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문제 정의
- 따라서 본 연구는 생약재 품목 중 약용부위별 잔류농약 검출 빈도가 비교적 높은 당귀(當歸, Angelica gigas Nakai ), 천궁(川芎, Cnidii Rhizoma ), 구기자(拘杞子, Lycii Fructus ), 대추(待秋, Zizyphi Fructus )를 대상으로 식품공전 중 다종농약다성분 분석법-제2법의 전처리 방법을 일부 변형하여 전처리한 후 GC-MS/MS와 LC-MS/MS를 이용하여 각각의 기기분석 조건을 확립한 후 분석하여 다종농약다성분 분석법의 생약재 중 적용가능성을 검증하고자 하였다.
제안 방법
- 이는 시료 중 함유된 ug/kg 수준의 미량의 잔류농약의 검출이 가능할 것으로 판단되었다. 각각의 표준용액으로부터 acetone과 methanol로 희석하여 6단계의 농도별 분석용 작업표준용액을 제조하였으며, 이를 이용하여 GC-MS/MS와 LC-MS/MS에 주입하여 얻은 chromatogram 의 피크면적을 이용하여 검량선을 작성하였다. 이를 통해 얻은 검량선의 직선성은 양호하였으며, 각각의 상관계수(r2)는 모두 0.
- 4 mL/min, 주입량은 2 μL로 하였다. 간섭물질의 방해를 배제하고, 정량적인 분석이 가능한 multiple reaction monitoring(MRM) 조건을 설정하고자 261성분의 각각의 농약을 acetone과 methanol을 사용하여 100 ug/L 수준으로 희석하였고 full scan mode에서 각 물질의 모분자(precursor ion)의 질량스펙트럼을 확인한 후 최적의 충돌에너지(collision energy)를 선택하여 생성된 조각이온(daughter ion) 중 최적의 이온을 선택하였다. GC-MS/MS 분석대상 농약 102종과 LC-MS/MS 분석대상 농약 159종에 대한 MRM조건은 각각 Table 1과 2에 나타내었다.
- 잔류분석법의 효율성과 신뢰성을 검정하기 위하여 회수율 시험을 진행하였으며, 각 농약에 대한 회수율 시험은 20, 50, 100 ug/kg 수준에서 5반복 결과를 확인하였다. 검출한계(limits of detection, LOD)와 정량한계(limits of quantification, LOQ)는 MS/MS상에서 측정 가능한 최소 검출량을 이용하여 아래 식에 따라 산출하였으며, LOD는 S/N ratio 3 이상, LOQ는 S/N ratio 10 이상을 기준으로 측정하였다.
- 시험에 사용된 생약재 시료는 분쇄기를 이용하여 균질화한 후 blank 시료 및 회수율 시험에 사용하였다. 균질화된 당귀, 천궁, 구기자, 대추 각각의 시료 10 g을 200 mL centrifuge용 bottle에 넣고 증류수 40 mL를 첨가하여 1시간 동안 습윤 시킨 후 acetonitrile 50 mL 넣고 NaCl 1 g 및 MgSO4 4 g을 첨가하여 10분간 진탕 추출하였다. 각 추출물을 원심분리기(Avanti J-15R, Beckman coulter, USA)로 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다.
- 2 ㎛ syringe (PTFE) filter (WhatmanⓇ, USA)로 여과한 후 분석시료로 사용하였다. 농약성분의 정량 분석을 위한 검량선은 각각의 표준품을 각각의 용매에 녹여 1,000 mg/L의 stock solution을 조제한 후 무처리 시료 추출액과 혼합하여 10, 20, 50, 100, 200 및 500 ug/L 농도로 matrix matched calibration을 작성하였다.
- 생약재 중 잔류농약을 분석하기 위한 전처리방법은 적은 양의 시료를 짧은 시간동안 진탕추출하기 때문에 균질화된 시료의 확보가 무엇보다 중요하다. 따라서 균질화 측면에서 전처리 시험방법은 식품공전 중 다종농약다성분 분석법-제2법을 변형하여 사용하였다(MFDS, 2017). 식품공전 시험법 중 추출 후 감압여과 대신 원심분리를 통한 전처리방법을 적용하였다.
