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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 천궁의 초작과 연작 재배지에서 토양 곰팡이 군집을 분석하고, 재배지 토양특성이 토양곰팡이 군집에 미치는 영향을 구명하기 위해 수행하였다.
제안 방법
- , San Diego, CA, USA)을 이용하여 분석하였다. Raw sequence data 분석은 mothur application (version 1.43.0, Schloss et al., 2009)을 이용하여 UNITE reference database를 통해 분류적 동일성을 확인하였다 (Kim et al., 2019b). 이어서 염기서열을 mothur application에서 distance based greedy clustering (DGC) 분석을 이용하여 97% 염기서 열 유사수준의 operational taxonomic units (OTUs)로 군집화 하였고, 다양성 오차를 줄이기 위해 10개 미만의 염기서열을 가진 OTUs는 제외하였다.
- 본 연구에서는 천궁 재배지의 토양 이화학성이 토양곰팡이 군집의 군집화에 미치는 영향을 확인하기 위해 주좌표 분석 (PCoA analysis)과 DISTLM 분석을 통해 토양 이화학성과 토양곰팡이 군집 간의 상관관계를 확인하였다. 주좌표 분석에서는 Bray-Curtis similarity를 이용하여 토양곰팡이 군집의 염기 서열 간의 유사성을 ordination하여 나타냈고, 토양 이화학성은 각 축에 대한 상관계수를 통해 표시하였다 (Fig.
- 26, Pennsylvania State University, University Park, PA, USA)를 이용하여 시각화하였다. 상대적 빈도수 (relative abundance)는 염기서열수에 대한 phylotype 기반 분석을 통해 정량화하였다. 주좌표 분석 (principal coordinate analysis, PCoA)은 Bray-Curtis dissimilarity matrix를 기반으로 토양곰팡이 군집의 염기서열 간의 유사성을 ordination 하였고, 토양 특성 결과를 입력하여 각 축에 대한 상관계수를 통해 토양요인을 주좌표 분석의 좌표에 표시하였다.
- 연작에 따른 병원성 토양곰팡이 군집을 확인하기 위해 병해를 일으키는 대표적인 토양병원성 곰팡이인 Colletotrichum, Fusarium, Phytophthora, Pseudocercospora 및 Rhizoctonia의 상대적 빈도수를 확인하였다 (Table 5).
- 상대적 빈도수 (relative abundance)는 염기서열수에 대한 phylotype 기반 분석을 통해 정량화하였다. 주좌표 분석 (principal coordinate analysis, PCoA)은 Bray-Curtis dissimilarity matrix를 기반으로 토양곰팡이 군집의 염기서열 간의 유사성을 ordination 하였고, 토양 특성 결과를 입력하여 각 축에 대한 상관계수를 통해 토양요인을 주좌표 분석의 좌표에 표시하였다.
- 본 연구에서는 천궁 재배지의 토양 이화학성이 토양곰팡이 군집의 군집화에 미치는 영향을 확인하기 위해 주좌표 분석 (PCoA analysis)과 DISTLM 분석을 통해 토양 이화학성과 토양곰팡이 군집 간의 상관관계를 확인하였다. 주좌표 분석에서는 Bray-Curtis similarity를 이용하여 토양곰팡이 군집의 염기 서열 간의 유사성을 ordination하여 나타냈고, 토양 이화학성은 각 축에 대한 상관계수를 통해 표시하였다 (Fig. 2).
- 증폭된 염기서열은 Illumina MiSeq sequencing system (Illumina Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 분석하였다. Raw sequence data 분석은 mothur application (version 1.
- 천궁 재배지의 토양곰팡이 군집을 분석하기 위해 PowersoilTM DNA isolation kit (MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)를 통해 total DNA를 추출하였고, 염기서열 증폭 (polymerase chain reaction, PCR)은 internal transcribed spacer (ITS) region을 ITS3 (5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)과 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) primer를 이용하여 initial denaturation: 95℃, 5 min, (30 cycles) denaturation: 95℃, 30 sec, annealing: 55 ℃, 30 sec, extension: 72℃, 30 sec, final extension: 72℃, 7 min 조건에 따라 증폭하였다 (Kim et al., 2019a).
