[논문]어류 병원성 세균의 MIC 결정을 위한 MIC Panel의 최적화 배양 조건 확립

김예지; 전려진; 강미래; 이다원; 우수지; 김명석; 정준범

doi:10.5657/kfas.2020.0443

어류 병원성 세균의 MIC 결정을 위한 MIC Panel의 최적화 배양 조건 확립
Establishing of Optimal Culture Conditions for MIC Panels for MIC Determination of Fish Bacterial Pathogens 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.53 no.3, 2020년, pp.443 - 450

김예지 (제주대학교 해양생명과학과) , 전려진 (제주대학교 해양생명과학과) , 강미래 (제주대학교 해양생명과학과) , 이다원 (제주대학교 해양생명과학과) , 우수지 (국립수산과학원 병리연구과) , 김명석 (국립수산과학원 병리연구과) , 정준범 (제주대학교 해양생명과학과)

Abstract ▼ AI-Helper

No established method can be used to select effective antibiotics in antibiotic susceptibility tests for fish bacterial pathogens quickly and accurately. Here, we established the optimal conditions for determining the minimal inhibitory concentration (MIC) of major fish bacterial pathogens (Streptococcus spp., Edwardsiella tarda, Vibrio spp., Aeromonas spp., and Pseudomonas spp.) using the KRAQ1 and CAMPY2 panels. The MIC panel used 18 antibiotics of two types and we conducted experiments to establish the optimal culture medium and temperature for each species. The optimal conditions for incubating Streptococcus spp. were in cation-adjusted Mueller-Hinton broth with TES buffer (CAMHBT) at 28℃, using 5% lysed horse blood (LHB) as recommended by the Clinical Laboratory Standards Institute. For Vibrio spp., the optimal culture conditions were 28℃ in CAMHBT supplemented with 1% NaCl. The optimal conditions for culturing E. tarda, Aeromonas spp., and Pseudomonas spp. were in CAMHBT at 28℃.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. Range of concentrations used for minimal inhibitory concentration (MIC) determination by sensititre panels
표 Table 2. Culture conditions and medium for representative bacterial species
표 Table 3. List of bacterial strains used in this study
표 Table 4. Optimized culture conditions of MIC panel for representative bacterial species
표 Table 5. MIC results for representative fish pathogenic bacteria in optimized culture conditions of the KRAQ1 panel determined in this study
표 Table 6. MIC results for representative fish pathogenic bacteria in optimized culture conditions of the CAMPY2 panel determined in this study

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 수산용 항생제들이 96 well plate에 coating된 SensititreTM KRAQ1, CAMPY2 panel (TREK Diagnostic system, East Grinstead, UK)을 이용하여, 어류에서 분리한 세균 종에 대한 MIC 분석을 실시하고 효율적인 항생제 감수성 검사를 위한 최적화 조건을 확립하고자 하였다.
현재로서는 어병세균에 대한 정확한 배양조건에 대한 정보가 부족한 실정이며, 본 연구에서는 최대한 많은 세균에 동일한 조건이 적용될 수 있는 범위에서 실험을 진행하여 조건이 설정된 후에도 실험이 간편하게 진행될 수 있도록 최적화 배양 조건을 확립하고자 하였다.

제안 방법

1% NaCl이 첨가된 tryptic soy agar (TSA, Difco, Detroit, MI, USA)에서 순수 배양된 세균의 colony를 멸균 loop를 이용하여 3-5개를 취한 후, 1% NaCl이 첨가된 distilled water에 희석하여 0.5 McFarland (1.5×108 CFU/mL)가 되도록 SensititerTM Nephelometer (TREK Diagnostic system, Cleveland, OH)로 농도를 맞추었다.
PCR을 위한 template DNA는 HigeneTM Genomic DNA prep kit (BIOFACT, Daejeon, Korea)를 사용하여 분리하였다.
tarda 균주의 구분을 위해 선택배지인 SS 배지에서 검은색 집락을 형성하는 것으로 규정하였고, Vibrio spp. 균주는 구분을 위해 비브리오 선택배지인 TCBS 상에서 초록색 또는 노란색 집락을 형성한 것으로 규정하였다. 실험균은 보존을 위해 20% glycerol (Sigma, St.
균주는 온도 설정 조건에 대해서만 실험을 진행하였으며, 22°C, 28°C 및 35°C 모두에서 유사한 값을 확인할 수 있었으나, 가장 명확한 bottom을 나타낸 것은 28°C에서 배양한 panel이었다.
농도를 맞춘 균액은 최적화 조건 확립을 위해 균종별로 설정한 조건에 맞춰 각각의 broth배지에 100 μL씩 넣었다(Table 2).
는 1% NaCl을 첨가한 CAMHBT 배지를 이용하여 실험을 실시하고 28°C에서 panel을 배양하는 것으로 최적화 조건을 설정하였다.
는 CAMHBT 배지를 이용하여 KRAQ1 panel과 CAMPY2 panel에 접종하고 28°C에서 24시간 배양하여 결과를 확인하는 것으로 최적화 조건을 설정하였다.
배양된 panel을 SensititerTM Manual Viewbox를 이용하여 육안으로 관찰하였을 때, 충분한 성장저해가 일어나 투명한 상태로 남아 있는 well 중 가장 적은 양의 항생제를 포함하는 well의 항생제 농도를 최소억제농도(MIC)로 결정하였다.
세균은 2%의 NaCl이 첨가된 tryptic soy broth (TSB, Difco, Detroit, MI, USA) 배지상에서 증식되었으며, 균의 구분을 위해 선택배지인 thiosulfate citrate bile salts sucrose (TCBS) agar (Difco, Detroit, MI, USA), Salmonella Shigella (SS) agar (MB cell, Seoul, Korea)와 감별배지인 blood agar (KOMED, Seongnam, Korea)에 도말하고, 27°C에서 18-24시간 배양하여 균의 집락 형성 및 형태를 확인하였다.
의 경우, CLSI에서 제시한 기준에 따라 5%의 lysed horse blood (LHB)가 첨가된 cation-adjusted Mueller-Hinton broth with TES buffer (CAMHBT) 배지에 1% NaCl의 첨가 유무를 다르게 하여 실험을 진행하였고, MHB 배지에서 배양했을 때 MIC 값의 차이점을 확인하고자 하였다.