- Matrix에 의해 강한 영향을 받는 성분들은 천궁의 경우 alachlor 등 75종, 당귀의 경우 acetamiprid 등 69종, 구기자의 경우 acetamiprid 등 69종, 대추의 경우 acetamiprid 등 50종이었다. 또한, 농약의 물리화학적 특성 중 기본적인 계수인 옥탄올/물 분배계수 Kow (log P)값을 3이하와 3이상의 두 개 그룹으로 나누어 품목별 matrix effect 영향을 알아보았다. Kow (log P)값이 3이하인 경우 구기자를 제외한 천궁, 당귀, 대추에서 suppression 되는 경향이 크다는 것을 알 수 있었으며, Kow (log P)값이 3이상에서는 구기자, 대추에 비해 천궁, 당귀가 suppression과 enhancement에 의한 matrix 영향이 다소 크다는 것을 알 수 있었다.
- 마지막으로, 농약성분의 화학적 성분이나 조성에 따라 품목별 matrix effect 영향을 알아보고자 261 성분을 2,6-dinitroaniline, amide, anilide, azole, organochlorine, organophosphorus, carbamate, pyrethroid, thiocarbamate 및 urea로 분류하였다. Pyrethroid계의 경우 4품목에서 모두 enhancement에 의해 잔류량이 증가된 것으로 나타났는데 이 약제들의 Kowlog P값은 4이상이었다.
- 잔류농약 분석 시 matrix effect (suppression 혹은 enhancement)의 원인은 서로 다른 반응과 현상에 의해 결정 되는데, 수많은 시료와 농약성분의 반응을 명확히 규명하는 것은 매우 어렵기 때문에 본 연구의 matrix effect 검증은 변동 폭에 따른 간섭 정도에 초점을 두어 표준농약성분의 chromatogram상 피크 면적의 수치를 기준으로 측정하였다. 생약재 4품목 각각의 무처리 농산물 시료 추출용액을 이용하여 검량선 작성시 만든 matrix matched standard를 비교하여 matrix effect를 조사하였다. Matrix effect의 산출은 solvent standard의 피크 면적과 matrix matched standard의 피크 면적의 비로 판단하며, 다음과 같은 식으로 산출하여 백분율로 나타내었다[9, 10].
- 따라서 균질화 측면에서 전처리 시험방법은 식품공전 중 다종농약다성분 분석법-제2법을 변형하여 사용하였다(MFDS, 2017). 식품공전 시험법 중 추출 후 감압여과 대신 원심분리를 통한 전처리방법을 적용하였다. 시험에 사용된 생약재 시료는 분쇄기를 이용하여 균질화한 후 blank 시료 및 회수율 시험에 사용하였다.
- 실제로 2009-2012년도 식품의약품안전처 보고서에 의하면 기존에 고시된 생약재 중의 다종농약다성분 분석법은 액/액 분배시 층분리가 잘 되지 않아 농약의 분리가 용이하지 않았으며, 기기분석 상에서 간섭피크가 많이 발생하여 회수율 및 재현성이 떨어지는 것으로 나타나 좀 더 정밀하고 정확한 분석법의 개선이 필요하다고 서술하였다. 이를 개선하고자 다종농약다성분 분석 성분 중 적용하기 어려운 성분들을 대상으로 물리화학적 특성을 조사하였고 생약재의 종류별 특성을 고려해 생약재 품목별로 특화된 단성분 분석법을 제시하였다(MFDS, 2009-2012).
- 잔류농약 분석 시 matrix effect (suppression 혹은 enhancement)의 원인은 서로 다른 반응과 현상에 의해 결정 되는데, 수많은 시료와 농약성분의 반응을 명확히 규명하는 것은 매우 어렵기 때문에 본 연구의 matrix effect 검증은 변동 폭에 따른 간섭 정도에 초점을 두어 표준농약성분의 chromatogram상 피크 면적의 수치를 기준으로 측정하였다. 생약재 4품목 각각의 무처리 농산물 시료 추출용액을 이용하여 검량선 작성시 만든 matrix matched standard를 비교하여 matrix effect를 조사하였다.
