[논문]비침습 샘플 DNA 분석으로 유추한 영월 한반도습지 내 멧돼지(Sus scrofa)의 생태 연구

김민경; 이상임; 박효민; 이상돈

doi:10.14249/eia.2020.29.3.230

비침습 샘플 DNA 분석으로 유추한 영월 한반도습지 내 멧돼지(Sus scrofa)의 생태 연구
Ecological Studies of Wild boars(Sus scrofa) in Yeongwol Hanbando Wetland Inferred through DNA Analysis of Non-invasive Samples 원문보기

환경영향평가 = Journal of environmental impact assessment, v.29 no.3, 2020년, pp.230 - 238

김민경 (서울대학교 생명과학부) , 이상임 (대구경북과학기술원 뉴바이올로지전공) , 박효민 (이화여자대학교 환경공학과) , 이상돈 (이화여자대학교 환경공학과)

초록
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본 연구는 비침습 샘플인 털을 이용하여 영월 한반도습지 내 서식하는 멧돼지(Sus scrofa)의 유전분석을 통하여 그들의 서식 생태를 유추하였다. 털 시료는 2018년 11월부터 2019년 5월까지 한반도습지(2.772㎢) 내에서 비빔목 및 헤어트랩을 이용하여 수집하였다. 털 시료로부터 DNA를 추출하여 개체의 종과 성을 PCR을 통해 파악하였으며 6개의 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 개체 구분과 개체 간 유전적 근연관계를 유추하였다. 수집된 털 시료 중 총 16개의 털이 멧돼지의 시료였으며, 이는 암컷 7마리, 수컷 3마리의 10개체로부터 수집된 것임이 판명되었다. 이 10개체의 유전적 관계를 추정해 본 결과, 이들이 만들어내는 45쌍 중에 9쌍의 개체가 친족관계일 가능성이 높게 나타났다. 개체 쌍의 친족관계와 털 시료가 채집된 위치를 함께 고려하여 본 결과, 한반도습지 일대에서 서식하는 멧돼지는 암컷과 그 자손으로써 모계 가족단위로 생활하는 것으로 추정되며, 이는 기존에 알려진 멧돼지의 습성과도 일치하는 결과이다. 그러나 본 연구에 사용된 샘플과 마이크로새틀라이트 마커의 수가 제한적이므로 향후 추가적인 분석이 필요하다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study inferred the ecology of habitat use of the wild boars (Sus scrofa) in Yeongwol Hanbando wetland through DNA analysis using non-invasive samples of hairs. From November 2018 to May 2019, hair samples were collected from rubbing trees and hairtraps within the Hanbando wetland (2.772 ㎢). We extracted DNA from the hair samples and conducted PCR to verify the species and identify sex of the individuals. In addition we analysed 6 microsatellite markers to identify individuals and genetic relationship among the pairs of individuals. A total of 16 boar hairs were sampled, which turned out to be from 10 individual (7 females and 3 males) boars. We found that 9 pairs, out of 45 possible pairs, were most likely to be relatives. The result from kinship data and the location of the sampled hairs suggest that wild boars in this area live as family groups that consist of a mother and her offspring, which is consistent with known habits of wild boars. It is needed to include more samples and microsatellite markers for better precise estimation of kinship among the boar individuals.

주제어

표/그림 (8)

그림 Figure 1. Map of designation of major protected areas in Hanbando wetlands (Adapted from "The 2nd (2018-2022) Wetland conservation plan for the Hanbando wetlands in Yeongwol by Ministry of Environment, 2018").
표 Table 1. List of primers used in this study
표 Table 2. Sequence, size range, chromosomes location of microsatellite markers used in this study (Costa et al. 2012)
표 Table 3. List of samples which were confirmed wild boar species and sex
그림 Figure 2. Location of hair trap and collection of hairs identified as wild boar species.
그림 Figure 3. Locations where samples from different individuals were collected.
그림 Figure 4. A family tree of wild boar in the Korean Peninsula wetlands estimated as hair samples in this study.
표 Table 4. List of relative relationships estimated to be the maximum likelihood among the pair of wild boar individuals (PO: parent-offspring, FS: full-siblings, HS: half-siblings)