- 치환성 양이온 (exchangeable cation)은 1 N-NH4OAc으로 침출하고 진탕하여 여과한 후, 유도 결합 플라즈마 분광 분석기 (Inductively coupled plasma optical emission spectrometer, ICP-OES, optima 5300DV, Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 토양 이화학성 분석은 충청북도 농업기술원에서 “농촌진흥청 종합검정실 분석 매뉴얼”에 따라 수행하였다 (RDA, 2013). 토양 pH는 풍건한 토양시료를 증류수와 1 : 5의 비율로 희석하여 30분 동안 진탕한 후 pH meter를 이용하여 측정하였고, 전기전도도 (electric conductivity, EC)는 동일한 방법으로 전처리 후 EC meter를 이용하여 측정하였다. 유기물 (organic matter, OM) 함량은 Walkley-Black 법에 따라 측정하였고 (Walkley and Black, 1934), 유효인산 (available phosphate, avail.
- 이어서 염기서열을 mothur application에서 distance based greedy clustering (DGC) 분석을 이용하여 97% 염기서 열 유사수준의 operational taxonomic units (OTUs)로 군집화 하였고, 다양성 오차를 줄이기 위해 10개 미만의 염기서열을 가진 OTUs는 제외하였다. 토양곰팡이 군집의 계통수 (phylogenetic tree)는 Mothur application에서 tree.sharedfunction을 사용하여 구성하였고, MEGA7 software (version 7.0.26, Pennsylvania State University, University Park, PA, USA)를 이용하여 시각화하였다. 상대적 빈도수 (relative abundance)는 염기서열수에 대한 phylotype 기반 분석을 통해 정량화하였다.
- 토양병원성 곰팡이의 군집을 확인하기 위해 genus 수준에서 토양 감염으로 인해 병해를 일으키는 대표적인 병원성 곰팡이 5 종 (Colletotrichum, Fusarium, Phytophthora, Pseudocercospora, Rhizoctonia)의 상대적 빈도수를 확인하였다.
대상 데이터
- 경북 영양군 영양읍의 천궁 (Cnidium officinale Makino) 재배농가 중에서 2017년도부터 재배한 연작 재배지 (continuos cultivation, CC)와 2018년도에 천궁을 처음 재배하는 초작 재배지 (first cultivation, FC)를 선정하였다. 선정한 재배지의 비 료 시비는 경상북도 농업기술원에서 제시한 천궁 비료 시비량 에 따라 비료 (N-P-K : 12-10-15 ㎏/10a)와 퇴비 (2,000 ㎏/ 10a)를 시비하였다 (BHHES, 2012).
- 공시토양의 시료 채취는 2018년 8월에 수행하였고, 각 재배지 내 4 개의 구역을 선정하여 표토를 제거한 후 20 cm 이내의 깊이에서 근권 토양 100 g 씩 채취하였다.
- 경북 영양군 영양읍의 천궁 (Cnidium officinale Makino) 재배농가 중에서 2017년도부터 재배한 연작 재배지 (continuos cultivation, CC)와 2018년도에 천궁을 처음 재배하는 초작 재배지 (first cultivation, FC)를 선정하였다. 선정한 재배지의 비 료 시비는 경상북도 농업기술원에서 제시한 천궁 비료 시비량 에 따라 비료 (N-P-K : 12-10-15 ㎏/10a)와 퇴비 (2,000 ㎏/ 10a)를 시비하였다 (BHHES, 2012).
데이터처리
- 0314)의 유의적인 상관관계 를 확인하였다. 또한, 전체 토양 이화학성 중 어떤 요인이 토양곰팡이 군집에 영향을 주는지 sequential test를 통해 확인하 였다. 치환성 칼슘 (p = 0.
- 본 연구에서 도출된 정량적 실험 자료는 평균 ± 표준오차 (means ± standard error, S.E.)으로 나타냈다.
- 유의성 검정은 Statistical Analysis System (version 7.1, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) software를 이용하 여 토양곰팡이 군집의 상대적 빈도수를 T-검정을 통해 유의성을 검정하고, 최소유의차 (Least Significant Difference, LSD)는 p < 0.05 수준에서 통계 처리하였다.
- 천궁 재배지의 토양곰팡이 군집과 토양 이화학성 간의 상관 관계를 분석하기 위해 DISTLM 분석과 IBM SPSS Statistics (version 25, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 사용하여 유의적 관계를 확인하였다. 본 연구에서 도출된 정량적 실험 자료는 평균 ± 표준오차 (means ± standard error, S.
- 토양곰팡이 군집과 토양 이화학성 간의 유의적인 상관관계를 확인하기 위해 DISTILM 분석을 진행하였다 (Table 6). 토양곰팡이 군집과 토양 이화학성 각각의 유의적인 관계를 marginal test로 확인한 결과, 치환성 칼슘 (p = 0.
