[논문]In vitro 검출 시스템을 이용한 한약재 열수 및 에탄올 추출물의 남성호르몬 유사활성 검출

이동근; 조정권; 이상현

doi:10.5352/jls.2020.30.6.550

In vitro 검출 시스템을 이용한 한약재 열수 및 에탄올 추출물의 남성호르몬 유사활성 검출
Detection of Testosterone-like Activities of Hydrothermal and Ethanol Extracts of Oriental Medicines Using an in Vitro Detection System 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.6, 2020년, pp.550 - 554

이동근 (신라대학교 바이오산업학부 제약공학전공) , 조정권 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과) , 이상현 (신라대학교 바이오산업학부 제약공학전공)

초록
AI-Helper

이 연구의 목적은 시험관내 TCD (테스토스테론 화합물 검출) 시스템으로 8개 한약재의 테스토스테론 유사 활성을 검색하는 것이었다. 녹각상, 백수오, 야관문, 홍삼, 토령, 민들레, 남가세, 호로파의 열수 추출물과 80% 에탄올 추출물을 5, 50, 500 ㎍/ml의 농도로 in vitro TCD 시스템에 적용하였다. 80% 에탄올 추출물의 테스토스테론 유사 활성은 일반적으로 농도에 비례하였고, 음성대조군보다 0.9 내지 5.0 배 더 높았다. 호로파와 야관문은 동일한 농도에서 우수한 테스토스테론 유사 활성을 보였으며 민들레와 홍삼이 그 뒤를 이었다. 토령과 남가세는 낮은 테스토스테론 유사 활성을 보였으며 녹각상과 백수오는 매우 낮은 활성을 나타냈다. 양성대조군 5α-DHT의 활성과 비교하면, 호로파 및 야관문의 80% 에탄올 추출물은 500 ㎍/ml에서 10^-8 M 5α-DHT보다 높은 테스토스테론 유사 활성을 나타냈다. 열수 추출물은 80% 에탄올 추출물보다 낮은 테스토스테론 유사 활성을 보였고, 농도에 따른 활성의 증가도 에탄올 추출물보다 낮았다. 호로파, 야관문 및 민들레 등의 80% 에탄올 추출물이 테스토스테론 관련 유전자의 전사 효율을 향상시킬 수 있음이 확인되었다. 따라서, 본 연구는 남성 갱년기 증상의 개선에 필요한 건강 기능성 식품 재료 또는 의약 재료를 개발하는 데 참고가 될 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to screen the testosterone-like activities of eight oriental medicines with an in vitro testosterone compound detection (TCD) system. Distilled water and 80% ethanol, both at 80℃, were used to obtain extracts from Cervus nippon temminck (Nokgaksang), Cynanchum wilfordii (Baeksuo), Lespedeza cuneata (Yagwanmun), Panax ginseng (Hongsam), Smilax china (Toryeong), Taraxacum platycarpum (Mindlre), Tribulus terresteis (Namgase), and Trigonella foenum-graecum (Horopa), and extracts at concentrations of 5, 50, and 500 ㎍/ml were assessed using the TCD system. The testosterone-like activities of the 80% ethanol extracts were seen to increase with concentration and ranged from 0.9 to 5.0 times higher than those of the negative control; Horopa and Yagwanmun exhibited superior testosterone-like activities, followed by Mindlre and Hongsam at the same concentration. Toryeong and Namgase, on the other hand, showed low activity with Nokgaksang and Baeksuo exhibiting very low levels. Compared with the activities of the positive control (5α-DHT), the 80% ethanol extracts of Horopa and Yagwanmun at a concentration of 500 ㎍/ml showed higher testosterone-like activities than 10-8 M 5α-DHT. The water extracts showed lower activity levels than the ethanol samples, and the change of activity with concentration was also lower. It was confirmed that the 80% ethanol extracts of Horopa, Yagwanmun, and Mindlre etc. enhance the transcription efficiency of testosterone-related genes and may therefore be useful in developing health food or medicinal treatments for the improvement of male menopausal symptoms.

주제어

표/그림 (2)

그림 Fig. 1. Testosterone-like activities of 80% ethanol extracts of oriental medicines.
그림 Fig. 2. Testosterone-like activities of hot water extracts of oriental medicines.

