo, Japan)를 이용하여 570 nm (test wavelength) 및 690 nm (reference wavelength)에서 흡광도를 측정하였다.
뇌조직에 5% metaphosphoric acid를 넣고 균질화하여 원심분리(14,000 ×g, 15분, 4℃)한 후, 상층액은 총 GSH 함량을 측정하기 위하여 전처리하였다.
뇌조직에서 분리된 미토콘드리아의 막 전위(MMP)는 JC-1 dye 를 사용하여 평가하였으며, 그 결과는 Fig. 5A에 나타냈다. Aβ군 (75.
뇌조직의 caspase는 hypotonic 추출용액[25 mM HEPES, 1 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 0.1% protease inhibitor]을 첨가하여 균질화 하였다. 균질액은 원심분리(13,000 ×g, 12분, 4℃)하여 상층액을 caspase 3/7 kit (Promega)를 사용하여 활성을 평가하였다.
따라서, Aβ로유도된 뇌조직의 산화적 스트레스에 대한 양파 과육 분획물(EOF) 과 과피 분획물(EOP)의 항산화 기작을 확인하기 위하여 SOD 함량, oxidized GSH/total GSH 비율 및 MDA 함량을 측정하였고그 결과는 Fig. 4과 같다.
세포막은 산화적 스트레스에 매우 민감한 구조를 가지고 있으며, 세포막 손상의 결과로 lactate dehydrogenase (LDH)를 방출하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세포막 손상에 대한 보호효과를 확인하기 위하여, LDH의 함량을 측정하였고 그 결과는 Fig. 2C와같다. Aβ처리(66.
미토콘드리아 막 전위(MMP) 측정은 분리된 미토콘드리아에 assay 용액[5 mM pyruvate, 5 mM malate in isolation buffer]과 1 μM 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1) dye를 black 96-well에서 혼합하여, 암실에서 20분간 반응시킨다. 반응 후, 형광광도계를 이용하여 530 nm (excitation wave) 및 590 nm (emission wave)에서 형광강도를 측정하였다 (Wang 등, 2014).
뇌조직에 5% metaphosphoric acid를 넣고 균질화하여 원심분리(14,000 ×g, 15분, 4℃)한 후, 상층액은 총 GSH 함량을 측정하기 위하여 전처리하였다. 산화된 GSH 함량은 상층액에 2 M 4-vinylpyridine을 처리하고 1시간 동안 상온에 방치한 하여 전처리하고, GSH (GSSG/GSH) 검출 키트(Enzo Life Sciences, Plymouth meeting, PA, USA)를 사용하여 측정하였다.
상층액은 ATP level은 ENLITEN® ATP assay system kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 luminometer (Promega)에서 측정하였다(Wang 등, 2014).
수동 회피(passive avoidance) 실험은 통로로 연결된 2개의 챔버(light 및 dark chamber)로 이루어진 장치를 이용하여, 1분간 적응시킨 뒤, 어두운 챔버로 들어가면 문을 닫고 전기충격(0.5 mA, 3초)을 가하였다. 24시간 후, 실험동물이 밝은 챔버에서 어두운 챔버로 들어가는데 걸리는 시간(latency time)을 최대 300초까지측정하였다(Park 등, 2015b).
시료의 세포막 손상 억제효과는 lactate dehydrogenase (LDH)의방출량으로 평가하였다. 시료와 Aβ를 전 배양한 PC12 세포는 원심분리(500 g, 5분, 4℃)하였고, 상층액은 새로운 96-well plate에 옮긴 뒤 LDH 분석 키트(Sigma-Aldrich Chemical Co.
실험동물이 도피대를 찾아가는 시간은 최대 60초가 되도록 관찰하였고, 찾아가질 못 할 경우 도피대에 가도록 유도하여 20초 동안 머무르게 하였다. 실험 5일째(probe test)에는 도피대를 제거하고 90초간 W 구역에 머무르는 시간을 smart 3.0 video tracking system (Panlab)으로 기록하여 분석하였다(Morris, 1984).