- 잔류분석법의 효율성과 신뢰성을 검정하기 위하여 회수율 시험을 진행하였으며, 각 농약에 대한 회수율 시험은 20, 50, 100 ug/kg 수준에서 5반복 결과를 확인하였다. 검출한계(limits of detection, LOD)와 정량한계(limits of quantification, LOQ)는 MS/MS상에서 측정 가능한 최소 검출량을 이용하여 아래 식에 따라 산출하였으며, LOD는 S/N ratio 3 이상, LOQ는 S/N ratio 10 이상을 기준으로 측정하였다.
- 컬럼은 DB-5MS (30 m × 0.25 mm × 250 μm, Agilent, USA)을 사용하였고 oven 온도를 70℃에서 시작하여 승온 프로그램을 설정하여 300℃까지 올려 34.5분 이내에 모든 농약성분이 분리되도록 하였다.
- 컬럼은 역상 칼럼인 BEH-C18 (2.5 mm I.D x 100 mm L, 1.7 μm, waters, USA)을 사용하였고 0.1% formic acid가 함유된 acetonitrile과 0.1% formic acid가 함유된 증류수를 사용하여 최적화된 기울기 용리방식으로 12분 이내에 모든 농약 성분이 분리되도록 하였다.
- 품목별 261성분에 대한 matrix effect는 matrix matched standard와 solvent standard를 비교하여 산출하였다. Matrix effect 판단 시 ±20~50%의 수준은 약간의 영향을 받는 수준이며, 그 이상은 matrix에 강한 영향을 받는 수준으로 평가한다[13-15].
대상 데이터
- 시험에 사용한 acetone, acetonitrile, dichloromethane, methanol, hexane은 Merck (Germany)사의 잔류분석용 시약을 구입하여 사용하였으며, 3차 증류수는 Milipore사의 Mili-Q Direct8 system (USA)을 사용하였다. Sodium chloride 및 magnesium sulfate는 Merck (Germany)사의 제품을 구입하여 사용하였다.
- 시험대상 농약은 생약재 중 잔류허용기준이 설정된 성분을 포함 비교적 검출이력이 높은 fungicide 70성분, herbicide 56성분, insecticide 129성분, insect growth regulator 2성분, plant growth regulator 2성분, nematicide 1성분, acaricide 1성분 등 총 261성분이었다. 분석에 사용한 표준품은 Dr. Ehrenstorfer (Germany), Sigma-Aldrich (USA), Wako (Japan), AccuStandardⓇ (USA)에서 구입하여 사용하였다. 각각의 농약 표준품은 용매에 따른 용해도를 고려하여 acetone과 methanol으로 1,000 mg/L의 stock solution을 제조하였다.
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다성분 분석대상 농약 및 시약
시험대상 농약은 생약재 중 잔류허용기준이 설정된 성분을 포함 비교적 검출이력이 높은 fungicide 70성분, herbicide 56성분, insecticide 129성분, insect growth regulator 2성분, plant growth regulator 2성분, nematicide 1성분, acaricide 1성분 등 총 261성분이었다. 분석에 사용한 표준품은 Dr.
- 식품공전 시험법 중 추출 후 감압여과 대신 원심분리를 통한 전처리방법을 적용하였다. 시험에 사용된 생약재 시료는 분쇄기를 이용하여 균질화한 후 blank 시료 및 회수율 시험에 사용하였다. 균질화된 당귀, 천궁, 구기자, 대추 각각의 시료 10 g을 200 mL centrifuge용 bottle에 넣고 증류수 40 mL를 첨가하여 1시간 동안 습윤 시킨 후 acetonitrile 50 mL 넣고 NaCl 1 g 및 MgSO4 4 g을 첨가하여 10분간 진탕 추출하였다.
- 각각의 stock solution은 일정량을 취한 후 acetone과 methanol로 표선하여 10 mg/L 혼합 working solution을 제조하였다. 시험에 사용한 acetone, acetonitrile, dichloromethane, methanol, hexane은 Merck (Germany)사의 잔류분석용 시약을 구입하여 사용하였으며, 3차 증류수는 Milipore사의 Mili-Q Direct8 system (USA)을 사용하였다. Sodium chloride 및 magnesium sulfate는 Merck (Germany)사의 제품을 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 시료 주입량은 1 μL로 하였다. LC-MS/MS 분석은 XEVO-TQD (Waters, USA) 기기를 사용하였고, 데이터 처리는 massHunter quantitative analysis 소프트웨어를 사용하였다. 컬럼은 역상 칼럼인 BEH-C18 (2.
