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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 OECD 가이드라인에 따라 서양 뒤영벌에 대한 네오니코티노이드계 농약 4종(clothianidin, dinotefuran, imidacloprid, thiamethoxam)의 급성 접촉 및 섭식 독성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 최근 발표된 OECD 뒤영벌 급성독성시험법을 따라 네오니코티노이드계 농약에 대한 서양뒤영벌 급성 독성을 평가하였다. 본 시험결과는 네오니코티노이드계 농약에 대한 서양뒤영벌의 기초 독성자료로 활용될 수 있을 것이다.
제안 방법
- 시험 전 서양뒤영벌은 적색 조명하에서 무작위로 선발되었으며 개별 체중을 잰 뒤 너무 작거나(<150 mg) 큰 것(>300 mg) 은 시험에서 제외하였다. 한 처리군당 1마리씩 30반복으로 시험을 수행하였다. 선별된 서양뒤영벌은 15 ㎤ 크기의 환기 가 가능한 플라스틱 개별 시험용기(roller queen cage, 메인 양봉원)에 한 마리씩 넣어 시험용기 거치대에 15개씩 나란히 배열하였으며 최소 8시간 동안 시험조건에 순응시켰다.
- 한 처리군당 1마리씩 30반복으로 시험을 수행하였다. 선별된 서양뒤영벌은 15 ㎤ 크기의 환기 가 가능한 플라스틱 개별 시험용기(roller queen cage, 메인 양봉원)에 한 마리씩 넣어 시험용기 거치대에 15개씩 나란히 배열하였으며 최소 8시간 동안 시험조건에 순응시켰다. 순응 기간 동안 50% w/v 자당용액을 팁이 제거된 2mL 주사기에 주입하여 먹이로 제공하였다.
- 네오니코티노이드계 4종 약제 처리군은 clothianidin(0.15-2.4 μg a.i./bumblebee), dinotefuran (0.625-10.0 μg a.i./bumblebee), imidacloprid(0.5-8.0 μga.i./bumblebee), thiamethoxam(0.3-4.8 μg a.i./bumblebee) 의 처리량 범위에서 공비 2로 하여 5단계로 설정하였다.
- Clothianidin, dinotefuran, thiamethoxam 처리군의 경우 약제 처리 후 24시간과 48시간 뒤의 사망개체수가 동일하여 48시간까지 관찰하였으며, imidacloprid 처리군의 경우 1.0-8.0 μg a.i./bumblebee의 처리량 범위에서 사망률이 10% 이상 증가했기 때문에 96시간까지 연장 관찰하였다
- 시험약제는 50% 자당용액을 혼합하여 제조하였으며 약제용 주사기의 팁에 40 μL씩 주입하여 4시간 동안 급여하였다.
- 네오니코티노이드계 4종 약제 처리군 은 clothianidin(0.001-0.016 μg a.i./bumblebee), dinotefuran (0.02-0.32 μg a.i./bumblebee), imidacloprid(0.04-0.64 μg a.i./bumblebee), thiamethoxam(0.005-0.08 μg a.i./ bumblebee)의 처리량 범위에서 공비 2로 하여 5단계로 설정하였다.
- 시험용액의 균일한 도포를 위해 계면활성 제인 triton-X 100 (Sigma Aldrich, USA)를 시험용액 중 0.1%로 첨가하였으며, CO2로 마취시킨 후 multipette M4 pipette(Eppendorf, Germany)를 사용하여 서양뒤영벌 흉부에 5 μL씩 처리하였다.
- Dinotefuran은 증류수를 용매로 사용하였다. 시험용액 제조에 사용된 아세톤 또는 증류수는 각 약제 처리군의 용매대조 군으로 사용하였다. 시험용액의 균일한 도포를 위해 계면활성 제인 triton-X 100 (Sigma Aldrich, USA)를 시험용액 중 0.
- Dinotefuran은 증류수를 용매로 사용하였다. 시험용액 제조에 사용된 아세톤 또는 증류수는 각 약제 처리군의 용매대조 군으로 사용하였다. 시험용액의 균일한 도포를 위해 계면활성 제인 triton-X 100 (Sigma Aldrich, USA)를 시험용액 중 0.
