본 연구는 용해도가 낮은 수용성 활성물질인 바이오틴(biotin)의 안정화 및 용해도 증가를 목적으로 나노리포좀을 활용하였다. 이번 실험을 통해 바이오틴 나노리포좀의 안정성에 pH가 큰 영향을 준다는 사실을 확인할 수 있었으며, pH 상승이 바이오틴 활성에 튼 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 또한 제타사이저(zetasizer)로 입자크기, 제타전위(zeta potential) 및 다분산지수(polydispersity index)를 측정하여 안정성을 평가하였다. 입자크기는 평균 100 ~ 250 nm, 제타전위 -80 ~ -30 mV로 나노리포좀 제조가 가능함을 확인하였다. 바이오틴 나노리포좀 내의 바이오틴 캡슐화율(capsulation efficiency)을 측정하기 위해 dialysis membrane method (DMM)를 이용하여 평가하였으며, 이를 통해 알지닌을 첨가시킨 바이오틴 나노리포좀이 일반 바이오틴 나노리포좀보다 캡슐화율이 5 배 높은 것으로 측정되었다. 바이오틴 나노리포좀의 경피흡수율을 측정하기 위해 in vitro franz diffusion cell method를 통해 확인하였으며, cryogenic transmission electron microscopy (cryo - TEM)을 통해 바이오틴 나노리포좀이 잘 형성되었는지 확인하였다. 본 논문을 통하여 모발건강과 밀접한 관계가 있는 것으로 소개된 바이오틴을 약물전달체(drug delivery carrier)인 나노리포좀에 캡슐화시켜 기존의 낮은 용해도 및 석출되는 문제를 보완한 바이오틴 나노리포좀을 만들 수 있음을 확인하였다.
본 연구는 용해도가 낮은 수용성 활성물질인 바이오틴(biotin)의 안정화 및 용해도 증가를 목적으로 나노리포좀을 활용하였다. 이번 실험을 통해 바이오틴 나노리포좀의 안정성에 pH가 큰 영향을 준다는 사실을 확인할 수 있었으며, pH 상승이 바이오틴 활성에 튼 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 또한 제타사이저(zetasizer)로 입자크기, 제타전위(zeta potential) 및 다분산지수(polydispersity index)를 측정하여 안정성을 평가하였다. 입자크기는 평균 100 ~ 250 nm, 제타전위 -80 ~ -30 mV로 나노리포좀 제조가 가능함을 확인하였다. 바이오틴 나노리포좀 내의 바이오틴 캡슐화율(capsulation efficiency)을 측정하기 위해 dialysis membrane method (DMM)를 이용하여 평가하였으며, 이를 통해 알지닌을 첨가시킨 바이오틴 나노리포좀이 일반 바이오틴 나노리포좀보다 캡슐화율이 5 배 높은 것으로 측정되었다. 바이오틴 나노리포좀의 경피흡수율을 측정하기 위해 in vitro franz diffusion cell method를 통해 확인하였으며, cryogenic transmission electron microscopy (cryo - TEM)을 통해 바이오틴 나노리포좀이 잘 형성되었는지 확인하였다. 본 논문을 통하여 모발건강과 밀접한 관계가 있는 것으로 소개된 바이오틴을 약물전달체(drug delivery carrier)인 나노리포좀에 캡슐화시켜 기존의 낮은 용해도 및 석출되는 문제를 보완한 바이오틴 나노리포좀을 만들 수 있음을 확인하였다.
This study utilized nano-liposomes for the purpose of stabilizing and increasing the solubility of biotin, a water-soluble active material with low solubility. The particle size, zeta potential, and polydispersity index were confirmed with a nano zetasizer. It was possible to manufacture nano liposo...
This study utilized nano-liposomes for the purpose of stabilizing and increasing the solubility of biotin, a water-soluble active material with low solubility. The particle size, zeta potential, and polydispersity index were confirmed with a nano zetasizer. It was possible to manufacture nano liposomes at 100 to 250 nm of particle size and -80 to -30 mV of zeta potential. Dialysis membrane method (DMM) was used to measure the capsulation efficiency of biotin in biotin nano-liposomes, and results showed that pH increased biotin nano-liposomes had higher capsulation efficiency than normal biotin nano-liposome. Through this experiment, it was confirmed that the pH has a great influence on the stability of biotin nano-liposomes. In vitro franz diffusion cell method was used to measure in vitro skin absorption rate of biotin nano-liposomes. The shape of the formulation and biotin solubility in nano-liposome was observed by cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM). Through this study, we confirmed that biotin, which is introduced as closely related to hair health, can be incorporated into a nano-liposome drug delivery system, to make biotin nano-liposome with improved solubility and precipitation problems.