이론/모형
- 2. The ordination plot shown the soil samples, phylum an classes communities and soil parameters according to their fungal community composition obtained from principal coordinate analysis (PCoA analysis) based on Bray-Curtis dissimilarity matrix. The correlation between soil parameters and two axes are represented by the length and angle of the arrows.
- 양이온치환용량 (cation exchange capacity, CEC)은 1 N-NH4OAc으로 침출 후 토양에 치환된 NH4+ 를 Kjeldhal 증류법으로 측정하였다.
- 토양 pH는 풍건한 토양시료를 증류수와 1 : 5의 비율로 희석하여 30분 동안 진탕한 후 pH meter를 이용하여 측정하였고, 전기전도도 (electric conductivity, EC)는 동일한 방법으로 전처리 후 EC meter를 이용하여 측정하였다. 유기물 (organic matter, OM) 함량은 Walkley-Black 법에 따라 측정하였고 (Walkley and Black, 1934), 유효인산 (available phosphate, avail. P2O5) 함량은 토양시료액과 1-amino-2-naphtol-4-sulfanic acid를 잘 혼합하여 발색시킨 후 720 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 양이온치환용량 (cation exchange capacity, CEC)은 1 N-NH4OAc으로 침출 후 토양에 치환된 NH4+ 를 Kjeldhal 증류법으로 측정하였다.
- 토양 이화학성 분석은 충청북도 농업기술원에서 “농촌진흥청 종합검정실 분석 매뉴얼”에 따라 수행하였다 (RDA, 2013).
성능/효과
- 1)Pearson’s correlation analysis (PCC) written are significantly correlated between th variable compared.
- 5%) 순으로 상대적 빈도수가 높게 나타났다. Class 수준에서는 Dothideomycetes가 우점종 (30.4%)이었고, Tremellomycetes (23.4%), Sordariomycetes (22.7%), Pezizomycetes (12.4%), Zygomycota_class (4.1%) 순으로 나타났다. 특히 초작 재배지 중 FC2 샘플에서는 Ascomycota와 Dothideomycetes의 상대적 빈도수가 각각 97.
- 각 시료의 염기서열이 미생물 다양성을 얼마나 대표하는지 나타내는 추정치 (estimator)인 good’s coverage는 두 시료 모두 99.8%로 나타났으며, 이는 시료의 염기서열 reads 수가 통계적으로 충분하다는 것을 의미한다.
- 001)는 연작 재배지에서 유의적으로 높은 것으로 나타났다 (Table 3). 또한 이 중에서 Basidiomycota (담자균)의 속 (genus) 수준에서 초작과 연 작에 따른 토양곰팡이 군집의 상위 10개 속의 평균 OTUs 수를 확인한 결과, Masigobasidium (order: Leucosporidiales), Holtermannia (order: Tremellales), Lepiota (order: Agaricales)와 같은 Basidiomycota 속들이 연작 재배지에서 초작 재 배지에 비해 높은 OTUs 수를 보였으며, Mycobank database (www.mycobank.org)로부터 식물병원균 여부를 확인한 결과, 이와 같은 속들은 식물병원성을 보이지 않는 것으로 확인되었다(Table 4). 이는 재배연수가 증가함에 따라 천궁의 근권에 서식하는 토양곰팡이 군집이 변하는 것으로 판단된다.
- 3%)보다 높다는 것은 종좌표에 위치한 토양 이화학성이 횡좌표에 위치한 요인보다 토양곰팡이 군집에 더 영향을 준다는 것을 의미한다. 본 연구에서는 종좌표에 위치한 유효 인산, pH, 치환성 칼슘, 치환성 칼륨, 전기전도도가 횡좌표에 위치한 다른 토양 이화학성보다 토양곰팡이 군집에 영향을 주는 것으로 판단된다.
- 재배지의 병원성 곰팡이 군집의 상대적 빈도수를 비교 분석한 결과, Phytophthora와 Pseudocercospora의 상대적 빈도수는 확인할 수 없었고 Colletotrichum, Fusarium 및 Rhizoctonia는 초작과 연작 재배지에서 모두 확인하였다. 하지만 Colletotrichum과 Rhizoctonia는 초작과 연작 재배지에서 유의적 차이가 없었고, Fusarium은 초작보다는 연작 재배지에서 상대적 빈도수가 유의적으로 높았다.