- 1%로 첨가하였으며, CO2로 마취시킨 후 multipette M4 pipette(Eppendorf, Germany)를 사용하여 서양뒤영벌 흉부에 5 μL씩 처리하였다. 약제 처리군별 농도 수준당 30반복으로 시험하였다. 약제 처리 4, 24, 48시간 후의 이상증상 및 사망개체 수를 기록하였으며, 24시간과 48시간의 사망률 차이가 10% 이상 일 경우 72시간 및 96시간까지 연장하여 관찰하였다.
- 약제 처리군별 농도 수준당 30반복으로 시험하였다. 약제 처리 4, 24, 48시간 후의 이상증상 및 사망개체 수를 기록하였으며, 24시간과 48시간의 사망률 차이가 10% 이상 일 경우 72시간 및 96시간까지 연장하여 관찰하였다.
- 약제 처리군별 농도 수준당 30반복으로 시험하였다. 약제 처리 4, 24, 48시간 후의 이상증상 및 사망개체 수를 기록하였으며, 24시간과 48시간의 사망률 차이가 10% 이상 일 경우 72시간 및 96시간까지 연장하여 관찰하였다.
- 약제 노출 후 4시간, 24시간, 48시간의 사망개체 및 이상 증상을 관찰하였으며 약제 처리군에서 24시간과 48시간 사이의 사망률이 10% 이상 증가할 경우 96시간까지 관찰한 후 시험을 종료하였다. 약제 노출 후 이상증상이 나타나지 않는 상태(unaffected, U), 움직임은 있지만 신체 조정력이 감소된 상태(affected, A), 다리와 더듬이의 움직임이 매우 약하고, 자극에 대한 반응이 매우 적으며 걷지 못하는 상태(moribund, M), 죽어서 아무런 움직임을 보이지 않는 상태(dead, D)로 구분하여 관찰한 뒤 기록하였다.
- 약제 노출 후 4시간, 24시간, 48시간의 사망개체 및 이상 증상을 관찰하였으며 약제 처리군에서 24시간과 48시간 사이의 사망률이 10% 이상 증가할 경우 96시간까지 관찰한 후 시험을 종료하였다. 약제 노출 후 이상증상이 나타나지 않는 상태(unaffected, U), 움직임은 있지만 신체 조정력이 감소된 상태(affected, A), 다리와 더듬이의 움직임이 매우 약하고, 자극에 대한 반응이 매우 적으며 걷지 못하는 상태(moribund, M), 죽어서 아무런 움직임을 보이지 않는 상태(dead, D)로 구분하여 관찰한 뒤 기록하였다.
- 선행 연구들을 통해서 꿀벌 및 뒤영벌의 네오니코티노이드계 농약에 대한 급성 접촉 독성값(LD50)을 얻을 수 있었으며 Table 6과 같이 본 시험결과와 비교하였다. 일반적으로 벌의 크기가 작을수록 체표면적의 비가 높아지기 때문에 농약에 대한 민감도가 더 큰 것으로 알려져 있으며(EFSA, 2012), 뒤영 벌의 크기에 따른 비교에서 크기가 큰 그룹(0.
- Table 4는 네오니코티노이드계 농약 4종의 섭식 노출에 따른 사망개체수를 나타낸다. Clothianidin, dinotefuran, thiamethoxam 처리군은 약제 처리 후 24시간과 48시간 사 이의 사망개체수 차이가 10% 미만으로 나타나 48시간에서 관찰을 종료하였다. Imidacloprid 처리군의 경우 0.
대상 데이터
- 급성 접촉독성시험의 양성대조군은 dimethoate(10 μg a.i./ bumblebee)를 사용하였다.
- 본 시험에 사용한 서양뒤영벌(Bombus terrestris)은 무작위 선발한 건강한 일벌로 국립농업과학원 곤충산업과에서 사양 관리되고 있는 3개 이상의 건강한 봉군에서 제공받아 시험을 진행하였다.
- 서양뒤영벌의 급성 접촉 및 섭식 독성시험에 사용된 시험 물질은 네오니코티노이드계 농약의 원제로 clothianidin (99.0%), dinotefuran(98.0%), imidacloprid(99.0%) 및 thiamethoxam(99.0%)이며 모두 Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 양성 대조군으로는 dimethoate(98.