성능/효과
- 또한, 농약의 물리화학적 특성 중 기본적인 계수인 옥탄올/물 분배계수 Kow (log P)값을 3이하와 3이상의 두 개 그룹으로 나누어 품목별 matrix effect 영향을 알아보았다. Kow (log P)값이 3이하인 경우 구기자를 제외한 천궁, 당귀, 대추에서 suppression 되는 경향이 크다는 것을 알 수 있었으며, Kow (log P)값이 3이상에서는 구기자, 대추에 비해 천궁, 당귀가 suppression과 enhancement에 의한 matrix 영향이 다소 크다는 것을 알 수 있었다. 한편 Kow(log P)값을 기준으로 3미만인 극성 농약이 비극성농약에 비해 suppression 현상이 많이 관찰되었으며, 이와 같은 연구결과는 Helen 등[16]의 연구결과와 비슷한 경향이었다.
- Matrix의 영향이 없거나 약한 영향(±20~50%)을 받는 성분들은 천궁에서는 acetamiprid 등 186종, 당귀에서는 alachlor 등 192종, 구기자에서는 aldrin 등 192종, 대추에서는 alachlor 등 211종이었다. Matrix에 의해 강한 영향을 받는 성분들은 천궁의 경우 alachlor 등 75종, 당귀의 경우 acetamiprid 등 69종, 구기자의 경우 acetamiprid 등 69종, 대추의 경우 acetamiprid 등 50종이었다. 또한, 농약의 물리화학적 특성 중 기본적인 계수인 옥탄올/물 분배계수 Kow (log P)값을 3이하와 3이상의 두 개 그룹으로 나누어 품목별 matrix effect 영향을 알아보았다.
- Matrix의 영향이 없거나 약한 영향(±20~50%)을 받는 성분들은 천궁에서는 acetamiprid 등 186종, 당귀에서는 alachlor 등 192종, 구기자에서는 aldrin 등 192종, 대추에서는 alachlor 등 211종이었다.
- Carbamate계의 경우 천궁, 당귀에서 suppression에 의해 잔류량이 감소된 것으로 나타났으며, 이들 약제의 Kowlog P값이 3이하였다. Organophosphorus계의 경우 당귀에서는 suppression에 의해 잔류량이 감소된 것으로 나타났고, 대추에서는 enhancement에 의해 잔류량이 증가하는 것으로 나타났다. Organochlorine계의 경우는 대부분이 당귀에서 suppression이 일어나는 것을 확인할 수 있었지만 그 이외의 2,6-dinitroaniline, amide, anilide, azole, thiocarbamate 및 urea계 등에 속하는 농약들은 특별한 경향을 나타내지 않았다.
- 각 농약별 LOD는 GC-MS/MS 분석에서 2-10 ug/kg, LC-MS/MS에서 1-8 ug/kg 수준이었으며, LOQ는 GC-MS/MS 분석에서 4-40 ug/kg, LC-MS/MS에서 2 -45 ug/kg 범위를 나타내었다(Table 3, 4). 이는 시료 중 함유된 ug/kg 수준의 미량의 잔류농약의 검출이 가능할 것으로 판단되었다.
- 각국 및 국제기구 등에서 연구수행에 활용된 분석방법에 대한 적합성은 회수율과 상대표준편차 등의 범위를 이용하여 판단하고 있으며, 국내는 회수율 70~120% 및 상대표준편차 20% 이하(Rural Development Administration, 2009), 유럽연합에서 제시한 회수율은 70~120%와 상대표준편차 20% 이하 (Document N〫 SANCO/12495, 2011)로 규정하고 있다. 본 연구결과에서 생약재 중구기자, 당귀, 대추, 천궁 품목에 대하여 GC-MS/MS와 LC-MS/MS를 이용한 다종농약다성분 분석법의 회수율은 국내 및 국제적 기준에 충족하였다. 하지만 일부 불량한 회수율의 결과를 가진 농약성분(Table 5)의 경우 생약재 시료에 존재하는 matrix의 영향에 의해 suppression과 enhancement의 결과로 정확한 정량은 어렵지만 10 ug/kg 이하까지 정량 한계를 낮춤으로써 충분히 검출 가능하기에 screening 용도로 활용 가능하다고 판단되었다.
