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문제 정의
- actinomycetemcomitans의 감소에 긍정적인 영향을 나타내었다. 따라서 본 연구는 L.reuteri 함유 Probiotics의 유익한 효과를 고려할 때 구강질환의 예방 및 촉진을 위한 보조제로 구강질환을 줄일 수 있음을 시사한다.
- actinomycetemcomitans (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)에 대한 억제 효과에 미치는 영향을 평가하고자 한다. 또한, biofilm 형성, 초기 산도, 완충 능력 및 산 생성능을 측정하여 치아 우식 유발능을 확인하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 L. reuteri를 함유한 Probiotics가 S. mutans와 A. actinomycetemcomitans (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)에 대한 억제 효과에 미치는 영향을 평가하고자 한다. 또한, biofilm 형성, 초기 산도, 완충 능력 및 산 생성능을 측정하여 치아 우식 유발능을 확인하고자 하였다.
- 즉, 구강 내 병원성 세균의 성장억제는 치아우 식증, 치주질환 등 구강질환뿐만 아니라 음식 섭취와 함께 소화기관으로 이동하여 당뇨병, 심혈관 질환 등 전신질환의 예방 및 치료에도 중요한 역할을 한다[18]. 이에 본 연구에서는 시판되는 L. reuteri 함유 Probiotics 가 구강 미생물의 억제 및 biofilm 형성 억제 작용을 하는지 평가하고자 하였다.
제안 방법
- L. reuteri Probiotics, 농후 발효유 용액에 1M NaOH를 첨가하여 pH 7로 중화시킨 후 S. mutans와 혼합 하여 2시간 간격으로 산도를 측정하였다. 6시간 경과 시 농후 발효유 실험군에서는 pH 5.
- 1 ml (1×10 6 CFU/ ml)을 접종하였다. S. mutans는 액체배지에서 24시간 배양 후 BHI 고체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양된 생균수(CFU)를 측정하였고, A. actinomycetemcomitans는 액체배지에서 24시간 배양 후 5% Sheep blood를 첨가한 Columbia 고체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 배양된 생균수(CFU)를 측정하였다.
- S. mutans와 A. actinomycetemcomitans는 96 well plate에 농후 발효유와 L. reuteri Probiotics를 각각 0%, 2.5%, 5%, 10%가 되도록 BHI 액체배지로 희석하여 0.1 ml씩 분주하고 각각 균주를 0.1 ml (1×10 6 CFU/ ml)을 접종하였다.
- 농후 발효유, L. reuteri Probiotics (증류수 1:1 혼합 용액) 각각 10 ml를 Falcon에 담아 초기 산도를 pHmeter (Cond 7110 meter, WTW inoLabⓇ , Germany)로 3회 측정 후 평균값을 구하였다. 완충능은 각 용액을 pH 7까지 변화시키는데 필요한 1M NaOH의 양으로 정의하며, 10 ml 용액에 1M NaOH를 첨가하여 혼합용액이 pH 7로 이르는데 때까지 주입된 NaOH의 부피를 측정하였다.
- 사용된 제품의 주요 구성성분은 <Table 1>에 각각 표시하였다. 대조군으로는 S. mutans 만을 배양 하여 관찰한 배지로 사용된 BHI 액체배지(Bacto TM brain heart infusion, Difco, USA)와 Columbia 액체배지 (Columbia broth, MB cell, 한국)는 제조사의 권장사항에 따라 증류수와 혼합하여 교반하고, 121℃에서 15 분간 고압증기 멸균을 시행하였다.
- mutans (KCTC 3065)는 한국생물자원센터에서 분양받아 37℃, 호기상 태에서 BHI 액체배지에 배양 후 실험에 사용하였고, 생균수 측정을 위하여 BHI 고체배지(Bacto TM brain heart infusion agar, Difco, USA)를 사용하였다. 또한, 치주질환 균주는 A. actinomycetemcomitans (KCTC 2581)를 37℃, 5% CO 2 호기상태에서 Columbia 액체배지에 배양하여 활성화시킨 후 실험을 진행하였고, 5% Sheep blood (Sheep blood, 시너지이노베이션, 한국)를 첨가한 Columbia 고체배지(Columbia broth agar, MB cell, 한국)를 이용하였다.
- 시판되는 농후 발효유와 L. reuteri 함유 Probiotics를 선택하여 구강미생물의 증식이나 biofilm 형성에 미치는 영향을 평가하고, 각 용액의 산도와 완충능, 산생성능을 측정하여 다음과 같은 결과가 관찰되었다.