지름 6 cm의검정 도피대(escape platform)는 W 구역의 중앙에 설치하여, 실험 하는 동안 위치를 고정시켰다. 실험 첫날은 도피대보다 수위를 낮게 조절하여 눈에 보이게 하고 실험동물에게 위치를 학습시켰다(visible platform test). 이후, 4일간은 도피대를 육안으로 보이지 않게 수위를 조절하였으며, 하루에 4번씩 입수 위치를 다르게 하여 도피대를 찾아가는 훈련을 실시하였다(hidden platform test).
실험동물의 인지 결함을 유발을 위하여, 0.85% (w/v) 염화소듐(NaCl) 용액에 용해시킨 Aβ (410 pmole, 10 μL)는 26-gauge needle이 장착된 Hamilton micro-syringe (Hamilton Co., Reno, NV, USA)를 사용 하여 bregma에 2.5 mm 깊이로 주사하였다.
이후, 4일간은 도피대를 육안으로 보이지 않게 수위를 조절하였으며, 하루에 4번씩 입수 위치를 다르게 하여 도피대를 찾아가는 훈련을 실시하였다(hidden platform test). 실험동물이 도피대를 찾아가는 시간은 최대 60초가 되도록 관찰하였고, 찾아가질 못 할 경우 도피대에 가도록 유도하여 20초 동안 머무르게 하였다. 실험 5일째(probe test)에는 도피대를 제거하고 90초간 W 구역에 머무르는 시간을 smart 3.
실험 첫날은 도피대보다 수위를 낮게 조절하여 눈에 보이게 하고 실험동물에게 위치를 학습시켰다(visible platform test). 이후, 4일간은 도피대를 육안으로 보이지 않게 수위를 조절하였으며, 하루에 4번씩 입수 위치를 다르게 하여 도피대를 찾아가는 훈련을 실시하였다(hidden platform test). 실험동물이 도피대를 찾아가는 시간은 최대 60초가 되도록 관찰하였고, 찾아가질 못 할 경우 도피대에 가도록 유도하여 20초 동안 머무르게 하였다.
시료를 넣고 3시간 동안 배양한 후, amylose β (Aβ)1-42 (최종농도: 100 μg/mL)를 처리하여 48시간 동안 반응시켰다. 이후, DCF-DA를 넣어 40분간 배양하고 형광광도계(Infinite F200, TECAN. Raleigh, NC, USA)를 사용하여 485 nm (excitation wave) 및 535 nm (emission wave)에서형광강도를 측정하였다.
정상 대조군(normal control group), Aβ 1-42 처리군(negative control group), 양파 과육 분획물(EOF 10 및 20 mg/kg of body weight; EOF 10, EOF 20) 및 양파 과피 분획물(EOP 10 및 20 mg/kg of body weight; EOP 10, EOP 20) 섭취군으로 나누었다(Ha 등, 2018).
정상 대조군과 Aβ 처리군에는 음용수를, 시료처리군에는 음용수에 녹인 시료를 3주 동안 하루에 한 번씩 경구 투여하였다.
2 여과지(Whatman Inc, Kent, UK)를 통해 여과하였다. 추출된 양파 과육 및 과피 추출 물은 동일한 비율의 노말헥세인(n-hexane), 클로로폼(chloroform), 아세트산에틸(ethyl acetate), 부탄올(butanol) 및 3차 증류수(distilled water)를 사용하여 극성에 따라 순차적으로 분획하였다. 본 연구그룹의 이전 연구(Park 등, 2015a)에서 다른 분획물 대비 페놀성 화합물 함량이 가장 높고, 항산화 활성이 가장 뛰어난 것으로 나타난 아세트산에틸 분획물(양파 과육 분획물; ethyl acetate fraction of onion flesh, EOF, 과피 분획물; ethyl acetate fraction of onion peel, EOP)은 진공농축기(N-1000, EYELA Co.
추출물은 원심분리 (10,000 ×g, 10분, 4oC)하였고, 상층액은 SOD 분석 키트(SigmaAldrich Chemical Co.)를 사용하여 분석하였다.