- LC-MS/MS 분석 대상 농약 중 chlorfluazuron, etofenprox 등의 분석불가 성분으로 분류하였으나[11], Hernando 등[12]의 연구결과 macrocyclic lactone 화합물은 LC-MS/MS의 desolvation 온도에 따라 감도의 변화가 있다고 보고하였다. 이들의 연구결과를 바탕으로 desolvation 온도를 600℃에서 400℃로 설정하여 회수율을 시험하였을 경우 chlorfluazuron의 회수율은 70.2-118.0%, etofenprox의 회수율은 70.5-109.6%의 회수율을 보임으로써 회수율 기준인 70-120% 이내를 만족하는 결과를 나타내었다. 또한 식품의약품안전처(2010)의 보고에 의하면 QuEChERS 분석법을 이용할 경우 carbendazim, tricyclazole 및 sulfonylurea 계통의 농약은 다종농약다성분 분석이 불가능한 농약들로 분류하였으나, 본 실험에서는 회수율이 각각 70.
- 각각의 표준용액으로부터 acetone과 methanol로 희석하여 6단계의 농도별 분석용 작업표준용액을 제조하였으며, 이를 이용하여 GC-MS/MS와 LC-MS/MS에 주입하여 얻은 chromatogram 의 피크면적을 이용하여 검량선을 작성하였다. 이를 통해 얻은 검량선의 직선성은 양호하였으며, 각각의 상관계수(r2)는 모두 0.99 이상의 결과를 나타내었다.
- 본 연구결과에서 생약재 중구기자, 당귀, 대추, 천궁 품목에 대하여 GC-MS/MS와 LC-MS/MS를 이용한 다종농약다성분 분석법의 회수율은 국내 및 국제적 기준에 충족하였다. 하지만 일부 불량한 회수율의 결과를 가진 농약성분(Table 5)의 경우 생약재 시료에 존재하는 matrix의 영향에 의해 suppression과 enhancement의 결과로 정확한 정량은 어렵지만 10 ug/kg 이하까지 정량 한계를 낮춤으로써 충분히 검출 가능하기에 screening 용도로 활용 가능하다고 판단되었다. LC-MS/MS 분석 대상 농약 중 chlorfluazuron, etofenprox 등의 분석불가 성분으로 분류하였으나[11], Hernando 등[12]의 연구결과 macrocyclic lactone 화합물은 LC-MS/MS의 desolvation 온도에 따라 감도의 변화가 있다고 보고하였다.
후속연구
- 또한 천궁의 경우 매년 부적합이 8% 이상으로 endosulfan이 MRL의 약 25배까지 검출되거나 천궁에 등록되지 않은 농약성분인 hexaconazole, pendimethalin, triadimefon이 검출되는 등 품목별로 미등록된 농약들이 사용되고 있음을 알 수 있었다(서울시 보건환경연구원 2003-2015). 따라서 생약재는 잔류농약에 대한 안전성이 매우 취약한 농산물로 효율적인 안전관리를 위해서 잔류농약에 대한 지속적인 연구와 모니터링이 필요하다.
- 2%로 기준을 만족하는 결과를 나타내었다. 따라서, 본 연구에서 검토된 생약재 중 GC-MS/MS와 LCMS/MS를 이용한 농약의 다성분 동시분석법은 앞으로 생약재의 농약잔류 모니터링 연구에 적용될 수 있을 것으로 판단되었다.
- Organochlorine계의 경우는 대부분이 당귀에서 suppression이 일어나는 것을 확인할 수 있었지만 그 이외의 2,6-dinitroaniline, amide, anilide, azole, thiocarbamate 및 urea계 등에 속하는 농약들은 특별한 경향을 나타내지 않았다. 따라서, 생약재 중 다종농약 동시분석을 수행할 경우 질량분석기를 통한 정량분석에서는 시료 matrix의 영향을 보완하기 위하여 무처리 시료에서 동일한 전처리 과정을 통해 얻은 추출용액을 사용하여 표준물질을 만들어 정량분석 해야 하며, suppression과 enhancement에 의한 matrix 영향을 주는 요인들에 대해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다고 본다.
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