- 천궁의 병해 연구는 아직 미미하지만, Fusarium 속 병원균의 상대적 빈도수가 연작 재배지에서 유의적으로 높음을 본 연구에서 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 향후 천궁의 연작 재배에 따른 시들음병 발병과 Fusarium 속 병원균의 상대적 빈도수 간의 상관관계에 관한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 초작 및 연작 재배지에 따른 토양곰팡이 군집의 상대적 빈도수를 비교 분석한 결과, Ascomycota (p ≤ 0.001)와 Chytridiomycetes (p ≤ 0.05)는 연작 재배지보다 초작 재배지 에서 상대적 빈도수가 유의적으로 높았고, Basidiomycota (p ≤ 0.001)와 Tremellomycetes (p ≤ 0.001)는 연작 재배지에서 유의적으로 높은 것으로 나타났다 (Table 3).
- 초작 및 연작 재배지에서 채취한 토양시료의 특성을 분석한 결과, 재배지의 토성은 사양토 (sandy loam)였고, 토양 평균 pH는 6.43 - 7.19로 약산성에서 약알칼리성 토양으로 나타났다 (Table 1).
- 초작 및 연작 재배지의 토양시료로부터 토양곰팡이 군집의 계통수를 확인한 결과, 초작과 연작에 따라 총 3 개의 그룹 (group 1: FC2, group 2: FC1, FC3, FC4, group 3: CC1, CC2, CC3, CC4)으로 군집화를 이루는 것을 확인하였고, 초작보다는 연작 재배지의 토양곰팡이 군집이 더 군집화 (clustering)를 이루는 것을 확인하였다 (Fig. 1).
- 또한, 전체 토양 이화학성 중 어떤 요인이 토양곰팡이 군집에 영향을 주는지 sequential test를 통해 확인하 였다. 치환성 칼슘 (p = 0.0170)이 토양곰팡이 군집에 가장 큰 유의적 영향을 주었고, 그다음은 pH (p = 0.0403)였다. 토양곰팡이 군집 중, 초작과 연작 재배지 간의 유의적인 차이를 Ascomycota, Chytridiomycetes 및 Basidiomycota 계통에서 확인하였고 Pearson 상관관계 분석을 통해 이들 계통의 군집과 토양 이화학성 간에 pH, 유효인산 및 치환성 칼슘이 유의적인 영향을 주는 것을 알 수 있었다 (Table 7).
- 토양 pH는 각 재배지 우점종과 유의적인 상관관계를 확인할 수 없었고, 유효인산은 Ascomycota와 Chtridiomycete 군집과 유의적인 부의 상관관계를 보인 반면, Basidiomycota 군집과는 유의적인 정의 상관관계를 보였다. 치환성 칼슘은 유효인산과 유사한 결과를 보였는데, Ascomycota (phylum)과는 유의적인 부의 상관관계, Cystofilobasidiaceae (Basidiomycota_family)와는 유의적인 정의 상관관계를 확인하였다.
- 토양곰팡이 군집 중, 초작과 연작 재배지 간의 유의적인 차이를 Ascomycota, Chytridiomycetes 및 Basidiomycota 계통에서 확인하였고 Pearson 상관관계 분석을 통해 이들 계통의 군집과 토양 이화학성 간에 pH, 유효인산 및 치환성 칼슘이 유의적인 영향을 주는 것을 알 수 있었다 (Table 7). 토양 pH는 각 재배지 우점종과 유의적인 상관관계를 확인할 수 없었고, 유효인산은 Ascomycota와 Chtridiomycete 군집과 유의적인 부의 상관관계를 보인 반면, Basidiomycota 군집과는 유의적인 정의 상관관계를 보였다. 치환성 칼슘은 유효인산과 유사한 결과를 보였는데, Ascomycota (phylum)과는 유의적인 부의 상관관계, Cystofilobasidiaceae (Basidiomycota_family)와는 유의적인 정의 상관관계를 확인하였다.
- 토양곰팡이 군집 염기서열 분석 데이터는 dataset을 최소 reads 수로 정규화 (normalize)하여 40,015 개의 염기서열 수를 확인하였고, OTUs 수는 초작과 연작 재배지에서 각각 평 균 317.4 개, 378.7 개의 OTUs를 확인하였다 (Table 2). 각 시료의 염기서열이 미생물 다양성을 얼마나 대표하는지 나타내는 추정치 (estimator)인 good’s coverage는 두 시료 모두 99.