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

이때 luciferase가 리포터유전자로 사용되어, 테스토스테론의 활성이 높을수록 luciferase가 많이 만들어진다[14]. 본 연구는 한약재에서 유효성분을 추출하고 in vitro TCD 시스템을 이용하여 테스토스테론 유사활성을 검증하였다.
본 연구에서 사용된 남성호르몬을 검출할 수 있는 in vitro 시스템은 in vivo 연구의 사전 단계에 활용가능성이 매우 높을 것이다. 본 연구에서는 8종의 한약재를 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물로 나눈 뒤에 테스토스테론 유사활성을 검증하여 호로파, 야관문, 민들레 추출물이 관련 유전자의 전사를 촉진하는 높은 테스토스테론 유사활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 활용하여 남성갱년기 증상의 개선이나 완화에 도움을 줄수 있는 건강 기능성식품 소재 등으로의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
아직 국내에서 본 연구진[14] 이외에 테스토스테론에 반응하는 세포주나 테스토스테론의 전사활성 촉진에 근거하여, 테스토스테론 활성 검증이나 검출에 대한 보고는 찾아보기 어렵다. 이에 본 연구에서는 본 연구진의 남성호르몬 활성을 측정할 수 있는 in vitro 테스토스테론 화합물 검출(TCD, testosterone compound detection) 시스템을[14] 이용하여, 전통적인 한약재나 생약재 중에서 남성의 활력증진에 도움이 되는 것으로 알려진 야관문, 홍삼, 민들레 외에 여성호르몬 유사물질이 있어 남성호르몬으로의 전환이 가능할 것 같은 백수오 등 8종의 한약재가 나타내는 테스토스테론 유사활성을 파악하고자 하였다.

제안 방법

4 ml의 1X PBS로 세포를 씻고 원심분리(3,000×g, 5분)하여 상등액을 제거하는 과정을 총2회 실시하였다.
LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA 세포를 1% penicillin/streptomycin, 0.08 mg/ml 농도의 G418 (LPS Solution, Korea)과 10% FBS가 포함된 DMEM에서 세포밀도가 약 90%가 될 때까지 배양한 후, 4 ml의 1X PBS (Corning, USA)로 씻고 10% charcoal stripped FBS (CSF)와 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 DMEM으로 교환하였다. 여기에 한약재의 열수- 혹은 80% 에탄올-추출물을 5, 50, 500 μg/ml의 농도로 주입하고 37°C, 5%의 CO2 배양기에서 48시간 배양한 후 세포를 회수하였다.
Stable transfection으로 확립된 G418 저항성 및 테스토스테론 유사물질 검증 시스템을 가지는 LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA 세포[14]에 추출물을 처리하고 발현되는 luciferase를 남성호르몬 유사활성의 리포터로 활용하였다.
이 등[16]은 70% 에탄올을 이용한 호로파와 야관문 복합추출물을 흰쥐에 투여하여 테스토스테론의 증가를 확인하였다. 민들레 열수 추출물을 유산균 발효군과 비발효군으로 나누어 흰쥐에 투여하여, 투여 3주 후부터 두 실험군 모두에서 혈중 테스토스테론의 농도와 테스토스테론 합성 유전자 활성의 증가도 확인하였다[15]. 본 연구에서의 80% 에탄올추출과 열수추출 결과로 파악하면, 80% 에탄올로 추출한 호로파와 야관문 추출물 각각이 가장 높은 테스토스테론 활성을 보였다.