- 5 ml (1×10 5 CFU/ml)을 첨가하였고 2초간 교반하였다. 이 용액을 37℃ 에서 8시간 배양하였으며, 2시간마다 꺼내어 변화된 pH를 pH-meter (Cond 7110 meter, WTW inoLab ⓡ , Germany)로 3회 측정하여 평균값을 구하였다.
- reuteri 함유 Probiotics로 drop 형태 (Prodentis, BioGaia AB, Sweden, 2×10 8 CFU/ml)와 농후 발효유(Bulgaris, 남양유업, 한국, 1×10 8 CFU/ml)를 사용하였다. 이에 실험군 1은 L. reuteri 함유 Probiotics 처리군, 실험군 2는 농후 발효유 처리군, 대조군은 배양 배지 처리 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 사용된 제품의 주요 구성성분은 <Table 1>에 각각 표시하였다.
- 이후 0.1% Crystal violet 0.05 ml를 주입하여 15분간 실온에서 염색하고 증류수 0.2 ml로 2회 세척한 후 99% 에탄올 0.2 ml로 녹여서 흡광도 측정기기(Multiskan ™ FC Microplate Photometer, Thermo Scientific ™ , USA)를 이용해 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 용액은 L. reuteri 함유 Probiotics로 drop 형태 (Prodentis, BioGaia AB, Sweden, 2×10 8 CFU/ml)와 농후 발효유(Bulgaris, 남양유업, 한국, 1×10 8 CFU/ml)를 사용하였다.
- 치아우식증과 관련된 우식 균주 S. mutans (KCTC 3065)는 한국생물자원센터에서 분양받아 37℃, 호기상 태에서 BHI 액체배지에 배양 후 실험에 사용하였고, 생균수 측정을 위하여 BHI 고체배지(Bacto TM brain heart infusion agar, Difco, USA)를 사용하였다. 또한, 치주질환 균주는 A.
데이터처리
- 05로 통계적 검정을 실시하였다. CFU 측정, biofilm 형성 결과는 대조군과 각 그룹의 농도별 차이는 one-way ANOVA를 시행하였으며, 두 실험군 간의 차이는 t-test를 실시하였다. 초기 산도및 완충능 실험은 one-way ANOVA를 통해 Tukey 사후검정을 이용하였다.
- IBM SPSS (Statistical Package for Social Science 24.0, Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 이용하여 분석 하였고, 유의수준(α)은 0.05로 통계적 검정을 실시하였다.
- 초기 산도및 완충능 실험은 one-way ANOVA를 통해 Tukey 사후검정을 이용하였다. 또한, 시간에 따른 산생성능 실험 결과는 two-way ANOVA를 시행하였으며 Scheffe로 사후검정하였다.
- CFU 측정, biofilm 형성 결과는 대조군과 각 그룹의 농도별 차이는 one-way ANOVA를 시행하였으며, 두 실험군 간의 차이는 t-test를 실시하였다. 초기 산도및 완충능 실험은 one-way ANOVA를 통해 Tukey 사후검정을 이용하였다. 또한, 시간에 따른 산생성능 실험 결과는 two-way ANOVA를 시행하였으며 Scheffe로 사후검정하였다.
성능/효과
- 1. S. mutans의 생균수 측정한 결과, 농후 발효유 8×10 6 CFU/ml, L. reuteri Probiotics 318×10 6 CFU/ml, 대조군 342×10 6 CFU/ml로 관찰되었으며, 농후 발효유에서 대조군과 L. reuteri Probiotics에 비해 유의미하게 S. mutans 억제 효과를 보였다(p<0.05).
- 2. 농도별 A. actinomycetemcomitans 흡광도 측정결과, 농후 발효유의 경우 농도가 증가할수록 높은 흡광도(optical density)를 나타내어 A. actinomycetemcomitans 생장이 유의미하게 증가하는 양상을 보인 반면, L. reuteri Probiotics의 경우 각 농도에서 농후 발효유와 비교 시 유의미하게 낮은 흡광도를 나타내어 .actinomycetemcomitans 생장이 억제됨을 관찰하였다(p<0.
- 2.5% 농도에서, L. reuteri Probiotics 및 농후 발효유의 흡광도는 유의한 차이가 있었다(p<0.01).
- 3. Biofilm 형성 실험결과, L. reuteri Probiotics와 농후 발효유에서 대조군과 비교하여 낮은 흡광도를 나타내어 biofilm 형성이 유의미하게 억제되는 양상을 보였다(p<0.01).
- 5. 완충능 측정결과 대조군, L. reuteri Probiotics, 농후 발효유 순으로 높게 나타났고, L. reuteri Probiotics 와 농후 발효유의 유의한 차이를 보였다(p<0.05).
