임상 검체에서 분리된 65개의 사상형 진균을 대상으로 연구하였다. 이 균주들은 형태학적으로 동정이 불가능한 진균, 형태학적으로 유사하여 동정이 까다로운 균주, 종(species) 수준의 동정이 요구되는 균종들이다. PCR과 염기서열분석은 ITS. DiD2, 그리고 β-tubulin 유전자를 표적 부위로 하였고, 증폭된 염기서열은 상동성 분석을 위하여 GenBank 데이터베이스의 알고리즘을 이용하여 분석하였다. 형태학적으로 속 수준의 동정이 가능한 진균은 61.5%이었고, 65주의 염기서열분석으로 62 균주는 속과 종의 동정이 가능하였다. 형태학적 검사와 염기서열분석의 결과, 속과 종이 불일치한 경우 14주(21.5%)이었고, 형태학적으로 동정이 불가능하였던 사례는 11 균주이었다. B. dermatitidis, T. marneffei, 그리고 G. argillacea 등은 염기서열분석으로 국내에서 처음으로 확인하였다. Aspergillus와 같이 흔히 분리되고 성장이 빠른 진균들의 경우에는 형태학적인 검사가 보고시간과 비용 면에서는 매우 유용한 방법이다. 분자유전학적인 검사 방법은 비용과 임상적 중요성 등을 고려하여야 하지만 분자유전학적 검사를 병행하여 신속하고 정확한 결과를 제공할 수 있다.
임상 검체에서 분리된 65개의 사상형 진균을 대상으로 연구하였다. 이 균주들은 형태학적으로 동정이 불가능한 진균, 형태학적으로 유사하여 동정이 까다로운 균주, 종(species) 수준의 동정이 요구되는 균종들이다. PCR과 염기서열분석은 ITS. DiD2, 그리고 β-tubulin 유전자를 표적 부위로 하였고, 증폭된 염기서열은 상동성 분석을 위하여 GenBank 데이터베이스의 알고리즘을 이용하여 분석하였다. 형태학적으로 속 수준의 동정이 가능한 진균은 61.5%이었고, 65주의 염기서열분석으로 62 균주는 속과 종의 동정이 가능하였다. 형태학적 검사와 염기서열분석의 결과, 속과 종이 불일치한 경우 14주(21.5%)이었고, 형태학적으로 동정이 불가능하였던 사례는 11 균주이었다. B. dermatitidis, T. marneffei, 그리고 G. argillacea 등은 염기서열분석으로 국내에서 처음으로 확인하였다. Aspergillus와 같이 흔히 분리되고 성장이 빠른 진균들의 경우에는 형태학적인 검사가 보고시간과 비용 면에서는 매우 유용한 방법이다. 분자유전학적인 검사 방법은 비용과 임상적 중요성 등을 고려하여야 하지만 분자유전학적 검사를 병행하여 신속하고 정확한 결과를 제공할 수 있다.
Sixty-five molds isolated from clinical specimens were included in this study. All the isolates were molds that could be identified morphologically, strains that are difficult to identify because of morphological similarities, and strains that require species-level identification. PCR and direct seq...
Sixty-five molds isolated from clinical specimens were included in this study. All the isolates were molds that could be identified morphologically, strains that are difficult to identify because of morphological similarities, and strains that require species-level identification. PCR and direct sequencing were performed to target the internal transcribed spacer (ITS) region, the D1/D2 region, and the β-tubulin gene. Comparative sequence analysis using the GenBank database was performed using the basic local alignment search tool (BLAST) algorithm. The fungi identified morphologically to the genus level were 67%. Sequencing analysis was performed on 62 genera and species level of the 65 strains. Discrepancies were 14 (21.5%) of the 65 strains between the results of phenotypic and molecular identification. B. dermatitidis, T. marneffei, and G. argillacea were identified for the first time in Korea using the DNA sequencing method. Morphological identification is a very useful method in terms of the reporting time and costs in cases of frequently isolated and rapid growth, such as Aspergillus. When molecular methods are employed, the cost and clinical significance should be considered. On the other hand, the molecular identification of molds can provide fast and accurate results.