본 연구에서 사용한 in vitro TCD (Testosterone Compound Detection) 시스템은 테스토스테론 혹은 테스토스테론 유사물질이 세포막을 통과하여 세포질의 안드로겐 수용체(AR, androgen receptor)와 결합하여 형성된 테스토스테론-AR 복합체가, 핵 내부에서 테스토스테론의 신호를 받고 전사되는 유전자의 조절부위에 결합하여, 해당 유전자의 전사를 촉진하는 것을 이용한다. 이때 luciferase가 리포터유전자로 사용되어, 테스토스테론의 활성이 높을수록 luciferase가 많이 만들어진다[14].
이들은 모두 동물실험으로 생체에서의 효과를 볼 수 있는 장점이 있지만 실제 인체가 아니라는 한계도 있다. 본 연구진은 에스트로겐에 반응하여 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 혹은 luciferase의 전사 및 번역이 이루어지도록 재조합 플라스미드를 제조하고, MCF-7 유방암 세포주에 stable transfection으로 여성호르몬에 반응하는 세포주를 확립하고 길경, 황기, 감초, 오미자, 택사, 지황, 산약, 복령 등의 에스트로겐 유사활성을 검증하여 여성갱년기 증상 완화에 도움이 되는지 확인하였다[6, 17, 20].
양성대조군의 표준물질로는 테스토스테론 물질인 5-α-DHT (dihydroxy-testosterone, Sigma, USA)를 95% 에탄올에 녹여 최종농도가 10-13~10-8 M이 되도록 첨가하였고, 음성대조군은 95% 에탄올만을 동일한 양으로 첨가하였다.
여기에 한약재의 열수- 혹은 80% 에탄올-추출물을 5, 50, 500 μg/ml의 농도로 주입하고 37°C, 5%의 CO2 배양기에서 48시간 배양한 후 세포를 회수하였다.
이후 1X lysis buffer 250 μl를 넣고 원심분리(13,000×g, 5분)하여 회수한 상층액 20 μl에 luciferase assay 기질용액(Promega, USA) 100 μl를 거품이 생기지 않게 투입하고 Luminometer (TD-20/20, Turner Designs, USA)를 이용하여 발광의 정도를 측정하였다.
한약재 건조분말시료 무게의 10배량의 3차 증류수 혹은 80% 에탄올을 첨가한 후, 환류냉각추출기로 6시간 동안 80°C 조건에서 추출을 진행하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 한약재는 8종으로 녹각상(Nokgaksang, Cervus nippon temminck degelatinatum), 백수오(Baeksuo, Cynanchum wilfordii), 야관문(Yagwanmun, Lespedeza cuneata), 홍삼(Hongsam, Panax ginseng), 토령(Toryeong, Smilax china), 민들레(Mindlre, Taraxacum platycarpum), 남가세(Namgase, Tribulus terresteis), 호로파(Horopa, Trigonella foenum-graecum) 등을 (주)삼홍건재약업사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 구입 후 분쇄하였고 4°C에서 밀봉상태로 보관하였다.

