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문제 정의
- 일부 liquid chromatography (LC)-MS를 이용하여 prochloraz 및 대사산물를 동시에 개별분석한 경우가 있으나[9], 농산물 및축산물 중 prochloraz의 잔류분은 ‘prochloraz와 2,4,6-trichlorophenol 기를 포함하고 있는 대사산물의 합을 prochloraz로 함’으로 정의되어 있기 때문에 보다 정확한 잔류분 정량분석을 위해서는 일부 특정 대사산물을 분석성분으로 한정하기 보다는 많은 종류의 대사체를 일괄분석하는 분석법이 필요하며 정량물질인 2,4,6-TCP은 분자구조내에 할로겐 원소인 chloride를 3개 함유 하고 있어 검출기로써 선택성과 분석감도가 우수한 ECD를 활용하는 것이 범용적으로 활용할 수 있는 방법이다. 따라서, 본연구에서는 prochloraz 및 2가지 대사물이 공통적으로 2,4,6-trichlorophenol moiety를 가지고 있으므로 모든 분석대상 화합물을 2,4,6-TCP로 분해 및 정량한 후 prochloraz로써 환산정량 하도록 하였으며(Fig. 1), 추출, 분배, 분해, 정제 등 전처리 과정별 최적화를 시도하여 정량성과 정밀성이 확보된 잔류분석법을 확립하고자 하였다.
- 가축사육기간 동안 질병 예방 및 치료를 목적으로 사용하는 동물용의약품은 사용허가에 따른 주기적 잔류실태조사를 통해 동물용의약품 사용 및 잔류에 따른 안전성을 관리하고 있으나, 가축사료는 국외의존도가 높아 주로 국외에서 재배생산된 사료작물로 사료조 제가 이루어지며 사료작물 생산 시 사용등록된 농약성분은 제외국마다 상이하기 때문에 국내로 수입되는 축산물 중 사료를 통해 축산물에 유입된 잔류농약의 안전관리는 상대적으로 미흡한 실정이다. 따라서, 사료작물에 사용되는 농약성분 중 prochloraz의 잔류분석법을 개발하여 축산물 중 잔류농약 안전 관리에 활용코자 하였다.
제안 방법
- Prochloraz 및 대사물들은 모두 2,4,6-trichlorophenol moiety를함유하고 있어 분자구조 내 chlorine 원자 3개를 함유하고 있으 므로 검출기로는 ECD를 이용하였다[3]. 2,4,6-TCP 분석이 가능한 기기분석 조건을 탐색하기 위해 분리능이 우수한 capillary column으로 보편적으로 많이 DB-5 column을 선정하고 온도조절 등 기기분석 조건을 최적화하였다. Prochloraz 및 대사물의 개별분석이 가능한지 각각 분석해 보았으나, prochloraz가 GC 분석 중 열분해가 발생되어 prochloraz peak와 함께 2,4,6-TCP peak가 동시에 확인이 되어 GC를 이용한 개별분석은 불가하였다.
- 2,4,6-TCP 분해 및 분배액에 잔존하는 분석 방해물질 제거를 위해 NH 2 SPE (solid phase extraction) cartridge을 활용한 추가 정제 조건을 검토하였으며, 고기류에 한해 조건을 확립하였다.NH 2 SPE cartridge (1 g, 6 cc)를 dichloromethane 10 mL로 활성화시킨 후 2,4,6-TCP 표준용액 1 μg/mL, 1 mL를 질소 건고한 다음 dichloromethane 5 mL로 재용해한 용액을 카트리지에 첨가하였다.
- 2,4,6-TCP의 표준용액 0.005 mg/L를 7번반복 분석하여 재현성을 확인하였으며, 0.005-0.2 μg/mL의 working solution을 분석하여 표준 검량선 작성 및 직선성을 확인하였다.
- 2,4,6-trichlorophenol의 표준용액 0.001-0.5 μg/mL를 1 μL씩 주입하여 chromatogram상의 s/n ratio(signal과 noise의 비)가 3 또는 10 이상인 농도를 기기검출한계(Instrumental Limit of Detection, ILOD)와 기기정량한계(Instrumental Limit of Quantitation, ILOQ)를 설정하였다.