This study utilized nano-liposomes for the purpose of stabilizing and increasing the solubility of biotin, a water-soluble active material with low solubility. The particle size, zeta potential, and polydispersity index were confirmed with a nano zetasizer. It was possible to manufacture nano liposomes at 100 to 250 nm of particle size and -80 to -30 mV of zeta potential. Dialysis membrane method (DMM) was used to measure the capsulation efficiency of biotin in biotin nano-liposomes, and results showed that pH increased biotin nano-liposomes had higher capsulation efficiency than normal biotin nano-liposome. Through this experiment, it was confirmed that the pH has a great influence on the stability of biotin nano-liposomes. In vitro franz diffusion cell method was used to measure in vitro skin absorption rate of biotin nano-liposomes. The shape of the formulation and biotin solubility in nano-liposome was observed by cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM). Through this study, we confirmed that biotin, which is introduced as closely related to hair health, can be incorporated into a nano-liposome drug delivery system, to make biotin nano-liposome with improved solubility and precipitation problems.
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문제 정의
때문에 나노 크기의 입자가 포함된 기능성화장품을 사용하면 유효성분이 피부에 보다 깊숙이 흡수 및 전달되는 것으로 알려져 있다[16]. 따라서 본 실험에서는 피부를 통한 유효성분 전달의 방법으로 알려진 나노리포좀의 효과 및 이용 가능성을 알아보기 위해 화장품에 사용되는 용해도가 낮은 탈모방지제 성분인 바이오틴을 나노리포좀에 캡슐화 시켜바이오틴의 리포좀에서의 안정성 및 용해도에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 나노리포좀은 구성하고 있는 인지질 및 첨가제, 제조 공정 등에 의해서 특성이 많이 달라지므로, 바이오틴이 리포좀에 잘 캡슐화 되었는지를 확인하기 위하여 dialysis membrane method (DMM)를 이용해 바이오틴에 대한 나노리포좀의 캡슐화율(capsulation efficiency)을 평가하였다.
바이오틴 나노리포좀 제조 시 바이오틴이 석출되는 문제점을 해결하고자, 아미노산 알칼리 성분인 알지닌을 첨가하는 실험을 진행하였다. pH 측정 결과 알지닌을 첨가한 #4-2와 #4-4에서 pH가 증가하였으며, 특히 바이오틴 나노리포좀 #4-4에서 pH가 5.
본 연구에서는 용해도가 낮은 수용성 비타민인 바이오틴을 약물전달체의 일종인 나노리포좀을 통해 바이오틴의 용해도를 향상시킴과 동시에 나노리포좀의 안정성을 향상시키는 데 목적을 두고 실험을 진행하였다.
또한 in vitro franz diffusion cell 실험을 통해 바이오틴의 경피흡수율을 평가하였다. 이러한 연구를 통하여 안정한 경피흡수 전달체로서 나노리포좀의 이용가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
Table 3 실험의 바이오틴 함유 나노리포좀에서 바이오틴이 석출되는 문제를 보완하기 위해, pH를 증가시킨 바이오틴 나노리포좀을 제조하였다(Table 4). 리포좀 및 나노리포좀 제조는 Table 1의 실험품 제조와 동일한 조건에서 진행하였다.
각 제조된 나노리포좀을 각각 실온(25 ℃), 냉온(4 ℃), 항온(40 ℃)에서 보관하여 각각 1 일, 1 주일 1 개월 및 3개월 날짜별로 경시변화를 관찰하였다. 경시변화는 리포좀의 투명도, 색상, 분리여부 및 바이오틴의 석출(결정화) 여부를 관찰하였다.
각각의 용액들은 0.45 μm syringe filter로 여과시켜준 후, HPLCsystem에서 바이오틴 함량분석 조건과 동일하게 하여 정량하였다.
각 제조된 나노리포좀을 각각 실온(25 ℃), 냉온(4 ℃), 항온(40 ℃)에서 보관하여 각각 1 일, 1 주일 1 개월 및 3개월 날짜별로 경시변화를 관찰하였다. 경시변화는 리포좀의 투명도, 색상, 분리여부 및 바이오틴의 석출(결정화) 여부를 관찰하였다.
고압유화 조건 선정을 위한 실험으로 나노리포좀의 온도별 제형 안정성 관능평가, 입자크기, PDI 및 제타전위를 측정한 결과, 실험 조건 범위 내에서 고압유화 시 압력 700bar, 처리 횟수 2 회로 결정하여 이후 실험을 진행하였다.