- Ehrenstorfer (Augsburg, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 양성 대조군으로는 dimethoate(98.5%, Dr. Ehrenstorfer)을 사용하였다.
- 급성 섭식독성시험의 양성대조군은 dimethoate(4 μg a.i./ bumblebee)를 사용하였다.
- /bumblebee) 의 처리량 범위에서 공비 2로 하여 5단계로 설정하였다. Clothianidin, imidacloprid, thiamethxam의 경우 아세톤을 용매로 사용하였으며 시험용액 중 함량은 4%로 하였다. Dinotefuran은 증류수를 용매로 사용하였다.
- Clothianidin, imidacloprid, thiamethxam의 경우 아세톤을 용매로 사용하였으며 시험용액 중 함량은 4%로 하였다. Dinotefuran은 증류수를 용매로 사용하였다. 시험용액 제조에 사용된 아세톤 또는 증류수는 각 약제 처리군의 용매대조 군으로 사용하였다.
- 시험약제는 50% 자당용액을 혼합하여 제조하였으며 약제용 주사기의 팁에 40 μL씩 주입하여 4시간 동안 급여하였다. 급성 섭식독성시험은 제공 먹이를 80% 미만으로 섭취한 개체 (non-feeder)를 제외해야 하기 때문에, 처리군당 45마리 이상 처리하고 이 중 non-feeder를 제외하여 30마리를 선별하여 시험하였다.
데이터처리
- 각 시험군의 체중값은 평균±표준편차로 표시하였으며, 약제 처리군간의 통계적 유의한 차이가 있는지 확인하기 위해 SPSS ver 20(IBM, Chicago, IL, USA)을 사용하여 비모수검정인 Kruskal-Wallis tests를 실시하였다.
- 05로 하였다. 시험물질의 독성 시험 결과는 EPA probit analysis program (ver 1.5)을 사용하여 LD50 및 95% 신뢰 한계를 산출하였다.
성능/효과
- 시험 진행 및 관찰 기간 동안 암실조건에서 온도는 25± 2℃, 상대습도는 60±20%를 유지하였다.
- OECD TG 246(OECD, 2017)의 시험 유효성 기준에 따르면 관찰 종료시 용매 대조군의 사망률이 10% 미만, 양성대 조군의 사망률이 50% 이상 나타나야 한다. 용매 대조군에서 시험기간 동안 사망 개체는 관찰되지 않았으며, 양성대조군에서는 노출 48시간 후 사망률은 70%로 나타나(Table 2) OECD 시험기준에 적합하였다.
- 약제 처리 후 24시간 뒤에 clothianidin, dinotefuran, thiamethoxam 처리군은 각각 0.6, 5.0, 1.2 μg a.i./ bumblebee 이상의 처리량에서 56.7%~100%의 사망률을 나 타냈다(Table 3).
- 4.0, 8.0 μg a.i./bumblebee 처리량에서 약제 처리 후 4시간뒤에 90% 이상이 이미 빈사(moribund)상태였으며 시간이 경과함에 따라 점차 사망상태로 나타난 것으로 판단된다.
- 본 시험의 경우 접촉 후 초기 4시간에서는 소량 0.5 μg /bumblebee 처리군에서 다량 8 μg /bumblebee 처리군 보다 사망률이 높게 나타났지만 24시간 이후부터는 다량처리군에서 사망개체수가 점차 증가하여 96시간 후에 사망률이 70% 이상 나타났다.
- 각 농약의 접촉 노출 48시간 후 사망수를 토대로 LD50값 (μg a.i./bumblebee)을 산출한 결과 clothianidin(0.467) > thiamethoxam (0.747) > dinotefuran(3.741) > imidacloprid (3.967) 순으로 뒤영벌에 독성이 있음을 나타냈다.
- 967) 순으로 뒤영벌에 독성이 있음을 나타냈다. 하지만 imidacloprid 경우 약제 처리 후 시간이 경과함에 따라 사망률 이 높아지는 경향을 보였으며 약제 처리 96시간 후 LD50값(1.64)은 48시간 후 값(3.97)에 비해 2.41배 더 큰 독성을 나타냈다 (Table 5).