5 N sodium hydroxide, 2 M hydroxylamine in HCl]을 첨가하여 1분 동안 상온에서 방치한다. 혼합액에 반응용액에 0.5 N HCl과 0.37 M FeCl3 첨가한 후 즉시 540 nm 파장에서 흡광도를측정하였다. 이를 Bradford 시약(Bio-rad)을 이용하여 단백질 함량을 구하여, mM/mg of protein으로 나타냈다(Vincent 등, 1958).
대상 데이터
Morris 수중 미로(Morris water maze) 실험은 스테인리스 스틸로 구성된 원형 수조(직경 90 cm)를 사용하였으며, 수조를 사분면(E, W, S 및 N 구역)으로 나누고 마우스와 대조되도록 식용먹물(Cebesa, Valencia, Spain)을 녹인 물을 채웠다. 지름 6 cm의검정 도피대(escape platform)는 W 구역의 중앙에 설치하여, 실험 하는 동안 위치를 고정시켰다.
PC12 세포는 10% 소태아혈청, 50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신이 포함되어 있는 RPMI 1640 배지를 배양액으로 하여 37℃에서 5% CO2 조건에서 배양하였다.
Y-미로(Y-maze) 실험은 검은 플라스틱 재질로 이루어진 3개의 arm (길이 33 cm, 높이 15 cm, 너비 10 cm)이 Y자 형태로 구성된 것을 사용하였다. 각 arm 중 한 구역을 지정하여 실험동물을 놓고 8분 동안 마우스의 이동경로를 smart 3.
본 실험에 사용된 ICR 마우스(4주령, 수컷)는 Samtako (Osan, Korea)로부터 구입하여, 온도(22±2℃), 상대습도(50-55%)가 유지 되며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 일정한 환경에서 충분한 양의 식수와 사료를 공급하며 사육하였다.
본 실험에 사용된 양파(Allium cepa L.)는 2015년도에 재배된 것을 ㈜우포의 아침(Changnyeong, Korea)으로부터 제공받아 사용 하였으며, 양파 과육 및 과피를 분리, 세척하여 동결건조(Ilshin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea)하였다. 동결건조된 과육과 과피를 70% 에탄올에 혼합한 후 40℃에서 2시간 동안 환류 냉각장치를 이용하여 추출하였고, 이 추출물을 No.
본 실험에서 사용된 PC12 세포(KCLB 21721, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 신경세포의 특성을 나타내며, rat의 pheochromocytoma에서 유래된 것을 사용하였다. PC12 세포는 10% 소태아혈청, 50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신이 포함되어 있는 RPMI 1640 배지를 배양액으로 하여 37℃에서 5% CO2 조건에서 배양하였다.
본 연구그룹의 이전 연구(Park 등, 2015a)에서 다른 분획물 대비 페놀성 화합물 함량이 가장 높고, 항산화 활성이 가장 뛰어난 것으로 나타난 아세트산에틸 분획물(양파 과육 분획물; ethyl acetate fraction of onion flesh, EOF, 과피 분획물; ethyl acetate fraction of onion peel, EOP)은 진공농축기(N-1000, EYELA Co., Tokyo, Japan)로 농축하고, 동결건조하여 −20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
Aβ로 유도된 학습 및 기억력 손상 동물모델에서의 공간학습기억력을 Y-maze 실험을 통하여 평가하였고, 그 결과는 Fig. 3A와같다.
실험 결과의 통계적 유의성은 SAS software (version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 평균값에 대한 유의성 검증은 one-way analysis of variance (ANOVA)에 의하여 계산되었으며, 각 그룹 간의 유의성은 Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s new multiple-range test)으로 유의차를 5% 수준(p<0.05)에서 검증하였다.
이론/모형
Aβ로 유도된 신경세포 독성에 대한 세포 생존력은 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) assay 에 의하여 측정하였다.
단기학습 및 기억력의 평가는 수동회피(passive avoidance)실험을 통하여 평가하였으며, 그 결과는 Fig. 3C와 같다. Aβ군(68.