바이오틴 함유 나노리포좀을 제조하기 위하여 예비실험과 동일한 방법으로 리포좀을 제조하였다. 나노리포좀 제형의 안정성을 점검하기 위해, Table 1의 실험과 동일한 고압유화 조건(압력 700 bar, 통과 횟수 2 회)에서 바이오틴함유 및 용매 종류와 농도를 변화시켜 실험하였다(Table 3).
따라서 본 실험에서는 피부를 통한 유효성분 전달의 방법으로 알려진 나노리포좀의 효과 및 이용 가능성을 알아보기 위해 화장품에 사용되는 용해도가 낮은 탈모방지제 성분인 바이오틴을 나노리포좀에 캡슐화 시켜바이오틴의 리포좀에서의 안정성 및 용해도에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 나노리포좀은 구성하고 있는 인지질 및 첨가제, 제조 공정 등에 의해서 특성이 많이 달라지므로, 바이오틴이 리포좀에 잘 캡슐화 되었는지를 확인하기 위하여 dialysis membrane method (DMM)를 이용해 바이오틴에 대한 나노리포좀의 캡슐화율(capsulation efficiency)을 평가하였다. 또한 in vitro franz diffusion cell 실험을 통해 바이오틴의 경피흡수율을 평가하였다.
나노리포좀을 제조하기 위하여 레시틴을 포함하여 콜레스테롤, 부틸렌글라이콜 및 에탄올로 구성되는 유상(oilphase)과 수상(water phase)을 각각 70 ∼ 75 ℃로 가온하여용해시킨 후 수상에 유상을 첨가하면서 호모믹서로 3,000rpm, 10 min 동안 유화시켜 리포좀을 제조하였다.
바이오틴함량 분석을 위해 HPLC 용매로 사용한 메탄올, 정제수, 아세토나이트릴 및 sodium hexanesulfonate는 Sigma-Aldrich(USA) 제품으로 모두 HPLC 급을 사용하였다. 나노리포좀을 제조하기 위하여 호모믹서(T.K. Auto homomixer markⅡ 2.5, Tokushukika, Japan)와 고압유화기(Nanodisperser,NLM1000, Ilshin autoclave, Korea)를 사용하였고, pH 측정을 위해 pH meter (Orion star A111, Thermo scientific, USA)를 사용하였으며, 입자크기, 제타전위 및 다분산지수(polydispersity index, PDI) 측정을 위해 제타사이저(ZetasizerNano ZS system, Malvern Instrument Ltd., UK)를 사용하였다. 리포좀 내 바이오틴 캡슐화율 및 바이오틴을 정량하는데 HPLC (Agilent 1100, Agilent Technologies, USA)를 사용하였다.
나노리포좀의 바이오틴 캡슐화율을 측정하기 위해 DMM을 이용하였다. 나노리포좀(1.
나노리포좀의 형상 관찰은 냉전계 방출 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscope, Tecnai F20 G2,FEI Company, USA)을 사용하여 측정하였다. 시료의 전처리는 cryo system을 이용하였다.
제조된 리포좀을 40 ∼ 45 ℃에서 압력 700 bar, 통과 횟수 2 회조건으로 고압유화 처리하여 나노리포좀을 제조하였다. 나노리포좀의 형성 여부를 확인하기 위하여, 용매 종류와 함량을 달리하여 예비실험을 진행하였다(Table 1).
동결 고정방법에 의해 물리적으로 완전히 고정된 상태의 시료를freeze-fracture/etching system (MED 020 GBE, BALTEC,Pfaffikon ZH, Switzerland)을 통해 시편을 잘라내고 – 90 ℃에서 탈수(etching)시켜 온도를 – 120 ℃를 유지하면서 TEM에서 형상을 관찰하였다[17].
이는 리포좀 내에 캡슐화 되지 않은 바이오틴의 함량으로 볼 수 있다. 두 번째로 dialysismembrane bag을 투과하지 못한 시료에서의 바이오틴 함량과 바이오틴 나노리포좀의 바이오틴 함량을 상대 비교하여 구하였다.
나노리포좀은 구성하고 있는 인지질 및 첨가제, 제조 공정 등에 의해서 특성이 많이 달라지므로, 바이오틴이 리포좀에 잘 캡슐화 되었는지를 확인하기 위하여 dialysis membrane method (DMM)를 이용해 바이오틴에 대한 나노리포좀의 캡슐화율(capsulation efficiency)을 평가하였다. 또한 in vitro franz diffusion cell 실험을 통해 바이오틴의 경피흡수율을 평가하였다. 이러한 연구를 통하여 안정한 경피흡수 전달체로서 나노리포좀의 이용가능성을 알아보고자 하였다.