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 생태적으로 우수한 영월 한반도습지 내에서 발견된 비침습적 샘플인 털을 이용하여 멧돼지의 DNA 분석을 실시하고, 유전 정보를 바탕으로 멧돼지 무리의 조성을 유추하고자 하였다.
본 연구는 비침습 샘플인 털을 이용하여 영월 한반도습지 내 서식하는 멧돼지의 유전 분석을 실시하였다. 유전자형 분석을 이용한 멧돼지 개체 확인을 통한 연구의 결과, 조사기간 동안 한반도습지 내에서 획득한 야생동물의 털로부터 확인된 멧돼지는 총 10개체였으며, 이들은 암컷 7마리와 수컷 3마리로 구성되었다.
또한, 본 연구에서 확인된 총 10개체의 유전적 관계쌍을 추정해 본 결과, 이들이 만들어내는 45쌍 중에 9쌍의 개체들이 친족관계일 가능성이 가장 높게 나타났다. 본 연구에서는 개체의 활동을 추정하기 위하여 여러 장소에서 같은 개체의 흔적을 찾기를 기대하였으나 그런 결과를 얻지 못하여 그들이 이용하는 지역을 추정해보기는 어려웠다. 그러나 털의 수집위치와 친족관계 분석을 통하여 한반도습지 지역 및 그 주변 일대를 가족 및 친족들이 공동 이용하고 있음을 알 수 있었다.

제안 방법

PCR 조건은 95℃에 서 denaturation 30초 , 52℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 60초를 1cycle로 하여 총 40회 반복하였다. PCR 산물을 3730xl DNA analyzer 장비를 이용하여 시료의 유전자형을 파악하였으며, GeneMapper 5.0 (Applied Biosystems) 프로그램을 이용하여 대립유전자를 파악(allele scoring)하였다. 이 자료를 바탕으로 ML-relate 프로그램(Kalinowski et al.
5μl로 맞추었다. PCR 조건은 95℃에 서 denaturation 30초 , 52℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 60초를 1cycle로 하여 총 40회 반복하였다. PCR 산물을 3730xl DNA analyzer 장비를 이용하여 시료의 유전자형을 파악하였으며, GeneMapper 5.
개체분석은 마이크로새틀라이트 유전자를 증폭하여 실시하였으며, 멧돼지에서 개발된 마커를 사용하였다. 본 연구에서는 유럽의 멧돼지(Costa et al.
)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다. 또한 본 실험에서는 털 가닥이 충분히 용해될 수 있도록 히팅 블럭(heating block)을 사용하여 약 48시간 이상 충분히 배양하였고, 용액이 증발되지 않도록 밀봉하여 진행하였다.
또한 유전자형 분석을 통하여 얻어진 대립인자들을 이용하여 한반도습지 내 멧돼지 10개체의 친족관계를 추정해보았다. ML-relate 프로그램을 이용하여 10개체의 각각의 쌍에 대한 최대 우도(maximum likelihood)로 추정되었다.
샘플링은 2018년 가을부터 2019년 여름까지 진행하였다. 먼저 한반도습지 내 멧돼지의 휴식터, 연못가, 진흙 목욕지역, 멧돼지 분변 배설지역을 관찰로 파악 하고 그 인근의 비빔목을 조사하였으며, 멧돼지가 이동하는 것으로 관찰된 경로 주변에는 추가적으로 헤어트랩을 설치하였다. 총 4회의 정기 조사와 수시 조사를 병행하였으며 비빔목과 헤어트랩에 남아있는 털을 수집하였다.
위의 과정을 거쳐 멧돼지의 털로 확인된 시료를 대상으로 성별을 확인하기 위하여 성판별에 사용되는 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다(Table 1). PCR은 2μl의 10X buffer, 2μl의 dNTPs, 1μl의 양방향 프라이머와 4μl의 DNA, 0.
0 (Applied Biosystems) 프로그램을 이용하여 대립유전자를 파악(allele scoring)하였다. 이 자료를 바탕으로 ML-relate 프로그램(Kalinowski et al. 2006)을 이용하여 최대 우도(maximum likelihood)를 기반으로 한 친족 관계 추정을 실시하였다.
수집된 털 중에는 매우 작거나 얇은 털이 존재하여 멧돼지의 털인지 아닌지를 확인하는 과정이 필요하였다. 이에 멧돼지 종에 특이적으로 존재하는 DNA 염기서열로 구성된 프라이머(Primer)를 이용하여 PCR을 실시한 후 멧돼지의 종을 확인하였다. 본 연구에서 이용된 프라이머는 pigCTR22L와 pigCTR515H (Table 1)인데, 이는 멧돼지 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 중 control region 부위의 염기서열로 구성되어 있다.
먼저 한반도습지 내 멧돼지의 휴식터, 연못가, 진흙 목욕지역, 멧돼지 분변 배설지역을 관찰로 파악 하고 그 인근의 비빔목을 조사하였으며, 멧돼지가 이동하는 것으로 관찰된 경로 주변에는 추가적으로 헤어트랩을 설치하였다. 총 4회의 정기 조사와 수시 조사를 병행하였으며 비빔목과 헤어트랩에 남아있는 털을 수집하였다. 하나의 묶음으로 되어 있는 털은 하나의 시료로, 낱개로 분리되어 있는 털은 각각 별개의 시료로 간주하였고, 시료는 멸균된 15ml 튜브 (conical tube)에 담아 -20℃에서 냉동 보관하였다.
한 시료에 여러 개체의 털이 들어갈 가능성을 완전 배제하기 위하여 한 묶음으로 되어 있는 털에서도 한가닥만을 사용하였으며, 털 가닥은 잘게 잘라서 1.5ml 튜브에 넣은 후 GenEluteTM genomic DNA miniprep Kit (SIgma CO.)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다. 또한 본 실험에서는 털 가닥이 충분히 용해될 수 있도록 히팅 블럭(heating block)을 사용하여 약 48시간 이상 충분히 배양하였고, 용액이 증발되지 않도록 밀봉하여 진행하였다.