- Acetonitrile이 포화된 n-hexane 30 mL에 prochloraz 및 각 대사물의 표준용액 10 μg/mL, 1 mL을 첨가한 후 n-hexane이 포화된 acetonitrile 30 mL를 이용하여 2회 분배 추출 하였으며, 1% formic acid를 함유하고 n-hexane이 포화된 acetonitrile를 이용하는 방법도 검토하였다.
- 닭고기의 경우 추가정제가 필요하여 위의 잔사를 dichloromethane 5 mL에 재용해하여 dichloromethane 10 mL로 활성화시킨 NH 2 cartridge (1 g, 6 cc)에 loading하였다.Methanol 10 mL를 흘려 세척하여 버린 후 1% formic acid를함유한 methanol을 10 mL 용출하여 받아 질소 농축하여 ethyl acetate 2 mL로 재용해하여 기기 분석하였다. 이 과정을 3번 반복 실험하여 축산물별 처리수준별 회수율을 산출하였다.
- Oven 온도는 110 °C, injector port 및 detector block 온도는 300 °C이었으며, 기기주입량은 1 μL으로 splitless mode로 분석하였다.
- Prochloraz 분석을 위한 각 세부 전처리법을 확정한 후 ILOQ,시료채취량, 시험용액 부피, 분석조작에 따른 희석 또는 농축배 수를 고려하여 전체 분석법의 분석정량한계(Method limit of quantitation, MLOQ)를 산출하였다[10]. 확정된 전처리 방법 및기기분석법에 따른 prochloraz 잔류분석의 정확성과 정밀성을 확인하기 위해 회수율 실험을 실시하였다.
- Prochloraz 뿐 아니라 대사물의 2,4,6-TCP 분해율을 확인하기 위해 prochloraz를 이용해 확립된 분해조건 하에서 BTS44595 및 BTS44596 표준용액 1 μg/mL, 1 mL를 이용해 분해 및 회수율을 확인하였다.
- Prochloraz는 200°C에서 열분해성이 있어 GLC 분석시 안정하지 못하여 pyridine hydrochloride를 첨가하여 고온에서 열분해시켜 2,4,6-TCP로 전환하여 분석하는 방법을 검토하였다[3].
- 계란과 우유는 지질함량이 낮기 때문에 n-hexane/acetonitrile 분배법이 아닌 dichloromethane를 이용한 액-액 분뱁법을 검토하 였다. 각 표준원액 10 μg/mL, 1 mL씩 첨가한 후 분배조건을 확인하였다.
- 고기류에는 다량의 유지와 비극성 간섭물질을 함유하고 있어 정밀한 농약잔류분석을 방해한다. 고기류 중 지질을 제거하기 위해 n-hexane/acetonitrile 분배를 검토하였으며, 이는 추출 후의 과정이므로 prochloraz와 대사물별로 확인하였다. 분배 시 formic acid 첨가 유무에 관계없이 분배 회수율은 약 90% 이상의 만족스러운 수준이었지만, 대사물 BTS44596이 산성 조건에서 안정하므로 1% formic acid가 함유된 n-hexane/acetonitrile 분배법으로 확립하였다(Table 1).
- 닭고기를 제외한 고기류, 계란 및 우유는 2,4,6-TCP 분해 및 액 -액 분배 후 기기분석을 통해 2,4,6-TCP를 정량하는데 문제가없었으나, 닭고기 control 시료의 크로마토그램상의 baseline이매우 불안정하고 간섭물질이 다량 확인되어 추가 정제방법을 검토하였고 2,4,6-TCP가 약해리성이기에 NH 2 SPE를 이용하였다.최적의 용출조건을 확립하기 위해 methanol/dichloromethane의 비율을 조절하며 용출시켜 보았지만 2,4,6-TCP이 전혀 용출되지 않았고 acetone, methanol 및 n-hexane으로도 용출되지 않았 으나, 1% formic acid를 함유한 methanol로 용출하였을 때 전량이 용출되었다(Table 4).