데이터처리

실험결과에서 구한 모든 결과의 one-way ANOVA는 Macintosh용 통계프로그램 Aabel 2.0 (Gigawiz Ltd Co., USA)으로 수행하였고, 사후검증으로 Fisher’s PLSD의 다중범위 유의성 검증을 실시하였다.

성능/효과

50 μg/ml에서의 유사활성은 호로파를 제외하고는 모두 10-9 M의 5α- DHT보다 낮은 활성을 보였다.
80% 에탄올 추출물 50 μg/ml 농도에서의 테스토스테론 유사 활성을 음성대조군과 비교하면 야관문과 호로파가 각각 2.5배 와 2.3배 높은 활성을 보였으며 10-9 M 5α-DHT 활성과 오차범위에서 겹쳤다.
그리고 민들레는 80% 에탄올 추출물에서 3번째로 높은 활성을 보였고, 열수 추출물 500과 50 μg/ml에서도 p<0.001 수준의 유의미한 테스토스테론 활성의 증가를 확인하였다.
동일 농도에서의 활성을 비교하면 호로파와 야관문이 비슷하게 가장 높았고, 다음으로 민들레와 홍삼 순서였다. 녹각상과 백수오는 아주 낮은 테스토스테론 유사활성을 보였고, 토령과 남가세도 낮은 활성을 보였다. 음성대조군과 비교하여 80% 에탄올 추출물 500 μg/ml 농도에서는 야관문과 호로파가 평균 5.
민들레 열수 추출물을 유산균 발효군과 비발효군으로 나누어 흰쥐에 투여하여, 투여 3주 후부터 두 실험군 모두에서 혈중 테스토스테론의 농도와 테스토스테론 합성 유전자 활성의 증가도 확인하였다[15]. 본 연구에서의 80% 에탄올추출과 열수추출 결과로 파악하면, 80% 에탄올로 추출한 호로파와 야관문 추출물 각각이 가장 높은 테스토스테론 활성을 보였다. 그리고 민들레는 80% 에탄올 추출물에서 3번째로 높은 활성을 보였고, 열수 추출물 500과 50 μg/ml에서도 p<0.
열수 추출물 500 μg/ml에서의 테스토스테론 유사활성을 음성대조군과 비교하였을 때 호로파, 야관문, 토령, 민들레, 홍삼, 남가세가 2.0배 내외의 활성을 보였으며, 표준물질인 5α-DHT를10-9 M농도로 처리했을 때와 큰 차이를 보이지 않았다.
음성대조군과 비교하여 80% 에탄올 추출물 500 μg/ml 농도에서는 야관문과 호로파가 평균 5.0배, 민들레가 4.1배, 홍삼이 2.6배, 토령과 남가세가 각각 평균 2.1배와 2.0배 높게 나타났다.
이때 야관문과 호로파는 10-8 M의 5α-DHT보다 높은 활성을 보였고, 민들레는 10-9와 10-8 M 5α-DHT와 유사한 활성을 보였으며, 홍삼은 10-9 M 5α-DHT가 나타내는 활성보다 높았지만 오차범위에서 겹쳤다.
2에 나타내었다. 전반적으로 같은 한약재의 80% 에탄올 추출물에 비해 낮은 활성을 보였고, 한약재 열수 추출물의 농도 증가에 따른 테스토스테론 유사활성의 변화가 80% 에탄올 추출물의 변화만큼 크지 않았다. 열수 추출물 500 μg/ml에서의 테스토스테론 유사활성을 음성대조군과 비교하였을 때 호로파, 야관문, 토령, 민들레, 홍삼, 남가세가 2.
1에 나타내었다. 추출물이 음성대조군에 비해 농도별로 0.9배에서 5.0배 정도 높은 테스토스테론 유사활성을 보였고, 각 추출물은 농도가 증가함에 따라 대체적으로 테스토스테론 유사활성도 증가하였다(Fig. 1). 백수오와 남가세는 500 μg/ml과 50 μg/ml에서의 테스테스테론 유사활성에서 큰 차이를 보이지 않았다.

후속연구

반면에 본 연구와 같은 in vitro 연구는 다량의 시료를 이용하더라도, 결과를 수 일 내에 도출할 수 있으며 윤리적 문제에서 자유로울 수 있다. 본 연구에서 사용된 남성호르몬을 검출할 수 있는 in vitro 시스템은 in vivo 연구의 사전 단계에 활용가능성이 매우 높을 것이다. 본 연구에서는 8종의 한약재를 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물로 나눈 뒤에 테스토스테론 유사활성을 검증하여 호로파, 야관문, 민들레 추출물이 관련 유전자의 전사를 촉진하는 높은 테스토스테론 유사활성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 연구에서는 8종의 한약재를 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물로 나눈 뒤에 테스토스테론 유사활성을 검증하여 호로파, 야관문, 민들레 추출물이 관련 유전자의 전사를 촉진하는 높은 테스토스테론 유사활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 활용하여 남성갱년기 증상의 개선이나 완화에 도움을 줄수 있는 건강 기능성식품 소재 등으로의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

참고문헌 (23)

Bhasin, S., Cunningham, G. R., Hayes, F. J., Matsumoto, A. M., Snyder, P. J., Swerdloff, R. S. and Montori, V. M. 2006. Testosterone therapy in adult men with androgen deficiency syndromes: An endocrine society clinical practice guideline. J. Clin. Endocr. Metab. 91, 1995-2010.

상세보기
Handa, R. J., Roselli, C. E. and Resko, J. A. 1998. Distribution of androgen receptor in microdissected brain areas of the female baboon (Papio cynocephalus). Brain Res. 445, 111-116.
http://www.index.go.kr/potal/info/idxKoreaView.do?idx_cd2758
http://www.nifds.go.kr/brd/m_15/view.do?seq10043
https://www.khsa.or.kr/user/info/InfoHealthFood.do?_menuNo225
Jeon, M. J., Kim, S., Kim, B. K., Cheon, J., Park, S. H., Oh, E., Lee, S. H. and Kim, M. H. 2013. The effects of seaweed gongjindan on estrogen like activities, platelet aggregation and serum lipid levels in ovariectomized rats. J. Life Sci. 23, 1155-1162.