신경세포 내 산화적 스트레스 함량은 DCF-DA assay를 이용하여 평가하였다. PC12 세포를 black 96-well plate에 1×104 cells/well로 분주하였고 24시간 배양하였다.
반응 종료 후, 원심분리(6,000 ×g, 1분)하여, 상층액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 후, 단백질 농도는 Bradford 시약(Bio-rad, Hercules, CA, USA) 법을 이용하여 측정하였으며, nmol/mg of protein으로 나타냈다(Park 등, 2015b).
장기학습 및 기억력의 평가는 Morris 수중 미로(Morris water maze) 실험을 통해서 평가하였으며, 결과는 Fig. 3D-F와 같다. 4일간의 도피대를 찾아가는 훈련기간(Fig.
성능/효과
3A와같다. 8분 동안 각 arm을 통과한 총 횟수(평균 42.60회)는 통계 적으로 유의적인 차이를 나타나지 않았으며, 이러한 결과는 실험 동물의 기본적 운동능력에는 문제가 없는 것으로 판단된다. 반면, Aβ군(54.
Aβ군 (75.25%; 약 24.75% 감소)은 대조군(100.00%)에 비하여 미토콘드 리아 막 전위를 감소를 나타냈고, 이러한 결과를 통해 Aβ에 의해 미토콘드리아 기능의 손상이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
Aβ군(0.92 mmole/ mg of protein)은 정상 대조군(1.48 mmole/mg of protein) 대비 37.84% 감소된 함량을 나타냈으며, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 식이군(EOF 10=1.35, EOF 20=1.42, EOP 10= 1.52 및 EOP 20=1.60 mmole/mg of protein)에서는 저농도의 식이군에서도 유의적으로 ACh 함량을 유지하는 것으로 나타났다.
Aβ군(68.00 s) 은 정상 대조군(272.00 s) 대비 약 75.00% 감소된 단기학습 및 기억력을 나타냈고, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 섭취군(EOF 10=241.00, EOF 20=269.17, EOP 10=282.88 and EOP 20=291.83 s)에서는 대조군과 유사한 수준으로 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
Aβ군은 68.15%으로 대조군(45.67%) 에 비하여 증가된 oxidized GSH 함량을 나타냈으며, 양파 과육분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 식이군(EOF 10; 47.74, EOF 20; 47.48, EOP 10; 42.06 및 EOP 20; 40.16%)은 대조군과 유사한 수준으로 개선된 결과를 나타냈다.
Aβ로 유도된 인지장애 마우스 모델에서의 행동실험(Y-미로, 수동회피 및 Morris 수중 미로 시험) 결과 또한 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 모두 효과적인으로 학습 및 기억능력을 개선시 키는 것으로 나타났다.
Aβ처리(66.78%)는 대조군(27.65%)과 비교하였을 때 약 2.5 배의 증가된 LDH 방출량을 나타낸 반면, 양파 과육 분획물(EOF) 과 과피 분획물(EOP)은 100 μg/mL 농도에서 각각 52.65 및 46.31%로 LDH 방출을 감소시키는 것으로 나타났다.
AChE 활성 측정 결과(Fig. 6A), Aβ군(115.42%)은 정상 대조군 (100.00%) 대비 증가된 활성을 나타냈으며, 양파 과육 분획물 (EOF)과 과피 분획물(EOP) 식이군(EOF 10=85.83, EOF 20= 87.35, EOP 10=85.84 및 EOP 20=91.07 %)은 효과적으로 AChE 억제시키는 것으로 나타났다.
ATP 함량은 대조군(8.36 pmole/mg of protein; 100%)과 비교하였을 때 Aβ군(5.91 pmole/mg of protein; 약 29.31% 감소)로 미토콘드리아 기능 손상에 의하여 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다.
Superoxide dismutase (SOD) 함량 측정을 측정한 결과는 Aβ군(1.96 U/mg of protein)은 대조군(2.39 U/mg of protein)에 비하여 SOD 함량이 약 17.99% 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4A).