- 또한, 지질 제거 효과를 검증하기 위해 고기류 중 지방함량이 가장 높은 돼지고기 10 g에 추출용매 acetone 또는 acetonitrile 100 mL 첨가하여 30분 동안 200 rpm에서 진탕 추출하고 농축한 후 추출 고형물의무게를 측정 후 확립된 n-hexane/acetonitrile 분배법을 통해 제거된 지질의 양을 측정하였다.
- 2 M HCl 수용액 20 mL에 재용해한 다음 dichloromethane 50 mL으로 2번분배하였다. 분배액 농축 중 2,4,6-TCP의 휘발소실을 방지하기 위해 분배액에 2% diethylene glycol 0.2 mL를 첨가 후 감압농축하고 ethyl acetate 2 mL로 재용해하여 기기 분석하였다. 분해 시간을 확립하기 위해 200 °C에서 20분, 40분, 60분의 가열시 간을 검토하였다.
- 분해 시간을 확립하기 위해 200 °C에서 20분, 40분, 60분의 가열시 간을 검토하였다.
- Pyridine hydrochloride는 상온에서 고체이며 녹는점이 144°C 이기에 분해온도 조건에서는 액체 형태로 변하였다. 분해물에서 2,4,6-TCP를 분배 회수하기 위해 앞서 계란 및 우유에서 확립한 dichloromethane를 이용한 액-액 분배법을 적용검토하였다. 2,4,6-TCP을 비해리성으로 변환시키기 위해 2,4,6-TCP 0.
- 증류수 100 mL와 포화식염수 50 mL를 첨가하고 dichloromethane 50 mL으로 2번 분배한 후 sodium sulfate, anhydrous을 통과시켜 탈수하고 2% diethylene glycol 0.2 mL를 첨가한 다음 40 °C 수욕상에서 감압 농축하고 ethyl acetate 2 mL로 잔사 고형분을 재용해하여 기기 분석하였다.
- 각 표준원액 10 μg/mL, 1 mL씩 첨가한 후 분배조건을 확인하였다. 첫번째 분배 방법은 추출 후 포화식염수 50 mL와 과량의 물을 넣은 후 dichloromethane 50 mL로 두 번 분배하는 방법이었고 두번째 검토한 분배법은 추출액을 농축한 다음 포화식염수 50 mL와 증류수 200 mL 첨가 후 dichloromethane으로 50 mL로 두 번 분배하는 방법이었다.
- NH 2 SPE cartridge (1 g, 6 cc)를 dichloromethane 10 mL로 활성화시킨 후 2,4,6-TCP 표준용액 1 μg/mL, 1 mL를 질소 건고한 다음 dichloromethane 5 mL로 재용해한 용액을 카트리지에 첨가하였다. 최적의 용출조건을 확립하기 위해 methanol/ dichloromethane 혼합액, acetone, methanol, n-hexane 및 1% formic acid를 함유한 methanol으로 용출시켜 회수율을 확인하였다.
- 확정된 전처리 방법 및기기분석법에 따른 prochloraz 잔류분석의 정확성과 정밀성을 확인하기 위해 회수율 실험을 실시하였다. 표준용액 첨가법에 따라 처리수준이 MLOQ 및 MLOQ의 10배가 되도록 prochloraz 표준용액을 소고기, 돼지고기, 닭고기, 우유 및 계란 10 g에 첨가하였다. 고기류의 경우 acetone 100 mL를 첨가 후 200 rpm에서 30분간 진탕 추출한 후 filter paper가 깔려있는 뷰흐너 깔때기로 감압여과한 다음 잔사를 acetone 50 mL로 세척하였다.
- 확립된 전처리 방법 및 기기분석법에 따른 분석의 정확성과 정밀성을 확인하기 위해 MLOQ (0.02 μg/kg) 및 10MLOQ (0.2 μg/kg) 수준의 회수율 시험을 수행하였다.