또한 시간경과에 따른 관찰에서도 에탄올을 용매로 선정한 나노리포좀이 부틸렌글라이콜을 용매로 선정한 나노리포좀에 비해 입자크기 및 제타전위 평가에서 안정한 경향을 보였으며, 이를 통해 이후 나노리포좀 제조 시 에탄올을 용매로 선정하여 실험을 진행하였다.
이 때 온도는 25 ℃로 일정하게 유지되도록하였으며 정확성을 위해 원액을 갖고 측정을 진행하였다. 또한 안정성 확인을 위해 1 일, 1 주일 1 개월 및 3 개월 주기로 측정하였다.
, UK)를 사용하였다. 리포좀 내 바이오틴 캡슐화율 및 바이오틴을 정량하는데 HPLC (Agilent 1100, Agilent Technologies, USA)를 사용하였다.
시료의 전처리는 cryo system을 이용하였다. 먼저, 시료의 동결처리를 위해 jet freezing device (JFD 030, BALTEC, Pfaffikon ZH,Switzerland)을 이용하여 2,100 bar 이상의 고압 상태에서 액화 질소 냉매를 이용하여 급속 동결하였다. 동결 고정방법에 의해 물리적으로 완전히 고정된 상태의 시료를freeze-fracture/etching system (MED 020 GBE, BALTEC,Pfaffikon ZH, Switzerland)을 통해 시편을 잘라내고 – 90 ℃에서 탈수(etching)시켜 온도를 – 120 ℃를 유지하면서 TEM에서 형상을 관찰하였다[17].
바이오틴 나노리포좀의 경피흡수율을 확인하기 위해franz diffusion cell system (FDC-6T, Logan Instrument, USA)을 이용하여 실험을 진행하였다. 본 실험에서는 인공피부(Strat-M membrane, Merck Millipore, USA)을 사용하였으며, 각질층이 위를 향하도록 하여 donor와 receptor phase 사이에 membrane을 고정시켰다.
02%인산) = 15/85로 혼합한 용매를 사용하여 분석하였다. 바이오틴 표준품 및 바이오틴 함유 나노리포좀은 메탄올(0.05%인산) 용매로 희석하여 분석을 진행하였다.
바이오틴 함유 나노리포좀을 제조하기 위하여 예비실험과 동일한 방법으로 리포좀을 제조하였다. 나노리포좀 제형의 안정성을 점검하기 위해, Table 1의 실험과 동일한 고압유화 조건(압력 700 bar, 통과 횟수 2 회)에서 바이오틴함유 및 용매 종류와 농도를 변화시켜 실험하였다(Table 3).
바이오틴이 함유된 나노리포좀에 아미노산 알칼리 성분인 알지닌을 첨가함으로써 바이오틴의 석출현상 감소로물성 측면에서 안정성이 향상되었다. 바이오틴에 알지닌성분이 첨가됨으로써 화학적 안정성이 유지되는지 확인하기 위하여 바이오틴 수용액의 농도별 HPLC 측정과 알지닌 첨가 바이오틴 수용액의 농도별 HPLC 측정을 진행하였다.
바이오틴의 in vitro 경피흡수율 평가에 알지닌을 첨가한바오틴 나노리포좀(#4-4)을 선정하여 2 회 진행하였다. 인공피부를 이용하여 franz diffution cell method를 이용하여 24 h 후에 doner, receptor 및 membrane에서 각각 바이오틴 giafid을 HPLC를 통해 분석하였다.
바이오틴 나노리포좀의 경피흡수율을 확인하기 위해franz diffusion cell system (FDC-6T, Logan Instrument, USA)을 이용하여 실험을 진행하였다. 본 실험에서는 인공피부(Strat-M membrane, Merck Millipore, USA)을 사용하였으며, 각질층이 위를 향하도록 하여 donor와 receptor phase 사이에 membrane을 고정시켰다. receptor chamber에 50% 에탄올을 채웠으며, 실험이 진행되는 동안 항온수조를 통해 온도를 37 ± 1 ℃로 유지하였다.
또한 24 h 후 membrane에 남아있는 바이오틴함량을 측정하기 위해 membrane을 PBS로 3 회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후 receptor phase와 닿지 않은 부분을 잘라낸 후 남은 부분에 대해 가위를 이용해 세절하였다. 세절한 membrane을 10 mL의 50% 에탄올에 넣고 1 h 동안 초음파 세척기를 이용하여 추출 및 처리하여 membrane에 남아있는 바이오틴 함량을 정량하였다.