대상 데이터

Figure 4. A family tree of wild boar in the Korean Peninsula wetlands estimated as hair samples in this study.
이를 감안할 때, 다른 시료와 동일 개체로 확인된 43번 시료의 성별은 암컷으로 판단된다. 따라서 본 연구에서 수집한 시료는 수컷 3마리와 암컷 7마리로 총 10마리의 멧돼지 개체에서 얻어진 것으로 추정된다.
이에 멧돼지 종에 특이적으로 존재하는 DNA 염기서열로 구성된 프라이머(Primer)를 이용하여 PCR을 실시한 후 멧돼지의 종을 확인하였다. 본 연구에서 이용된 프라이머는 pigCTR22L와 pigCTR515H (Table 1)인데, 이는 멧돼지 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 중 control region 부위의 염기서열로 구성되어 있다. PCR은 2μl의 10X buffer, 2μl의 dNTPs, 2μl의 양방향 프라이머와 2μl의 DNA, 0.
개체분석은 마이크로새틀라이트 유전자를 증폭하여 실시하였으며, 멧돼지에서 개발된 마커를 사용하였다. 본 연구에서는 유럽의 멧돼지(Costa et al. 2012)와 한국에 서식하는 멧돼지를 대상으로 한 선행연구(Ministry of Environment 2014)에서 많은 수의 대립 유전자가 관찰된 마커 중 6개(Sw24, S0005, S0068, S0155, S0101, Sw936)를 선정하였다(Table 2).
샘플링은 2018년 가을부터 2019년 여름까지 진행하였다. 먼저 한반도습지 내 멧돼지의 휴식터, 연못가, 진흙 목욕지역, 멧돼지 분변 배설지역을 관찰로 파악 하고 그 인근의 비빔목을 조사하였으며, 멧돼지가 이동하는 것으로 관찰된 경로 주변에는 추가적으로 헤어트랩을 설치하였다.
조사 지역은 강원도 영월 한반도습지(37°13′13″, 128°20′49″)로 습지보호지역과 습지주변관리지역내(2.772km2)에서 수행되었다(Figure 1).
총 6개의 마커(Sw24, S0005, S0068, S0155, S0101, Sw936)를 이용하여 마이크로새틀라이트 분석을 실시하여 51번 시료를 제외한 나머지 15개 시료에서 결과를 확보하였다. 그 중 43번, 44번, 55번, 58번, 59번, 60번 시료는 마이크로새틀라이트 유전 자형이 동일하여 중복 개체로 판단되었다.
한반도습지 내에서 수집한 털 시료 중 멧돼지의 것으로 확인된 시료는 총 16개였으며, 그 수집위치는 Figure 2에 표시되어 있다. 이 시료 중 14개의 시료에서 성별이 확인되었는데, 3개 시료는 수컷, 11개 시료는 암컷의 것으로 확인되었다(Table 3).

데이터처리

또한 유전자형 분석을 통하여 얻어진 대립인자들을 이용하여 한반도습지 내 멧돼지 10개체의 친족관계를 추정해보았다. ML-relate 프로그램을 이용하여 10개체의 각각의 쌍에 대한 최대 우도(maximum likelihood)로 추정되었다. 총 10개체들이 만들어내는 45쌍 중 9쌍의 개체들이 친족관계의 가능성이 가장 높게 나타났다(Table 4).