- Prochloraz 분석을 위한 각 세부 전처리법을 확정한 후 ILOQ,시료채취량, 시험용액 부피, 분석조작에 따른 희석 또는 농축배 수를 고려하여 전체 분석법의 분석정량한계(Method limit of quantitation, MLOQ)를 산출하였다[10]. 확정된 전처리 방법 및기기분석법에 따른 prochloraz 잔류분석의 정확성과 정밀성을 확인하기 위해 회수율 실험을 실시하였다. 표준용액 첨가법에 따라 처리수준이 MLOQ 및 MLOQ의 10배가 되도록 prochloraz 표준용액을 소고기, 돼지고기, 닭고기, 우유 및 계란 10 g에 첨가하였다.
대상 데이터
- Baker ® , Avantor, Radnor, PA, USA), acetone, dichloromethane, n-hexane 및 methanol (Daejung Chemicals & Metals, Siheung, Korea, 이상)은 HPLC급을 사용하였다. Sodium chloride와 sodium sulfate, anhydrous는 GR 급으로 Junsei Chemical Co. (Tokyo, Japan)에서 구입하였고, pyridine hydrochloride (98%)는 Sigma-Aldrich사로 구입하여 사용하였다. 고기류 균질화는 MG516 Meat grinder Pro 1600 (Kenwood, Havant, UK), 시료 추출을 위한 homogenizer는 AM-7 (Nihonseiki kaisha Ltd.
- 축산물 고기류 중 돼지고기를 이용하여 최적의 추출조건을 검토하였으며, 추출용매로써 acetone과 acetonitrile을 이용하여 진탕추출한 결과 acetone에 비해 acetonitrile은 고기 시료가 응집되는 현상이 관찰되었다. 계란 및 우유의 경우 acetone 사용 시시료내의 단백질 응집 등에 큰 효과를 보여 원심분리를 통해 매질분리 효과가 뛰어났기 때문에 추출용매로 acetone을 선정하였다.
- (Tokyo, Japan)에서 구입하였고, pyridine hydrochloride (98%)는 Sigma-Aldrich사로 구입하여 사용하였다. 고기류 균질화는 MG516 Meat grinder Pro 1600 (Kenwood, Havant, UK), 시료 추출을 위한 homogenizer는 AM-7 (Nihonseiki kaisha Ltd., Tokyo, Japan), 추출액 여과에는 GF/A 여과지(Whatman International Ltd., Maidstone, UK), 추출액 농축은 R-114 (Buchi, Flawil, Switzerland), 원심분리기로는 Combi-408 (Hanil Science Industrial Co., Ltd., Gwangju, Korea)를 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 표준품 prochloraz (98.6%), BTS44595 (1-propyl-1-[2-(2,4,6-trichloro-phenoxy)ethyl]urea) (99.2%), BTS44596(3-formyl-1-propyl-1-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]urea) (99.3%)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사로부터 구입하였으며, 2,4,6-TCP (2,4,6-trichlorophenol) (99.0%)는 Chem Service (West Chester, PA, USA)사에서 구입하여 사용하였다. 분해용 vial로는 Verex vial 40 mL를 Phenomenex (Torrance, CA, USA) 사로부터 구입하여 사용하였고, NH 2 SPE cartridge (1 g, 6 cc) 는 Waters Co.
- 0%)는 Chem Service (West Chester, PA, USA)사에서 구입하여 사용하였다. 분해용 vial로는 Verex vial 40 mL를 Phenomenex (Torrance, CA, USA) 사로부터 구입하여 사용하였고, NH 2 SPE cartridge (1 g, 6 cc) 는 Waters Co. (Milford, MA, USA)사로부터 구입하였다. 사용된 용매로 acetonitrile (J.
- 사용된 용매로 acetonitrile (J.T. Baker ® , Avantor, Radnor, PA, USA), acetone, dichloromethane, n-hexane 및 methanol (Daejung Chemicals & Metals, Siheung, Korea, 이상)은 HPLC급을 사용하였다.
이론/모형
- 고기류의 지질을 제거하기 위해 n-hexane/acetonitrile 분배법을 검토하였다. Acetonitrile이 포화된 n-hexane 30 mL에 prochloraz 및 각 대사물의 표준용액 10 μg/mL, 1 mL을 첨가한 후 n-hexane이 포화된 acetonitrile 30 mL를 이용하여 2회 분배 추출 하였으며, 1% formic acid를 함유하고 n-hexane이 포화된 acetonitrile를 이용하는 방법도 검토하였다.