Sixty-five molds isolated from clinical specimens were included in this study. All the isolates were molds that could be identified morphologically, strains that are difficult to identify because of morphological similarities, and strains that require species-level identification. PCR and direct sequencing were performed to target the internal transcribed spacer (ITS) region, the D1/D2 region, and the β-tubulin gene. Comparative sequence analysis using the GenBank database was performed using the basic local alignment search tool (BLAST) algorithm. The fungi identified morphologically to the genus level were 67%. Sequencing analysis was performed on 62 genera and species level of the 65 strains. Discrepancies were 14 (21.5%) of the 65 strains between the results of phenotypic and molecular identification. B. dermatitidis, T. marneffei, and G. argillacea were identified for the first time in Korea using the DNA sequencing method. Morphological identification is a very useful method in terms of the reporting time and costs in cases of frequently isolated and rapid growth, such as Aspergillus. When molecular methods are employed, the cost and clinical significance should be considered. On the other hand, the molecular identification of molds can provide fast and accurate results.
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문제 정의
본 연구는 임상 검체에서 분리되는 진균의 형태학적 동정 결과를 기준으로, 염기서열 분석결과와 비교하여 보고하고자 한다.
제안 방법
2008년 1월 1일부터 2012년 12월까지 5년 동안 서울에 위치한 종합병원에서 임상검체로부터 분리된 효모균과 피부사상균을 제외한 사상형 진균을 대상으로 형태학적 분석 대상 균주 가운데 동정이 불가능한 진균, 형태학적으로 유사하여 동정이 까다로운 균주, 그리고 종(species) 수준까지 동정이 요구되는 65주를 대상으로 분자생물학적 염기서열 분석을 하였다(Table 1).
DiD2, 그리고 β-tubulin 유전자를 표적 부위로 하였고, 증폭된 염기서열은 상동성 분석을 위하여 GenBank 데이터베이스의 알고리즘을 이용하여 분석하였다.
Genomic DNA의 PCR과 염기서열 분석은 유전자 분석의 전문 기관(Macrogen Inc., Seoul, Korea)에 의뢰 하였고, 염기서열 분석의 raw data를 받아 염기서열 상동성 분석을 위한 데이터베이스로는 GenBank의 BLAST 알고리즘을 이용하여 동정하였다.
S병원에서의 염기서열 분석을 위한 진균의 DNA 분리는 MagNA pure LC Total nucleic acid isolation kit로 전 처리한 검체를 magnetic-bead technology 원리를 이용한 MagNA pure LC 1.0 (Roche Diagnotics, Tokyo, Japan)장비를 이용하여 buffer에 반응시켜 용해시킨 후, magnetic glass particles 표면에 DNA를 부착시키고 세척 과정을 거쳐 순수 DNA를 분리하였다.
본 연구는 진균검사의 형태학적인 문제점들을 분석하고 해결 하기 위하여 진균의 염기서열분석에 대한 CLSI 가이드라인 MM18-A가 2008년에 제시되어[6], 그 기준에 따라 염기서열분석검사 방법을 도입하여, 전통적인 진균의 동정 방법인 형태학적 동정 결과와 사상균의 동정을 분자생물학적 방법인 염기서열 분석을 하여 비교하였다.
사상균의 형태학적인 동정은 증식 속도와 색깔, 질감, 그리고 형태 등을 관찰하고, 충분히 성숙된 것으로 확인되면 셀로판테이프를 이용하여 도말 슬라이드를 만들어 lactopheol cotton blue (LPCB)로 염색하여 광학현미경으로 균사(hyphae)와 분생포자(conidia)의 모양과 배열의 특성을 종합하여 참고 서적을 참고하여 동정하였다. 현미경적 소견에서 두형태 곰팡이(dimorphic fungus)가 의심이 되는 경우, 추가로 brain heart infusion (BHI) 배지에 접종하여 배양하였다.
정확한 균종을 감별하기 위하여 ITS와 D1/D2 rDNA에 대한 염기서열 분석을 하여 99%와 100%의 상동성을 보여 B. dermatitidis로 최종 확인하였고, 효모형을 확인하기 위하여 brain heart infusion(BHI) 배지에 35°C에서 배양하여 12일 만에 효모양 집락을 얻어, 분아하는 효모세포를 확인하였다[1, 15].
증폭의 표적부위로는 진균의 염기서열 분석을 통한 동정에 가장 널리 이용되는 rRNA operon 내의 internal transcribed spacer (ITS) 부위와 28S rRNA 소단위 일부인 약 600 bp 크기의 D1/D2 부위, 그리고 단백질을 형성하는 기능적 유전자인 β-tubulin을 선택하였다[6].
진균배양은 검체가 검사실로 의뢰되면 Sabouraud dextrose agar (SDA, Hanil Komed Co., Korea)에 접종하여 30°C에서 3일간 배양하고 검체에 따라 무균검체는 실온(23∼26°C)에서 3주간, 오염된 비뇨생식기, 호흡기, 그리고 소화기 검체는 실온에서 10일간, 피부과에서 의뢰되는 검체는 MYCO-B agar plate (SDA with chloramphenicol and cycloheximide, Hanil Komed Co., Korea)와 SDA에 접종하여 실온에서 3주 동안 배양하였다.