성능/효과

PCR 조건은 95℃에서 denaturation 30초, 47℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 45초를 1cycle로 하여 총 45회 반복하였다. 2% agarose gel에 PCR 산물을 loading하여 350bp, 520bp 두 밴드가 확인되는 샘플은 수컷, 520bp 밴드만 확인되는 샘플은 암컷의 것임을 확인할 수 있었다.
또한, 본 연구에서 확인된 총 10개체의 유전적 관계쌍을 추정해 본 결과, 이들이 만들어내는 45쌍 중에 9쌍의 개체들이 친족관계일 가능성이 가장 높게 나타났다. 본 연구에서는 개체의 활동을 추정하기 위하여 여러 장소에서 같은 개체의 흔적을 찾기를 기대하였으나 그런 결과를 얻지 못하여 그들이 이용하는 지역을 추정해보기는 어려웠다.
이를 통해 한반도습지 지역 내에서는 현재 3세대로 구성된 가족 집단이 서식하는 것으로 판단되며, 암컷 친척 간에는 딱히 아주 가까운 친척이 아니더라도 같이 몰려다니거나, 또는 몰려다니지는 않아도 같은 지역을 오가는 것이라 추정 가능하다. 또한, 여기에 이 가족집단에 속하지 않은 12번 수컷 개체가 한반 도습지 지역을 함께 이용하는 것으로 확인된다.
PCR 조건 은 94℃에서 denaturation 24초 , 50℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 90초를 1cycle 로 하여 총 45회 반복하였다. 멧돼지 종의 증폭 결과는 1% Agarose gel에서 확인하였다.
본 연구는 비침습 샘플인 털을 이용하여 영월 한반도습지 내 서식하는 멧돼지의 유전 분석을 실시하였다. 유전자형 분석을 이용한 멧돼지 개체 확인을 통한 연구의 결과, 조사기간 동안 한반도습지 내에서 획득한 야생동물의 털로부터 확인된 멧돼지는 총 10개체였으며, 이들은 암컷 7마리와 수컷 3마리로 구성되었다. 이는 연구기간 동안 획득하여 확인된 샘플의 수가 제한적이므로 이 개체들이 한반도습지를 이용하는 모든 멧돼지 개체라고 단정할 수 없으나, 한반도습지를 이용하는 멧돼지의 개체가 최소 10마리임을 의미 한다고 볼 수 있다.
이 결과를 털의 채집 장소와 비교해보면, 어미인 54와 자손 43이 한 장소에서 발견되었으며, 어미인 41과 자손인 39 또한 한 장소에서 발견되었다. 이는 모돈과 자손으로 구성된 모계 무리로 생활하기 때문인 것으로 사료된다.
한반도습지 내에서 수집한 털 시료 중 멧돼지의 것으로 확인된 시료는 총 16개였으며, 그 수집위치는 Figure 2에 표시되어 있다. 이 시료 중 14개의 시료에서 성별이 확인되었는데, 3개 시료는 수컷, 11개 시료는 암컷의 것으로 확인되었다(Table 3).
그 중 43번, 44번, 55번, 58번, 59번, 60번 시료는 마이크로새틀라이트 유전 자형이 동일하여 중복 개체로 판단되었다. 이를 감안할 때, 다른 시료와 동일 개체로 확인된 43번 시료의 성별은 암컷으로 판단된다. 따라서 본 연구에서 수집한 시료는 수컷 3마리와 암컷 7마리로 총 10마리의 멧돼지 개체에서 얻어진 것으로 추정된다.
ML-relate 프로그램을 이용하여 10개체의 각각의 쌍에 대한 최대 우도(maximum likelihood)로 추정되었다. 총 10개체들이 만들어내는 45쌍 중 9쌍의 개체들이 친족관계의 가능성이 가장 높게 나타났다(Table 4). 9쌍 중 3쌍의 관계는 부모자식 관계(PO)였으며, 2쌍의 관계에서 친형제자매 관계(FS)로 나타났다.

후속연구

최근 국내에는 아프리카돼지열병이나 멧돼지로 인한 농가의 피해, 도심 출몰 등과 같은 멧돼지 관련 이슈가 계속되고 있는 상황에서, 멧돼지의 유전분석을 통한 생태적 연구는 매우 중요한 결과이다. 다만, 본 연구는 소수의 샘플과 적은 수의 마커를 사용한 한계가 있으므로, 개체를 더 정확히 동정하기 위해서는 충분한 샘플의 수, 다수의 유전자 좌(locus), 유전자 좌내 대립유전자(allele)가 필요하므로 향후 추가적인 분석이 필요할 것으로 판단된다.

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http://me.go.kr/wonju/web/index.do?menuId10133 2020.2.6.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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