- 고기류 중 지질을 제거하기 위해 n-hexane/acetonitrile 분배를 검토하였으며, 이는 추출 후의 과정이므로 prochloraz와 대사물별로 확인하였다. 분배 시 formic acid 첨가 유무에 관계없이 분배 회수율은 약 90% 이상의 만족스러운 수준이었지만, 대사물 BTS44596이 산성 조건에서 안정하므로 1% formic acid가 함유된 n-hexane/acetonitrile 분배법으로 확립하였다(Table 1). 돼지고기 10 g의 acetone 추출 량은 7.
성능/효과
- 2,4,6-TCP을 비해리성으로 변환시키기 위해 2,4,6-TCP 0.1 μg이포함된 분해액을 0.2M HCl 수용액으로 녹였으며 dichloromethane 으로 분배회수한 결과 113%의 우수한 회수율을 보였다.
- 4%로 높은 지질 제거효과를 보였다. 계란 및 우유 중 prochloraz 및 대사물의 액-액 분배법을 검토한 결과, 검토한 모든 분배법에서 모든 성분들이 85% 이상의 우수한 분배 회수율을 보였다(Table 2). 따라서, 전처리 시간을 최소화할 수 있도록 추출액에 과량의 물을 첨가한 후 dichloromethane으로 분배하는 과정으로 최종 확립하였다.
- 대표 축산물 시료 선정을 위해 식품공전 및 CODEX의 축산물 농약 잔류허용기준 적용범위 및 빈도, 1인당 식품 소비량 등을 고려하여 검토한 결과 포유류에서는 소고기 등심과 돼지고기 삼겹살, 가금류에서는 닭고기 다리살, 유 및 유가공품에서는 우유, 알류에서는 계란으로 결정하였다. 대표 축산물은 지역 마트에서 구매하였으며, 고기류는 고기 분쇄기를 이용하여 2번 이상 균질화하였고 계란의 경우 껍질을 제거 후 균일하게 섞어준 뒤거름망을 이용하여 걸러주었다.
- 분배 시 formic acid 첨가 유무에 관계없이 분배 회수율은 약 90% 이상의 만족스러운 수준이었지만, 대사물 BTS44596이 산성 조건에서 안정하므로 1% formic acid가 함유된 n-hexane/acetonitrile 분배법으로 확립하였다(Table 1). 돼지고기 10 g의 acetone 추출 량은 7.18 g이었고 확립된 n-hexane/acetonitrile 분배법을 통한 추출액의 지질 제거율은 98.4%로 높은 지질 제거효과를 보였다. 계란 및 우유 중 prochloraz 및 대사물의 액-액 분배법을 검토한 결과, 검토한 모든 분배법에서 모든 성분들이 85% 이상의 우수한 분배 회수율을 보였다(Table 2).
- 계란 및 우유 중 prochloraz 및 대사물의 액-액 분배법을 검토한 결과, 검토한 모든 분배법에서 모든 성분들이 85% 이상의 우수한 분배 회수율을 보였다(Table 2). 따라서, 전처리 시간을 최소화할 수 있도록 추출액에 과량의 물을 첨가한 후 dichloromethane으로 분배하는 과정으로 최종 확립하였다.
- 05 mg/kg이므로 확립된 분석법의 정량한계는 기준적부 판정을 위한 잔류분석법으로써 그 기준을 만족하였다[11-12]. 본 연구에서 확립된 전처리 방법에 따라 조제된 축산물별 시험용액을 GC/ECD로 분석하였을 때, 2,4,6-TCP 의 머무름 시간대에 불순물의 간섭이 관찰되지 않음으로써 분석의 선택성은 양호하였다(Supplemental 1). 확립된 전처리 방법 및 기기분석법에 따른 분석의 정확성과 정밀성을 확인하기 위해 MLOQ (0.