대상 데이터
K연구소에서의 DNA 분리는 I-genomic BYF DNA mini kit for fungi (iNtRON Inc., Seongnam, Korea)를 이용하였다. PCR은 thermal cycler (Model 9700; Applied Biosystem, USA)를 이용하였고, 증폭된 산물의 염기서열 분석은 BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystem)와 API Prism 3100 genetic analyzer(Applied Biosystems)을 이용하였다.
분자유전학적 검사는 서울 소재 S병원과 대전 소재 의진균자원은행 연구소(K연구소)에서 시행하였다. S병원에서 시행한 검사는 형태학적으로 동정이 불가능하거나 형태학적으로 유사하여 동정이 까다로운 균주를 대상으로 시행하였고, K연구소에서는 S병원에서 제공한 균주를 대상으로 형태학적으로 확인된 균주를 종(species) 수준까지 동정을 염기서열분석 방법으로 시행하였다.
임상 검체에서 분리된 65개의 사상형 진균을 대상으로 연구하였다. 이 균주들은 형태학적으로 동정이 불가능한 진균, 형태학적으로 유사하여 동정이 까다로운 균주, 종(species) 수준의 동정이 요구되는 균종들이다.
이론/모형
종과 속의 동정에 관한 기준으로는 기존의 논문들에서 사용하였던 기준을 이용하였다[7, 8]. 한 종의 염기서열을 분석한 결과가 가장 높은 염기서열의 상동성이 98% 이상이고, 그 다음으로 일치하는 것과 0.
증폭의 표적부위로는 진균의 염기서열 분석을 통한 동정에 가장 널리 이용되는 rRNA operon 내의 internal transcribed spacer (ITS) 부위와 28S rRNA 소단위 일부인 약 600 bp 크기의 D1/D2 부위, 그리고 단백질을 형성하는 기능적 유전자인 β-tubulin을 선택하였다[6]. 증폭된 염기서열은 상동성 분석을 위하여 GenBank 데이터베이스의 basic local alignment search tool (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 알고리즘을 이용하여 분석하였다.
성능/효과
Phialophora spp. 2주는 모두 동정불가 흑색진균으로 보고하였던 균종으로 분자유전학적 동정 결과 P. europaea와 P. olivacea로 속과 종이 모두 밝혀졌다. 흑색 진균 가운데 Exophiala spp.
염기서열분석 결과 10 주는 ITS에서 상동성이 98∼100%를 나타냈고, 5주는 D1D2에서 99∼100%의 상동성을 보였다. ITS 유전자에서 동정된 균주는 A. fumigatus가 5주로 가장 많았고, A. falvus, A. terreus, 그리고 A. lentulus가 각각 1주씩 종 수준까지 동정되었고, A. versicolor는 2주 모두 ITS와 D1D2에서 100% 상동성을 나타냈다. 형태학적 검사에서 분생자가 생성되지 않아 동정이 불가능하였던 1주는 E.
본 연구에서는 대상균주 65주의 염기서열 분석에서 증폭을 위한 표적부위로는 CLSI 가이드라인 MM18-A에서 1차적으로 제시하고 있는 ITS로 61주를 분석하였고, 추가동정을 위한 표적으로 제시하고 있는 D1D2로 44주를 분석하였으며, β-tubulin 유전자는 8주에 사용한 결과 62주(95.4%)에서 종 수준까지의 동정이 가능하여 동정률이 향상된 결과를 보였으며, 국내에서 처음 확인된 임상적으로 유의성이 있는 균종은 B. dermatitidis와 T. marneffeii, 그리고 G. argillacea 등이었다[14].
본 연구에서도 형태학적 분석에서 12 균주 중 8주만이 일치하여 33.4%에 해당하는 4균주의 동정 불일치를 나타냈다. Kontoyiannis 등[19]은 20주의 Mucormycosis의 형태학적 동정과 분자생물학적 분석에서 20%의 불일치를 보였다고 보고하고 있다.
9%)이었다. 분자생물학적 검사 결과, 흑색 진균이 4주로 Exophiala lecanii-corni 2주, Phialophora olivacea 1주, 그리고 Phialophora europaea 1주로 동정되었고, 유리질 사상균이 6주로 Acremonium strictum 1주, Aspergillus versicolor 1주, Emericella parvathecia 1주, Geomyces pannorum 1주, Geosmithia argillacea 1주, 그리고 Microascus speicies 1주가 동정되었으며, 털곰팡이 목인 Rhizopus microsporus var. chinensis 1주가 동정되었다.