- 0403)였다. 토양곰팡이 군집 중, 초작과 연작 재배지 간의 유의적인 차이를 Ascomycota, Chytridiomycetes 및 Basidiomycota 계통에서 확인하였고 Pearson 상관관계 분석을 통해 이들 계통의 군집과 토양 이화학성 간에 pH, 유효인산 및 치환성 칼슘이 유의적인 영향을 주는 것을 알 수 있었다 (Table 7). 토양 pH는 각 재배지 우점종과 유의적인 상관관계를 확인할 수 없었고, 유효인산은 Ascomycota와 Chtridiomycete 군집과 유의적인 부의 상관관계를 보인 반면, Basidiomycota 군집과는 유의적인 정의 상관관계를 보였다.
- 토양곰팡이 군집과 토양 이화학성 간의 유의적인 상관관계를 확인하기 위해 DISTILM 분석을 진행하였다 (Table 6). 토양곰팡이 군집과 토양 이화학성 각각의 유의적인 관계를 marginal test로 확인한 결과, 치환성 칼슘 (p = 0.0170), pH (p = 0.0221) 및 유효인산 (p = 0.0314)의 유의적인 상관관계 를 확인하였다. 또한, 전체 토양 이화학성 중 어떤 요인이 토양곰팡이 군집에 영향을 주는지 sequential test를 통해 확인하 였다.
- 토양곰팡이 군집은 초작과 연작 재배지에 따라 구분되어 나타났고, Ascomycota는 초작 재배지에서, Basidiomycota는 연작 재배지에서 우점하는 것으로 나타났다. 주좌표 분석의 각 축 (PC1, PC2)에 대한 수치(%)는 토양곰팡이 군집의 변화량 (variation)을 말하며, 좌표에 있는 토양 이화학성은 종 (ordinate) 또는 횡(abscissa)으로 나누는 토양곰팡이 군집과의 연관성을 가진다.
- 토양곰팡이 군집의 상대적 빈도수를 확인한 결과, Phylum 수준에서 Ascomycota가 전체 평균의 70.3%로 우점종임을 확인하였고, Basidiomycota (24.9%), Zygomycota (4.1%), Chytridiomycota (0.5%) 순으로 상대적 빈도수가 높게 나타났다. Class 수준에서는 Dothideomycetes가 우점종 (30.
- 1%) 순으로 나타났다. 특히 초작 재배지 중 FC2 샘플에서는 Ascomycota와 Dothideomycetes의 상대적 빈도수가 각각 97.3%, 91.9%로 다른 샘플에 비해 높은 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 향후 샘플 반복수를 보다 보완하여 초작 재배지 중에서도 토양 곰팡이 우점종의 상대적 빈도수 차이를 구명하는 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 재배지의 병원성 곰팡이 군집의 상대적 빈도수를 비교 분석한 결과, Phytophthora와 Pseudocercospora의 상대적 빈도수는 확인할 수 없었고 Colletotrichum, Fusarium 및 Rhizoctonia는 초작과 연작 재배지에서 모두 확인하였다. 하지만 Colletotrichum과 Rhizoctonia는 초작과 연작 재배지에서 유의적 차이가 없었고, Fusarium은 초작보다는 연작 재배지에서 상대적 빈도수가 유의적으로 높았다. 재배지에서 동일작물을 연작하면 양분의 불균형, 토양 물리 성의 악화 및 식물의 독소물질 배출 등으로 인해 토양에 서식하는 미생물이 단순화되면서 병원균이 증식하게 된다 (Kim and Kim, 2002; Park et al.
후속연구
- 본 연구결과는 천궁 재배지의 토양곰팡이 군집 연구에 관한 기초연구 자료로 활용할 수 있을 것이고, 향후 천궁 외에도 약용작물 재배지의 연작에 따른 토양특성과 토양곰팡이 군집 간의 상관관계를 구명하는 데 중요한 정보를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
- 천궁의 병해 연구는 아직 미미하지만, Fusarium 속 병원균의 상대적 빈도수가 연작 재배지에서 유의적으로 높음을 본 연구에서 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 향후 천궁의 연작 재배에 따른 시들음병 발병과 Fusarium 속 병원균의 상대적 빈도수 간의 상관관계에 관한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 9%로 다른 샘플에 비해 높은 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 향후 샘플 반복수를 보다 보완하여 초작 재배지 중에서도 토양 곰팡이 우점종의 상대적 빈도수 차이를 구명하는 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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