원문보기 상세보기
Kim, E. T., Lee, J. H., Jung, J. H., Jo, H. W., Ju, H. T., Park, J. S., Woo, S. H. and Kim, D. K. 2010. Testosterone replacement in men with late-onset hypogonadism symptoms and loss of diurnal rhythm of total testosterone. Kor. J. Androl. 28, 190-196.
Kim, G. Y., Lee, H. G. and Kim, E. J. 2015. Effects of extracts from oja on testosterone synthesis in Leydig cells. J. Physiol. Pathol. Kor. Med. 29, 403-408.

원문보기 상세보기
Kim, J. J. 2004. PADAM (Partial Androgen Deficiency in the Aging Male) and hormone replacement therapy. Kor. J. Anndrol. 22, 45-51.
Kim, K. M. 2013. Late-onset hypogonadism. Kor. J. Fam. Pract. 3, 245-254.
Kim, M. H. 2007. Effect of Lycii fructus extracts on serum lipids and bone collagen contents in ovariectomized rats. Kor. J. Ori. Physiol. Pathol. 21, 111-116.
Kim, M. H., Kim, B. K., Kim, J. D., Kang, A. R., Lee, C. E., Seo, J. M., Lee, D. G., Jo, J. K., Kim, Y. Y., Yu, K. H. and Lee, S. H. 2017. The effects of medicinal herbs extracts on estrogen-like activities and osteoblast proliferation and differentiation. J. Life Sci. 27, 456-463.

원문보기 상세보기
Kim, T. M., Jung, H. K., Jang, J. H., Sim, M. O., Lee, M. J., Cho, J. H. and Cho, H. W. 2016. Effect of Corni fructus on testosterone deficiency syndrome in in vitro and in vivo. Kor. J. Pharmacogn. 47, 264-272.
Lee, D. G., Jo, G. K. and Lee, S. H. 2019. Establishment of an in vitro TCD (testosterone compound detection) system. J. Life Sci. 29, 1159-1163.
Lee, H. S., Baek, Y. S., Kim, Y. S. and Kim, H. P. 2016. Effects of fermented dandelion (Taraxacum coreanum) extract on male climacteric syndrome. J. Life Sci. 26, 1063-1073.

원문보기 상세보기
Lee, K, S., Lee, E. K., Kim, S. Y., Kim, T. H. and Kim, H. P. 2015. Effect of mixed extract of Fenugreek seeds and Lespedeza cuneata on testosterone deficiency syndrome. Kor. J. Food Sci. Technol. 47, 492-498.

원문보기 상세보기
Lee, S. H. 2003. Verification of estrogenic activities in ethanol extracts of oriental herbal medicines using in vitro detection system. Kor. J. Ori. Physiol. Pathol. 17, 1054-1058.
Min, K. S. and Kang, D. L. 2011. Testosterone replacement therapy and monitoring for the male patients with testosterone deficiency syndrome. J. Kor. Med. Assoc. 54, 197-204.

상세보기
Park, J. S., You, G. D., Seo, S. M., Han, S. B., Hong, J. T. and Han, K. 2013. Inhibition effect of testosterone metabolism of some natural products containing yacon and their ameliorative effect of benign prostatic hyperplasia symptom. Yakhak Hoeji 57, 241-249.
Park, S. H., Jeon, M. J., Jang, M. K., Lee, S. J., Kim, B. K., Jeon, M. J., Kim, S. Y., Kim, M. H., Lee, D. G., Lee, T. H., Nam, J. S., Hur, W. J. and Lee, S. H. 2013. Verification of estrogen like activities of herbal medicines using an in vitro detection system. Kor. J. Ori. Physiol. Pathol. 27, 752-758.
Park, S. Y., Ahn, S. H. and Kim, H. H. 2019. Effects of Fructus amomi Amari, Eucommiae cortex, Bombyx batryticatus extract on improving symptoms of late-onset hypogonadism. J. Physiol. Pathol. Kor. Med. 33, 89-101.

원문보기 상세보기
Seo, K. K., Yoon, S. Y. and Kim, S. C. 1998. Efficacy and safety of Androderm $^{TM}$ in partial androgen-deficiency aging men with erectile dysfunction. Kor. J. Androl. 16, 79-85.
Singh, P. 2013. Andropause: Current concepts. Indian J. Endocrinol. Metab. 17(Suppl 3), S621-S629.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증