데이터처리

본 연구를 통하여 확립한 배양 조건을 검증하기 위하여, MIC panel의 실험에 사용한 균주 중 S. parauberis 3균주와 E. tarda 3균주를 disk diffusion test로 실험을 실시한 후 비교 분석하였다.

이론/모형

MIC panel을 이용한 항생제 감수성 검사 방법은 국립수산과학원 병리연구과에서 설계하였고, Thermo사에서 제작한 KRAQ1 panel의 oxytetracycline, ceftiofur, flumequine, enrofloxacin, neomycin, ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, doxycycline, trimethoprim/sulfamethoxazole 및 sulfisoxazole 10종과 CAMPY2 panel의 azithromycin, ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, florfenicol, gentamicin, nalidixic acid 및 tetracycline 8종을 사용하였다(Table 1).
세균 동정을 위한 PCR 방법은 이전의 연구논문을 참고하여 수행하였다(Woo et al., 2006; Demircan and Candan, 2006; Sakai et al., 2007; Kim et al., 2014; Kim et al., 2015).
세부적인 균 동정은 polymerase chain reaction (PCR) 방법을 통해 확인하였다.

성능/효과

MIC panel을 사용한 분석에서는 결과를 명확하게 확인할 수 있었고 다른 조건에 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
5균주 모두에 대한 MIC 값을 분석한 결과, 5% LHB를 첨가하고 28°C에서 배양하는 것이 가장 최적화 조건인 것으로 확인되었으며, 이는 CLSI에서 권고하는 사항과 동일하다.
E. tarda 균주는 선택배지인 SS 배지 상에서 검은색 집락이 형성되었으며, 정확한 동정을 위한 PCR 결과에서도 동일한 결과가 나타났다.
S. parauberis-3 균주의 doxycycline 결과를 확인하면, 5% LHB를 첨가하고 28°C에서 배양한 panel에서는 MIC 값이 16 μg/mL로 명확하게 나타났다.
그 결과, 균의 농도를 정확하게 맞추어 실험이 진행되는 MIC panel과 비교하여 disk diffusion test 방법은 세균의 종류에 따라 균이 평판배지에서 성장하는 속도가 다르게 나타나 생성되는 저지대에 차이를 보이는 경우가 있었다(data not shown).
그러므로, 35°C의 배양 조건을 제외시켰으며, 1% NaCl 첨가 유무와 22°C, 28°C의 조건에서 측정된 MIC 값을 비교한 결과, 1% NaCl이 첨가된 결과에서는 특정 항생제에 상이한 값이 확인되는 경우도 있었으며, 22°C에 배양한 panel은 세균의 탁도가 명확하지 않아 적절한 조건이 아닌 것으로 확인되었다.
는 6가지 조건을 달리하여 실험을 실시하였으며, 모든 조건에서 유사한 MIC 값을 나타내었지만, A. sobria는 35°C에서 배양한 panel에서는 세균이 배양되지 않았다.
는 1% NaCl을 첨가한 조건의 panel에서 bottom이 더 명확하게 나타났으며, 염분에 민감한 Vibrio spp.는 CLSI에서 권고한 1% NaCl이 들어간 CAMHBT 배지를 이용하는 것이 MIC 값 분석에 가장 적절한 것으로 확인되었다. 온도 설정 실험에서는 Vibrio sp.
주요 어병세균 25균주를 대상으로 18종 수산용 항생제에 대한 다양한 환경 조건하에서의 실험결과를 비교한 결과, 각 균종에 대한 MIC panel의 최적화 배양 조건을 결정할 수 있었다(Table 4). S.

후속연구

그리고, 세균성 질병의 치료를 위한 항생제 선정과 항생제 내성 연구를 위해 동일한 방법의 검사가 필요하며, 다양한 검사 능력을 갖고 있는 검사자 혹은 연구자가 쉽게 이해하고 실행할 수 있는 검사법의 설정이 필요하기 때문에 본 연구에서의 항생제 panel을 이용한 액체 배지 희석법은 항생제 내성 검사를 위한 표준화된 방법으로 제시될 수 있다.
또한, 신속하고 정확한 결과를 제공할 수 있으므로, 양식현장에 더욱 효율적인 분석방법이 될 수 있을 것이다.
그리고, 세균성 질병의 치료를 위한 항생제 선정과 항생제 내성 연구를 위해 동일한 방법의 검사가 필요하며, 다양한 검사 능력을 갖고 있는 검사자 혹은 연구자가 쉽게 이해하고 실행할 수 있는 검사법의 설정이 필요하기 때문에 본 연구에서의 항생제 panel을 이용한 액체 배지 희석법은 항생제 내성 검사를 위한 표준화된 방법으로 제시될 수 있다. 본 연구에서 확립한 최적화된 조건을 사용하여 많은 균주를 대상으로 신속하고 정확한 MIC값을 분석하고 내성균에 대한 정보를 축적함으로써, 향후 수산생물 병원성 세균에 대한 항생제 내성 판정을 위한 기준 설정이 가능할 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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