글루타치온(Glutathione; GSH) 함량 측정은 총 GSH 함량과 산화형 GSH (oxidized GSH)의 함량을 측정하여, 총 GSH 함량 대비 산화된 GSH 함량으로 나타냈다. 뇌조직에 5% metaphosphoric acid를 넣고 균질화하여 원심분리(14,000 ×g, 15분, 4℃)한 후, 상층액은 총 GSH 함량을 측정하기 위하여 전처리하였다.
대조군(100.00%) 대비 Aβ처리 (76.07%)는 PC12 세포의 약 26.98% 사멸을 유도시키는 것으로 나타났다.
대조군(100.00%)과 비교하였을 때, Aβ처리(125.97%)는 PC12 세포 내 ROS 함량을 증가시켰으며, 양성 대조군으로 사용된 비타민 C (102.33%)는 Aβ처리로 인하여 증가된 ROS 함량을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다.
행동실험 후 마우스 뇌조직에서의 산화적 스트레스에 대한 생체 방어 기작의 일종인 SOD 함량의 증가, oxidized GSH/총 GSH 및 MDA 함량 감소를 나타냄에 따라 산화적 스트레스에 대한 우수한 항산화효과가 긍정적인 영향을 미친 것으로 판단된다. 또한, 뇌조직으로부터 분리한 미토콘드리아에 대하여 막 전위(MMP) 보호 및 ATP 함량 증가를 나타냈으며, 미토콘드리아와 관련된 apoptosis 경로에서 BAX의 감소 및 cytochrome c 방출 억제를 통해 caspase 3/7의 활성을 억제하는 것으 로도 나타났다. 결국, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 은 AChE의 활성 억제 및 ACh의 함량을 증가시킴으로써 효과적인 콜린성 시스템 보호효과를 나타냄에 따라, Aβ로 유도된 인지 기능 장애를 예방할 수 있는 고부가가치 건강기능식품 소재로의 활용 가능성이 기대된다.
이러한 연구 보고를 고려할 때, 우리의 결과는 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP)이 나타내는 미토콘드리아의 기능 개선이 Aβ로 유도된 콜린성 시스템 장애 개선에도 상당한 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 양파 과육이 나타내는 미토콘드리아 활성화를 통한 인지기능 개선효과는 quercetin이 풍부해 생리활성 효과가 높다고 보고되고 있는 양파 과피의 결과와도 유사한 수준임을 확인할 수 있었다. 이를 종합해볼 때, 가식부로서의 양파 과육 또한 Aβ에 대한 인지기능을 개선시킬 수 있는 천연 식품소재로의 활용 가능성을 확인할 수 있었다.
반면, 양파 과육 분획물(EOF 20; 7.47 pmole/mg of protein)과 과피 분획물(EOP 20; 7.81 pmole/mg of protein) 식이군은 Aβ에 의한 미토콘드리아의 손상으로 감소되었던 ATP 함량을 효과적으로 회복시킬 수 있는 것으로 나타났다.
92 nmol/mg of protein)에 비해 유의적으로 증가된 함량을 나타냈다. 반면, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 섭취군(EOF 10; 5.03, EOF 20; 4.84 및 EOP 10; 4.60 nmol/mg of protein)은 효과적으로 지질 과산화를 억제하는 것으로 나타났다. 특히, EOP 20 그룹(3.
반면, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 섭취군(EOF 10=32.64, EOF 20=26.43, EOP 10= 26.90 및 EOP 20=27.78 s)은 Aβ군 대비 도피대를 찾아가는 시간이 감소했음을 확인할 수 있었다.
00%)에 비하여 미토콘드 리아 막 전위를 감소를 나타냈고, 이러한 결과를 통해 Aβ에 의해 미토콘드리아 기능의 손상이 유도되었음을 확인할 수 있었다. 반면, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 식이군은 미토콘드리아의 막 전위(MMP) 손상을 효과적으로 보호하는 것으로 나타났으며, 특히 양파 과육 분획물 식이군(EOF 20; 111.38%) 은 과피 분획물 식이군(EOP 20; 87.86%)과 비교하였을 때 상대 적으로 우수한 미토콘드리아의 막 전위 보호 효과를 나타냈다.