나노리포좀의 형상 관찰은 냉전계 방출 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscope, Tecnai F20 G2,FEI Company, USA)을 사용하여 측정하였다. 시료의 전처리는 cryo system을 이용하였다. 먼저, 시료의 동결처리를 위해 jet freezing device (JFD 030, BALTEC, Pfaffikon ZH,Switzerland)을 이용하여 2,100 bar 이상의 고압 상태에서 액화 질소 냉매를 이용하여 급속 동결하였다.
안정성 평가는 각각 실온(25 ℃), 냉온(4 ℃), 항온(40℃)에서 진행되어졌으며, 1 일, 1 주일, 1 개월 및 3 개월 주기로 관능평가를 진행하였다. 대부분의 나노리포좀 실험품들(#3, #4)이 시간이 지남에 따라 붉어지는 현상이 나타났으며 탁도 또한 증가하는 경향을 보였다.
45 μm syringe filter로 여과시켜준 후, HPLCsystem에서 바이오틴 함량분석 조건과 동일하게 하여 정량하였다. 이를 통해 캡슐화율을 구하기 위해 첫 번째로 dialysis membrane bag을 투과한 시료에서의 바이오틴 함량과 바이오틴 나노리포좀의 바이오틴 함량을 상대 비교하여 구하였다(Equation 1). 이는 리포좀 내에 캡슐화 되지 않은 바이오틴의 함량으로 볼 수 있다.
바이오틴의 in vitro 경피흡수율 평가에 알지닌을 첨가한바오틴 나노리포좀(#4-4)을 선정하여 2 회 진행하였다. 인공피부를 이용하여 franz diffution cell method를 이용하여 24 h 후에 doner, receptor 및 membrane에서 각각 바이오틴 giafid을 HPLC를 통해 분석하였다. 각각 바이오틴 분석한결과를 다음 Equation 3, 4로부터 바이오틴의 경피흡수율(%)과 회수율(%)을 계산할 수 있다.
제조된 리포좀을 40 ∼ 45 ℃에서 압력 700 bar, 통과 횟수 2 회조건으로 고압유화 처리하여 나노리포좀을 제조하였다.
바이오틴 함량은 HPLC system으로 분석하여 정량하였다. 칼럼은 C18 (150 x 4.6 mm)을 사용하였으며, 검출기는UV 검출기(200 nm)를 사용하여 유속 1.0 mL/min, 오븐 온도는 40 ℃, 이동상으로는 아세토나이트릴/정제수(0.02%인산) = 15/85로 혼합한 용매를 사용하여 분석하였다. 바이오틴 표준품 및 바이오틴 함유 나노리포좀은 메탄올(0.
대상 데이터
나노리포좀의 평균 입자크기와 제타전위 및 PDI 측정을위해 dynamic light scattering 방식을 활용한 제타사이저를 사용하였다. 이 때 온도는 25 ℃로 일정하게 유지되도록하였으며 정확성을 위해 원액을 갖고 측정을 진행하였다.
, Korea)에서 제조한 것을(< 3μS/cm) 사용하였다. 바이오틴(Biotin, Sigma-Aldrich, USA)은 순도 99% 이상의 HPLC 급으로 사용하였다. 바이오틴함량 분석을 위해 HPLC 용매로 사용한 메탄올, 정제수, 아세토나이트릴 및 sodium hexanesulfonate는 Sigma-Aldrich(USA) 제품으로 모두 HPLC 급을 사용하였다.
바이오틴(Biotin, Sigma-Aldrich, USA)은 순도 99% 이상의 HPLC 급으로 사용하였다. 바이오틴함량 분석을 위해 HPLC 용매로 사용한 메탄올, 정제수, 아세토나이트릴 및 sodium hexanesulfonate는 Sigma-Aldrich(USA) 제품으로 모두 HPLC 급을 사용하였다. 나노리포좀을 제조하기 위하여 호모믹서(T.
본 실험에서 리포좀 제조를 위하여 레시틴(Lipoid S75-3, Lipoid, Germany)과 콜레스테롤(Cholesterol JP, NipponFine Chemical Co., LTD, Japan)을 사용하였으며, pH를 조절하기 위해서 알지닌(L-arginine, Ajinomoto, Japan)을 사용하였다. 용매로 부틸렌글라이콜(1,3-Butylene glycol, Daicel,Japan)과 일반적으로 화장품에서 사용하는 에탄올(Ethylalcohol, Daejung, Korea)을 사용하였으며, 방부제로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol, Galuxy, India), 정제수는 증류수 제조기(Pure RO 130, Human Co.