- 본 시험에서 clothianidin과 imidacloprid의 48시간 LD50 값은 각각 0.467, 3.967 μg a.i./bumblebee로 clothianidin 이 독성이 약 8.5배 강하게 나타났으며, 선행 연구 결과에서도 clothianidin과 imidacloprid의 LC50(%solutionⅹ10-3)값이 각각 0.39, 3.22로 clothianidin의 독성 값이 약 8배 강하게 나타나 본 시험과 비슷한 결과를 보여주었다[21].
- 본 시험의 무처 리군 및 양성대조군인 dimethoate 4 μg a.i./bumblebee 처 리군은 약제 노출 48시간 후 사망률이 각각 0%, 93.3%로 나 타나 OECD TG 247(OECD, 2017)시험 기준에 적합하였다 (Table 2).
- 68로 반대의 결과 를 나타냈다[20, 21]. 본 시험의 결과와 문헌에 보고된 꿀벌 독성치를 비교해 보면, LD50값 비율이 0.004-0.084로 꿀벌이 훨씬 더 민감한 것으로 판단된다.
- 각 농약의 48시간 섭식 LD50값(μg a.i./bumblebee)을 산출한 결과 clothianidin(0.005), thiamethoxam(0.018), dinotefuran(0.056), imidacloprid(0.325) 순으로 서양뒤영 벌에 대한 독성이 큰 것으로 나타났다(Table 5).
- 본 시험 96시간 기준 독성영향을 보면 imidacloprid의 접촉 및 섭식 LD50값이 각각 1.643, 0.168 μg a.i./bee로 clothianidin 다음으로 높은 독성을 나타냈다.
- Imidacloprid 처리군에서는 접촉독성시험 결과와 같이 약제처리 후 시간 경과에 따라 사망개체수가 점점 증가하는 경향을 나타냈다. 이러한 경향은 꿀벌에서 선행 연구한 결과 에서도 관찰되었다.
- 이러한 경향은 꿀벌에서 선행 연구한 결과 에서도 관찰되었다. Imidacloprid 섭식 노출 후 4시간부터 빠르게 독성 증상이 나타났으며 100시간 동안 점진적으로 사 망률이 증가하였다. 이와 같은 지연효과(delayed action)는 imidacloprid가 대사되어 생성되는 olefin 등과 같은 대사체들이 더 큰 독성을 나타내며 장기간 잔류 독성(long-term residual effectiveness)을 유발하는 것으로 판단된다[17].
- 네오니코티노이드계 농약 4종에 대한 섭식독성시험 결과 꿀벌과 뒤영벌간의 독성 민감도 비(꿀벌 LD50/뒤영벌 LD50) 는 0.12-0.7로 꿀벌이 더 민감한 것으로 나타났다(Table 6). 이러한 결과는 사회성 벌과 단독벌간에 먹이방식(그룹 및 개 별 먹이방식)의 차이가 하나의 요인이 될 수 있다[15].
- 본 연구에서는 뒤영벌에 대한 네오니코티노이드계 농약 독성을 접촉과 섭식 두 가지 노출경로로 평가하였으며 섭식 독성이 더 큰 것으로 나타났다. 반면 선행연구결과에 의하면 유기인계 농약인 chlorpyrifos(contact LD50=0.
후속연구
- 본 연구에서는 최근 발표된 OECD 뒤영벌 급성독성시험법을 따라 네오니코티노이드계 농약에 대한 서양뒤영벌 급성 독성을 평가하였다. 본 시험결과는 네오니코티노이드계 농약에 대한 서양뒤영벌의 기초 독성자료로 활용될 수 있을 것이다. 향 후 본 시험법을 활용하여 네오니코티노이드계 농약뿐 만 아니라 화분매개충에 위해가능성이 있는 농약에 대한 서양뒤영벌 독성 정보를 제공할 수 있을 것이라고 생각된다.
- 본 시험결과는 네오니코티노이드계 농약에 대한 서양뒤영벌의 기초 독성자료로 활용될 수 있을 것이다. 향 후 본 시험법을 활용하여 네오니코티노이드계 농약뿐 만 아니라 화분매개충에 위해가능성이 있는 농약에 대한 서양뒤영벌 독성 정보를 제공할 수 있을 것이라고 생각된다.
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