- 6. 산생성능을 평가하기 위해 pH 7로 중화시킨 후 S. mutans를 접종하여 배양하고 2시간 간격으로 산도를 측정한 결과, 6시간 경과 시 농후 발효유는 pH 5.5 이하로 감소하였으나, L. reuteri Probiotics는 pH 6.6으로 유지되어 산생성능에 의한 pH 변화에서 집단 간의 유의한 차이가 있었다.
- mutans와 혼합 하여 2시간 간격으로 산도를 측정하였다. 6시간 경과 시 농후 발효유 실험군에서는 pH 5.5 이하로 감소였으 며, 8시간 경과 후 L. reuteri Probiotics 10%는 pH 6.6, 대조군은 pH 7.0으로 유지되었다. S.
- Biofilm 형성에서 L. reuteri Probiotics는 낮은 농도(2.5%)에서도 biofilm 형성이 억제되는 양상을 보였으 나, 농후 발효유의 경우에서도 높은 농도(5, 10%)에서 유의미하게 biofilm 형성이 억제되는 양상을 보여 Probiotics에 포함된 균의 종류에 따라 정도의 차이는 있지만 biofilm 형성을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 보인다. 이는 Soderling 등[20]의 연구에서 L.
- L. reuteri Probiotics, 농후 발효유, 대조군에 S. mutans를 동량 접종 후 생균수를 측정한 결과, 농후 발효 유는 8×10 6 CFU/ml, L. reuteri Probiotics 318×10 6 CFU/ml, 대조군 342×10 6 CFU/ml로 측정되었다.
- L. reuteri Probiotics, 농후 발효유에 S. mutans를 첨가한 후 biofilm 형성 정도를 비교 측정한 결과 [Fig.3], L. reuteri Probiotics, 농후 발효유 0%에서 높은 흡광도를 나타냈고, 0%와 비교하여 농도별 biofilm 감소 량에 유의한 차이가 있었다(p<0.01).
- L. reuteri Probiotics, 농후 발효유의 농도별 A. actinomycetemcomitans 흡광도 측정결과, 농후 발효유의 경우 농도별 측정에서 농도가 높아질수록 높은 흡광도(optical density)를 나타내어 A. actinomycetemcomitans 생장이 유의미하게 증가하는 양상이 관찰되었다. 하지만 L.
- 0으로 유지되었다. S. mutans의 산생 성능에 의한 pH 변화에는 집단 간의 유의한 차이가 있었다.[Fig.
- actinomycetemcomitans 생장이 억제됨을 관찰하였다(p<0.01).
- pH 7까지 이르는데 필요한 1M NaOH 양으로 정의하는 완충능은, 대조군 0 ml, L.reuteri Probiotics 0.07 ml, 농후 발효유가 0.73 ml로 높게 나타났으며, L. reuteri Probiotics와 농후 발효유의 유의한 차이를 보였다(p<0.05).
- Katz 등[23]은 타액 완충능 뿐만 아니라 식품 고유 완충능 또한 구강 내 타액 및 플라그 형성에 영향을 줄 수 있다고 하였고, 허 등[24]은 고유 pH가 중성에 가깝고 식품의 고유 완충능이 높으면 식품 자체가 구강 내 산도를 중화시킬 수 있어 탈회를 예방할 수 있다고 보고하여 본 연구결과를 지지한다. 또한, 본 연구에서 각 용액에 S. mutans를 접종 후 8시간 배양하여 산생성능을 평가한 결과, 6시간 경과 시 농후 발효유는 pH 5.5 이하를 나타내 탈회임계점을 넘어섰고, L. reuteri Probiotics는 pH 6.5로 중성에 가까운 수치를 보여 유산이 생성되어 pH 변화가 큰 농후 발효유와 달리 L. reuteri Probiotics에 함유된 Probiotics에서 유당의 분해가 이루어지지 않아 산생성능의 변화가 적은 것으로 생각된다[25].
- reuteri Probiotics의 효과를 비교 분석하고 제품에 포함된 다양한 합성물의 차이를 분석하는 구체적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한, 본연구결과에서 S. mutans 감소 효과가 없었던 이유는 L. reuteri Probiotics와 S. mutans 희석 비율이 낮은데서 기인한 것으로 L. reuteri Probiotics가 S. mutans 억제 효과를 나타내기에는 충분한 균수에 도달하지 못했을 것으로 생각되며, 이는 사용한 특정 제품에 함유된 균수가 변수로 작용하였을 것으로 판단된다. 이에 Probiotics에 함유된 유익한 균들이 구강환경에서 영향력을 미치는지 정제형 Probiotics와 껌 type 중 어느 것에 더 유의성이 있는지 검증이 필요할 것으로 생각되며, 향후 이에 관한 추가적인 연구가 더 진행되어야 할것으로 사료된다.