용매로 부틸렌글라이콜(1,3-Butylene glycol, Daicel,Japan)과 일반적으로 화장품에서 사용하는 에탄올(Ethylalcohol, Daejung, Korea)을 사용하였으며, 방부제로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol, Galuxy, India), 정제수는 증류수 제조기(Pure RO 130, Human Co., Korea)에서 제조한 것을(< 3μS/cm) 사용하였다.
DMM을 통해 바이오틴 나노리포좀에 대한 캡슐화율을 측정한 결과 알지닌을 첨가하지 않은 바이오틴 나노리포좀에 비해 알지닌을 첨가한 바이오틴 나노리포좀에서의 바이오틴 캡슐화율이 약 5배 증가한 것을 알 수 있었다.
Franz diffusion cell method를 통해 바이오틴 나노리포좀(#4-4)의 경피흡수율을 측정한 결과, 24 h 경과 후 receptorphase에서 바이오틴이 32.50 ㎍ 검출되었으며, 반면에membrane에서의 잔존 바이오틴 함량을 측정한 결과 바이오틴이 검출되지 않았다. 이를 통해 바이오틴 나노리포좀의 경피흡수율이 34.
PDI의 경우도 고압유화기의 압력이 높고, 처리 횟수가 많을수록 전체적으로 감소하는 경향을 보였다. 입자크기와는 달리, 낮은 압력에서는 처리 횟수가 1에서 2로 증가 시초기 PDI 값의 감소폭이 없으나(#2-1, #2-2), 압력이 상대적으로 큰 경우는 처리 횟수 증가 시 초기 PDI 값의 감소폭이 좀 더 크게 나타났다(#2-3, #2-4 / #2-5, #2-6).
바이오틴 나노리포좀 제조 시 바이오틴이 석출되는 문제점을 해결하고자, 아미노산 알칼리 성분인 알지닌을 첨가하는 실험을 진행하였다. pH 측정 결과 알지닌을 첨가한 #4-2와 #4-4에서 pH가 증가하였으며, 특히 바이오틴 나노리포좀 #4-4에서 pH가 5.62으로 바이오틴을 첨가하였음에도 불구하고 실온, 3 개월까지도 관능평가에서 바이오틴을 첨가하지 않은 나노리포좀과 같이 석출현상이 나타타지 않았다. 또한 알지닌 첨가로 pH를 상승시킨 나노리포좀에서는 시간이 지남에 따라 붉어지는 현상도 나타나지 않았다.
관능평가 1 주일 후, 바이오틴을 함유하지 않은 나노리포좀 #1은 모두 석출/침전 현상이 일어나지 않았지만(datanot shown), 바이오틴을 첨가한 나노리포좀 #3에서는 모두 석출 현상이 나타났다. 이를 통해 바이오틴이 나노리포좀내에서 용매에 상관없이 석출되는 문제점이 있음을 확인하였다.
관능평가 및 pH 측정에서 pH를 증가시킨 바이오틴 나노리포좀이 그렇지 않은 바이오틴 나노리포좀에 비해 안정성 면에서 유리함을 확인하였다. 바이오틴에 알지닌 첨가에 의한 염 생성으로 용해도가 증가함으로써 바이오틴이 석출되지 않았다.
그러나 실온 보관, 1 주일 후 관능평가에서 4 개 실험품(#3)에서 모두 바이오틴이 석출되는 현상이 나타났다. 나노리포좀의 pH는 4.
나노리포좀에 바이오틴 0.1%를 함유하는 경우, 바이오틴의 용해도에 영향을 줄 수 있는 용매의 함량과 종류와 상관없이 모두 바이오틴이 석출되는 현상이 나타났다. 바이오틴의 용해도를 향상시키고자 아미노산 알칼리인 알지닌을 첨가하는 경우에 나노리포좀에서 바이오틴이 석출되는 현상이 나타나지 않았으며, 상대적으로 입자크기도 작고 시간이 지남에 따라 붉어지는 현상도 나타나지 않았다.
나노리포좀의 pH는 4.0 ∼ 5.0 정도로 이전 실험품들에 비해 현저하게 pH가 낮음을 확인할 수 있었다.
나노리포좀의 입자크기 및 제타전위를 제타사이저를 통해 측정한 결과, 제조에 사용된 용매에 따라 입자크기 및제타전위가 다른 것을 확인할 수 있었으며, 이중 용매를에탄올로 사용한 제형이 부틸렌글라이콜을 사용한 제형보다 입자크기가 상대적으로 작았으며 제타전위 절대값이 커, 상대적으로 입자간의 정전기적 반발력(electrostatic repulsiveforce)의 커서 리포좀 입자의 분산 안정성이 좀 더 큰 것으로 나타났다(data not shown).