- 우리나라 국민들의 생활수준이 향상되고 축산업의 발전에 힘입어 축산 식품의 소비는 과거에 비해 크게 증가하였으며, 농림 축산식품 주요통계에 의하면 16년 기준 1인당 소비량은 돼지고기 24.1 kg, 닭고기 13.8 kg, 소고기 11.6 kg, 우유 76.4 kg, 계란 274개로 조사되었고 과거 5년동안 1인 소비량은 고기류(돼지고기, 소고기, 닭고기) 22.2%, 우유 13.7%, 계란 13.2% 증가 하였다[1]. 축산물의 수요가 증가하면서 국외에서 수입되는 물량 또한 증가하였는데, 16년 기준으로 과거 5년간 국내의 축산물 생산량은 연간 소비되는 고기류(돼지고기, 쇠고기, 닭고기)의 68.
- 닭고기를 제외한 고기류, 계란 및 우유는 2,4,6-TCP 분해 및 액 -액 분배 후 기기분석을 통해 2,4,6-TCP를 정량하는데 문제가없었으나, 닭고기 control 시료의 크로마토그램상의 baseline이매우 불안정하고 간섭물질이 다량 확인되어 추가 정제방법을 검토하였고 2,4,6-TCP가 약해리성이기에 NH 2 SPE를 이용하였다.최적의 용출조건을 확립하기 위해 methanol/dichloromethane의 비율을 조절하며 용출시켜 보았지만 2,4,6-TCP이 전혀 용출되지 않았고 acetone, methanol 및 n-hexane으로도 용출되지 않았 으나, 1% formic acid를 함유한 methanol로 용출하였을 때 전량이 용출되었다(Table 4). 따라서, methanol 10 mL로 세척 후 1% formic acid가 함유된 methanol 10 mL로 용출하는 것으로 SPE 정제조건을 확립하였다.
- 축산물 고기류 중 돼지고기를 이용하여 최적의 추출조건을 검토하였으며, 추출용매로써 acetone과 acetonitrile을 이용하여 진탕추출한 결과 acetone에 비해 acetonitrile은 고기 시료가 응집되는 현상이 관찰되었다. 계란 및 우유의 경우 acetone 사용 시시료내의 단백질 응집 등에 큰 효과를 보여 원심분리를 통해 매질분리 효과가 뛰어났기 때문에 추출용매로 acetone을 선정하였다.
- 해당 분석조건에서 2,4,6-TCP의 머무름 시간 7.9분이었으며 기기상의 정량한계 농도인 0.005 μg/mL를 7번 반복 분석한 결과는 변이계수(C.V.)는 10% 이내를 만족하였고, 표준 검량선의 결정계수(R 2 )는 모두 0.995이상으로 우수한 직선성을 보였다(Fig.2).
- 확립된 분해조건에서 prochloraz, 대사물 BTS44595 및 BTS44596 각각 1 μg (1 μg/ mL, 1 mL)의 열분해율은 각각 122.9, 122.5 및 119.8%으로 완전한 분해를 확인하였으며, 100% 이상의 높은 2,4,6-TCP로의 분해율은 각 표준용액이 제조되어질 때의 농도 오차, one-point calibration 정량 등으로 인한 것이었을 뿐 분해율을 확인하는데 문제는 없었다.
- 회수율은 두 가지 처리수준에 걸쳐 각각 소고기 84.0-105.6%, 돼지고기 90.4-114.8%, 닭고기 94.1-112.0%, 우유 99.8-118.7% 및 계란 101.4-110.2%의 범위를 보였고 변이계수는 9.0% 이하이었으며(Table 5), 잔류분석기준인 회수율 70-120%, 변이계수 10% 이내를 만족하였다[12].
후속연구
- 0% 이하이었으며(Table 5), 잔류분석기준인 회수율 70-120%, 변이계수 10% 이내를 만족하였다[12]. 따라서,본 연구에서 확립된 분석법은 축산물 중 prochloraz 및 대사체를 정량분석하는데 정확성 및 정밀도가 우수함을 확인하였으며, 축산물 중 잔류농약 실태조사 및 정량평가 등에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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