- 반면, 대조군과 비교 시 L. reuteri Probiotics의 S. mutans 세균 억제 효과는 관찰되지 않았으며, 두 실험군 간비교 시 농후 발효유가 L. reuteri Probiotics에 비해 유의미하게 S. mutans 세균 생장 억제 효과를 보임을 확인하였다(p<0.05)[Fig. 1]
- 본 연구결과 치아우식증을 일으키는 S. mutans 사멸 효과에서 농후 발효유가 L. reuteri Probiotics와 대조 군에 비하여 높은 S. mutans 사멸 효과를 보였다. Nikawa 등[14]의 연구에서 S.
- reuteri Probiotics 318×10 6 CFU/ml, 대조군 342×10 6 CFU/ml로 측정되었다. 생균수 측정에서 대조군과 비교 시 농후 발효유에서 유의미한 S. mutans의 생장을 억제하는 양상이 관찰되었다.반면, 대조군과 비교 시 L.
- 이러한 결과는 L. reuteri 함유 Probiotics가 biofilm 형성, 초기 산도 및 산생성능을 적게 유도하며, 치주질 환을 유발하는 A. actinomycetemcomitans의 감소에 긍정적인 영향을 나타내었다. 따라서 본 연구는 L.
- 특히 2.5%의 L. reuteri Probiotics 낮은 농도에서도 농후 발효유보다 현저하게 biofilm 형성이 억제됨을 관찰하였다(p<0.01).
- 하지만 L. reuteri Probiotics의 흡광도는 농후 발효유의 흡광도보다 현저히 낮게 나타나, L. reuteri Probiotics에 의하여 A. actinomycetemcomitans 생장이 억제됨을 확인하였다(p<0.01)[Fig. 2].
후속연구
- 본 연구의 제한점으로는 L. reuteri 함유 Probiotics의 특정 제품을 선택하여 평가한 in vitro 연구로 특정 제품에 함유된 합성물에 의한 변수가 있었을 것으로 생각된다. 이에 향후에는 시중에 판매되는 다양한 제품의 L.
- actinomycetemcomitans 90% 이상의 사멸 효과를 보인다는 연구결과와 유사함을 보였다. 이것은 L. reuteri가 우식유발균으로 알려진 S. mutans에 의한 치태형성 억제 및 치주질환 유발균인 A. actinomycetemcomitans 형성을 억제한 긍정적인 영향을 보이며, 장관계(장내)에 효능이 입증된 Probiotics가 구강 병원균을 억제하는 목적으로 활용될 수 있음을 보여준다고 사료된다.
- 이에 Probiotics에 함유된 유익한 균들이 구강환경에서 영향력을 미치는지 정제형 Probiotics와 껌 type 중 어느 것에 더 유의성이 있는지 검증이 필요할 것으로 생각되며, 향후 이에 관한 추가적인 연구가 더 진행되어야 할것으로 사료된다. 이러한 연구 제한점에도 불구하고 본 연구는 L. reuteri 함유 Probiotics가 치주질환을 유발 하는 구강미생물의 증식이나 biofilm 형성에 미치는 영향 및 산도와 완충능, 산생성능 측정을 통해 우식유발 능을 평가함으로써 구강질환 예방 및 증진을 위한 보조제로서의 L. reuteri 함유 Probiotics 활용에 대한 기초 자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
- mutans 억제 효과를 나타내기에는 충분한 균수에 도달하지 못했을 것으로 생각되며, 이는 사용한 특정 제품에 함유된 균수가 변수로 작용하였을 것으로 판단된다. 이에 Probiotics에 함유된 유익한 균들이 구강환경에서 영향력을 미치는지 정제형 Probiotics와 껌 type 중 어느 것에 더 유의성이 있는지 검증이 필요할 것으로 생각되며, 향후 이에 관한 추가적인 연구가 더 진행되어야 할것으로 사료된다. 이러한 연구 제한점에도 불구하고 본 연구는 L.
- reuteri 함유 Probiotics의 특정 제품을 선택하여 평가한 in vitro 연구로 특정 제품에 함유된 합성물에 의한 변수가 있었을 것으로 생각된다. 이에 향후에는 시중에 판매되는 다양한 제품의 L.reuteri 함유 Probiotics를 사용하여 플라그 형성 및 구강 질환발생에 대한 L. reuteri Probiotics의 효과를 비교 분석하고 제품에 포함된 다양한 합성물의 차이를 분석하는 구체적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한, 본연구결과에서 S.
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