따라서 나노리포좀 제조 조건(압력 700 bar, 처리 횟수 2회)에서 바이오틴 0.1%와 알지닌 0.06% 함유한 나노리포좀(#4-4)은 시간별 제형 안정성 관능평가, 입자크기, 제타전위의 종합적 평가에서 상대적으로 안정한 것으로 판단되었다[9].
또한 cryo-TEM 이미지 측정으로 나노리포좀의 크기는 100 ∼ 150 nm 정도로100 ∼ 1000 nm의 LUV에서 작은 범위의 ULV 형태의 나노리포좀을 형성하는 것으로 확인하였다.
또한 바이오틴을 캡슐화시킨 나노리포좀의 경우 리포좀 내부와 외부 모두 침상 형상의 바이오틴이 결정 상태로 석출된 것을 확인할 수 있었으며, 반면에 알지닌을 첨가한바이오틴 나노리포좀은 바이오틴의 결정상태가 거의 나타나지 않았음을 확인할 수 있다. 이를 통해 알지닌을 첨가하여 바이오틴의 용해도를 증가시킨 바이오틴 나노리포좀이 그렇지 않은 바이오틴 나노리포좀에 비하여 바이오틴의 석출 현상 없이 안정하다는 것을 확인할 수 있었다(Figure 8).
0 정도로 이전 실험품들에 비해 현저하게 pH가 낮음을 확인할 수 있었다. 바이오틴 성분이 나노리포좀 내에서 용해도 감소로 인해 상대적으로 석출되는 속도의 증가로 결국 1 주일 후 바이오틴이 석출된것으로 나타났다. 이러한 현상은 냉온 및 항온 실험품에서도 동일하게 관찰되었다.
바이오틴 함유 나노리포좀이 약물전달체로서의 기능을 확인하고자, franz diffusion cell method를 통하여 인공피부에 대한 경피흡수 실험에서 24 h 후 경피흡수율이 32.31%로 측정되었다.
바이오틴을 첨가한 나노리포좀에서 상대적으로 에탄올을 용매로 선정한 나노리포좀이 부틸렌글라이콜을 용매로 선정한 나노리포좀보다 온도에 따른 시간별 제형 안정성관능평가, 입자크기 및 제타전위에서 좀 더 양호하게 평가되었다(data not shown).
1%를 함유하는 경우, 바이오틴의 용해도에 영향을 줄 수 있는 용매의 함량과 종류와 상관없이 모두 바이오틴이 석출되는 현상이 나타났다. 바이오틴의 용해도를 향상시키고자 아미노산 알칼리인 알지닌을 첨가하는 경우에 나노리포좀에서 바이오틴이 석출되는 현상이 나타나지 않았으며, 상대적으로 입자크기도 작고 시간이 지남에 따라 붉어지는 현상도 나타나지 않았다.
바이오틴이 함유된 나노리포좀에 아미노산 알칼리 성분인 알지닌을 첨가함으로써 바이오틴의 석출현상 감소로물성 측면에서 안정성이 향상되었다. 바이오틴에 알지닌성분이 첨가됨으로써 화학적 안정성이 유지되는지 확인하기 위하여 바이오틴 수용액의 농도별 HPLC 측정과 알지닌 첨가 바이오틴 수용액의 농도별 HPLC 측정을 진행하였다.
본 연구를 통해 용해도가 낮은 바이오틴 성분에 대하여 약물전달체로서 제조한 바이오틴 나노리포좀은 물리적으로 안정하며, 캡슐화율의 증가, 높은 경피흡수율을 보였다. 추후 다양한 유효성 평가를 진행하여 화장품에 적용할 수 있는 우수한 제형으로 이용이 가능할 것으로 기대된다.
제타전위의 절대 값이 클수록 콜로이드 입자간의 반발력이 커져 콜로이드 상태가 안정한 것으로 알려져 있다[7]. 본 연구의 실험 범위에서 측정한 제타전위 값은 고압유화기의 압력과 처리 횟수에 따라 증가 및 감소 경향을보이지는 않았다. 또한 시간경과에 따라서도 절대 값이 감소하기도 하며 오히려 증가하기도 하는 오차가 포함된 것으로 사료된다.
시간경과에 따라 PDI는 오히려 감소하는 것으로 나타났으며, PDI는 0.2 ∼ 0.5 범위로 측정되었다(Figure 4).