양파 과육 분획물 (EOF)과 과피 분획물(EOP) 모두 PC-12 세포에서 Aβ로 유도된 세포 독성에 대하여 신경세포 보호효과(세포 내 산화적 스트레스 억제, 세포 생존율 및 세포막 보호효과)를 나타냈다.
양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 섭취군(EOF 10=30.70, EOF 20= 32.21, EOP 10=29.50 and EOP 20=33.60%)은 Aβ군(26.13 %)로손상된 기억력을 효과적으로 회복시키는 것으로 나타났다.
양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP)은 5 μg/mL 농도에서 각각 92.12 및 76.21%로 우수한 ROS 생성 억제 효과를 나타냈다.
양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP)처리군에서는 10 μg/mL 농도에서 세포 생존율이 각각 85.33 및 84.59%로 증가 하는 것으로 나타났으며, 이는 양성 대조군으로 사용된 비타민 C (83.88%)의 세포 생존율과 유사한 것으로 나타났다.
이러한 결과와 대조적으로 양파 과육 분획물 (EOF)은 Aβ로 유도된 세포 독성에 대하여 양파 과피 분획물(EOP) 대비 유의적으로 우수한 수준의 세포보호효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
이러한 연구 보고를 고려할 때, 우리의 결과는 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP)이 나타내는 미토콘드리아의 기능 개선이 Aβ로 유도된 콜린성 시스템 장애 개선에도 상당한 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다.
또한, 플루오린화 나트륨(sodium fluoride)는 임신한 wister albino rat의 뇌조직에서 산화적 스트레스를 발생시킴으로써 인지 장애를 유발 하게 되는데, quercetin의 섭취는 효과적으로 SOD, GSH 및 catalase와 같은 항산화시스템을 향상시킴으로써 지질과산화물(MDA) 생성 억제를 유도하게 되고 이는 뇌세포의 구조 유지 및 인지기 능의 개선에 기여하는 것으로 보고하였다(Mesram 등, 2017). 이러한 연구를 고려할 때, 천연물 유래 플라보노이드 섭취가 생체내 방어시스템의 활성화에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다. 더불어, 양파에 함유되어 있는 것으로 알려진 quercetin을포함한 다양한 플라보노이드는 항산화 시스템을 향상시킴으로써 Aβ로 유도된 뇌조직 내 산화적 스트레스를 효과적으로 조절하여 인지기능 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
이를 종합해볼 때, 가식부로서의 양파 과육 또한 Aβ에 대한 인지기능을 개선시킬 수 있는 천연 식품소재로의 활용 가능성을 확인할 수 있었다.
전체 B-cell lymphoma (Bcl)-2-associated X protein (BAX) 대비 미토콘드리아 내 BAX 함량은 정상 대조군 대비 Aβ 군에서 증가한 것으로 나타났으며, 양파 과육 분획물 (EOF 20)과 과피 분획물 식이군(EOP 20)에서는 대조군 수준으로 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 5C, D).
특히, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP)는 모두 50 μg/mL 이상의 농도에서 양성 대조군보다 유의적으로 우수한 신경세포 보호효과를 나타냈다.
특히, 양파 과육 분획물(EOF)는 50 μg/mL 이상의 농도에서 과피 분획물(EOP)보다 유의적인 감소 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Aβ로 유도된 인지장애 마우스 모델에서의 행동실험(Y-미로, 수동회피 및 Morris 수중 미로 시험) 결과 또한 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 모두 효과적인으로 학습 및 기억능력을 개선시 키는 것으로 나타났다. 행동실험 후 마우스 뇌조직에서의 산화적 스트레스에 대한 생체 방어 기작의 일종인 SOD 함량의 증가, oxidized GSH/총 GSH 및 MDA 함량 감소를 나타냄에 따라 산화적 스트레스에 대한 우수한 항산화효과가 긍정적인 영향을 미친 것으로 판단된다. 또한, 뇌조직으로부터 분리한 미토콘드리아에 대하여 막 전위(MMP) 보호 및 ATP 함량 증가를 나타냈으며, 미토콘드리아와 관련된 apoptosis 경로에서 BAX의 감소 및 cytochrome c 방출 억제를 통해 caspase 3/7의 활성을 억제하는 것으 로도 나타났다.