실험 결과, 바이오틴 수용액의 HPLC 분석 결과와 알지닌 첨가 바이오틴의 HPLC 분석 결과가 유사한 결과값을 나타내었으나, 알지닌을 첨가하는 경우 바이오틴 함량이 약 12∼14% 정도 감소하는 것으로 측정되었다(Table 6).
이를 통해 알지닌을 첨가한 바이오틴 나노리포좀이 첨가하지 않은 바이오틴 나노리포좀에 비하여 바이오틴 캡슐화율이 약 5 배 정도 증가하였음을 확인할 수 있었다. 알지닌 첨가에 따라 바이오틴의 석출 현상 없이 용해도 증가가 바이오틴 나노리포좀을 제조하는 데에 있어 물리적 안정성뿐만 아니라 바이오틴의 캡슐화율을 향상시키는 것으로 나타났다.
또한 알지닌 첨가로 pH를 상승시킨 나노리포좀에서는 시간이 지남에 따라 붉어지는 현상도 나타나지 않았다. 알지닌은 바이오틴과의 결합으로 바이오틴의 용해도를 증가시킴과 동시에 레시틴 성분에도 영향을 주는 것으로 사료되었다. 이는 알지닌 외에 다른 알칼리 사용하여 pH를 조절하여도 유사한 결과가 나타날 것으로 기대된다.
그러나 바이오틴이 첨가된 나노리포좀 #4-4에서는 석출현상이 나타나지 않았으며, 나노리포좀 #3 및 나노리포좀 #4-3보다 투명함을 보였다(Figures 1, 2). 이는 나노리포좀#4 실험을 통해 알지닌을 첨가하여 pH를 증가시킬 경우,나노리포좀 내의 바이오틴 석출 현상뿐만 아니라 나노리포좀에서 붉어지는 현상(discoloration)이 완화되어 리포좀의 안정성을 향상시켜준다는 것을 확인할 수 있었다(Table 5).
50 ㎍ 검출되었으며, 반면에membrane에서의 잔존 바이오틴 함량을 측정한 결과 바이오틴이 검출되지 않았다. 이를 통해 바이오틴 나노리포좀의 경피흡수율이 34.11%로 확인되었다(Equation 3). 또한회수율은 87.
관능평가 1 주일 후, 바이오틴을 함유하지 않은 나노리포좀 #1은 모두 석출/침전 현상이 일어나지 않았지만(datanot shown), 바이오틴을 첨가한 나노리포좀 #3에서는 모두 석출 현상이 나타났다. 이를 통해 바이오틴이 나노리포좀내에서 용매에 상관없이 석출되는 문제점이 있음을 확인하였다.
바이오틴 나노리포좀의 형상을 관찰하기 위하여 Cryo-TEM을 측정한 결과, 입자크기 100 ∼ 150 nm 정도로 제타사이저로 측정한 입자크기와 유사하였으며, ULV 형태를 띠는 것을 확인할 수 있었다[13]. 이를 통해 실험에서 진행된 제조방법을 통해 양호한 나노리포좀을 제조할 수 있음을 확인하였다.
또한 바이오틴을 캡슐화시킨 나노리포좀의 경우 리포좀 내부와 외부 모두 침상 형상의 바이오틴이 결정 상태로 석출된 것을 확인할 수 있었으며, 반면에 알지닌을 첨가한바이오틴 나노리포좀은 바이오틴의 결정상태가 거의 나타나지 않았음을 확인할 수 있다. 이를 통해 알지닌을 첨가하여 바이오틴의 용해도를 증가시킨 바이오틴 나노리포좀이 그렇지 않은 바이오틴 나노리포좀에 비하여 바이오틴의 석출 현상 없이 안정하다는 것을 확인할 수 있었다(Figure 8).
이를 통해 알지닌을 첨가한 바이오틴 나노리포좀이 첨가하지 않은 바이오틴 나노리포좀에 비하여 바이오틴 캡슐화율이 약 5 배 정도 증가하였음을 확인할 수 있었다. 알지닌 첨가에 따라 바이오틴의 석출 현상 없이 용해도 증가가 바이오틴 나노리포좀을 제조하는 데에 있어 물리적 안정성뿐만 아니라 바이오틴의 캡슐화율을 향상시키는 것으로 나타났다.
후속연구
본 연구를 통해 용해도가 낮은 바이오틴 성분에 대하여 약물전달체로서 제조한 바이오틴 나노리포좀은 물리적으로 안정하며, 캡슐화율의 증가, 높은 경피흡수율을 보였다. 추후 다양한 유효성 평가를 진행하여 화장품에 적용할 수 있는 우수한 제형으로 이용이 가능할 것으로 기대된다.
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