후속연구
또한, 뇌조직으로부터 분리한 미토콘드리아에 대하여 막 전위(MMP) 보호 및 ATP 함량 증가를 나타냈으며, 미토콘드리아와 관련된 apoptosis 경로에서 BAX의 감소 및 cytochrome c 방출 억제를 통해 caspase 3/7의 활성을 억제하는 것으 로도 나타났다. 결국, 양파 과육 분획물(EOF)과 과피 분획물(EOP) 은 AChE의 활성 억제 및 ACh의 함량을 증가시킴으로써 효과적인 콜린성 시스템 보호효과를 나타냄에 따라, Aβ로 유도된 인지 기능 장애를 예방할 수 있는 고부가가치 건강기능식품 소재로의 활용 가능성이 기대된다.
더불어, 양파에 함유되어 있는 것으로 알려진 quercetin을포함한 다양한 플라보노이드는 항산화 시스템을 향상시킴으로써 Aβ로 유도된 뇌조직 내 산화적 스트레스를 효과적으로 조절하여 인지기능 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
이러한 연구들은 플라보노이드와 같은 생리활성물질을 포함하는 천연소재 유래 추출물들이 Aβ 로 유도될 수 있는 인지 장애에 대하여 효과적인 소재로 활용될수 있는 가능성을 제시하고 있으며, 양파 과육과 과피가 나타내는 우수한 학습 및 기억력 개선효과 또한 이러한 생리활성물질 들에 의한 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
quercetin은 어떤 생리활성을 가지고 있는가?
)는 전세계적으로 사용되는 주요 식용 채소로, 유황 및 기타 페놀성 화합물들과 같은 다양한 생리학적 물질을 포함하고 있으며, quercetin, isorhamnetin, kaempferol 및 그들의 배당체는 인체 폴리페놀의 주요 공급원인 것으로 알려져 있다(Price 등, 1997). 양파 과피 추출물 및 주요 생리활성 물질인 quercetin은 항균, 항산화, 항암, 항돌연변이, 항경련, 면역조절, 프리바이오틱 활성 및 심혈관 질환과 같은 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되고 있다(Corzo-Martnez 등, 2007). Shon 등 (2004)에 따르면, 양파 과육 또한 항산화, 항돌연변이, 항염증 저밀도 지단백 산화억제 효과 등과 같은 천연 항산화제로의 활용 가능성에 대한 연구 또한 보고되고 있지만, 인지기능 개선에 대한 효능 연구는 충분히 이루어지지 않고 있다.
미토콘드리아란?
미토콘드리아는 뇌조직에 필요한 에너지를 생산하는 주요 소기관으로, 생산된 에너지는 세포의 신호전달에 필수적이다(Reddy 와 Beal, 2008). 이러한 에너지 생산 과정에서 체내 80% 이상의 ROS가 생산되며, 정상적인 미토콘드리아는 ROS를 제거하는 데 도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
미토콘드리아 내부의 효소 중 cytochrome oxidase의 억제는 무엇을 유발하는가?
뿐만 아니라, 미토콘드리아 내부의 효소(α-ketoglutarate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase 및 cytochrome oxidase)는 Aβ로부터 유도 되는 산화적 스트레스에 취약하다. 특히, cytochrome oxidase의 억제는 respiratory chain complex 및 III에서의 전자 누출을 야기하고, 에너지 신진 대사의 불균형을 발생시킴으로써 ROS 형성을 유발한다(Sullivan과 Brown, 2005). 과잉 생산된 산화적 스트레스는 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP, Δϕm)를 감소시킴으로써 미토콘드리아의 분열을 야기하고 최종적으로 세포 기능 손상 및 사멸을 유도한다(Pagani와 Eckert, 2011; Sullivan과 Brown, 2005).
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