둘째, 형태학적 동정의 근거가 되는 분생포자가 다양한 형태로 나타나고, 어떤 경우에는 수 주가 지나도 분생포자가 형성되지 않아 동정의 근거를 찾을 수 없는 경우가 발생한다. 셋째, 형태학적 동정의 근거가 되는 균사와 분생포자를 찾았다 하더라도 형태학적 동정에 참고가 되는 서적들의 대부분은 한 종에서 대표적인 종 몇 개만 제시하고 있어 전형적인 형태가 아닌 비정형 형태의 분생포자들인 경우에는 진균검사에 오랜 경험을 가진 전문가라도 형태학적 동정의 오류를 피해갈 수가 없다.
염기서열 분석과 형태학적인 동정한 결과가 일치하여 종과 속이 동일하게 동정된 것은 Sporothrix schenckii, Cunninghamella brethollefiae, Syncephalastrum racemosum, Aspergillus falvus, 그리고 Aspergillus terreus 각각 1주씩으로 5주(7.7%)가 일치하였다.
는 현미경적으로 분생포자가 바나나 또는 카누 모양으로 쉽게 구분할 수 있는 진균이다. 염기서열 분석으로 확인된 N. rigidiuscula는 열대 과일나무의 잎마름병의 원인균으로 사람의 감염 사례 보고가 없는 진균이었다. Aspergillus versicolor 1주는 형태학적으로 Scopulariopsis spp.
염기서열분석 결과 10 주는 ITS에서 상동성이 98∼100%를 나타냈고, 5주는 D1D2에서 99∼100%의 상동성을 보였다.
임상 검체에서 분리된 진균을 형태학적으로 동정하기는 매우 어려운 일이다. 첫째, 같은 속의 진균이라도 배지의 선택과 배양 온도에 따라 집락이 자라는 속도가 다르고, 집락의 색깔과 크기가 다르다. 둘째, 형태학적 동정의 근거가 되는 분생포자가 다양한 형태로 나타나고, 어떤 경우에는 수 주가 지나도 분생포자가 형성되지 않아 동정의 근거를 찾을 수 없는 경우가 발생한다.
한 종의 염기서열을 분석한 결과가 가장 높은 염기서열의 상동성이 98% 이상이고, 그 다음으로 일치하는 것과 0.8% 미만이면 해당 종으로 동정하고, 하나의 염기서열이 가장 높은 염기서열과 95∼98%의 상동성을 보이거나 98% 이상에 해당하는 종이 둘 이상이면서 상동성의 차이가 0.8% 미만일 때에는 같은 속으로 동정하였고, 상동성이 95% 미만이거나, 95% 이상이라도 여러 속들이 함께 나타나면 동정불가로 하였다.
형태학적 검사에서 분생자가 생성되지 않아 동정이 불가능하였던 1주는 E. parvathecia로 ITS 100%, β-tubulin 99%의 일치도를 보였다.
5%이었고, 65주의 염기서열분석으로 62 균주는 속과 종의 동정이 가능하였다. 형태학적 검사와 염기서열분석의 결과, 속과 종이 불일치한 경우 14주(21.5%)이었고, 형태학적으로 동정이 불가능하였던 사례는 11 균주이었다. B.
DiD2, 그리고 β-tubulin 유전자를 표적 부위로 하였고, 증폭된 염기서열은 상동성 분석을 위하여 GenBank 데이터베이스의 알고리즘을 이용하여 분석하였다. 형태학적으로 속 수준의 동정이 가능한 진균은 61.5%이었고, 65주의 염기서열분석으로 62 균주는 속과 종의 동정이 가능하였다. 형태학적 검사와 염기서열분석의 결과, 속과 종이 불일치한 경우 14주(21.
형태학적인 동정과 분자생물학적 동정 결과가 불일치 한 예는 14주(21.5%)주로, 균종별로는 mucorales 목이 4주, 두형태 진균이 2주, 흑색 진균이 3주, 그리고 유리질 진균이 5주 이었다. mucorales 가운데 3주는 형태학적으로 Rhizomucor spp.
후속연구
는 형태학적 동정으로 종 수준의 동정이 불가능할 뿐만 아니라, 속 수준의 동정도 성장속도가 느리고 분생포자의 형성이 잘되지 않아 어렵다. 따라서 정확한 형태를 확인하기 위하여 슬라이드 배양을 시행하는 것을 제안하며, 신속한 동정을 위해서는 ITS와 D1D2 유전자를 이용한 염기서열분석이 유용할 것으로 사료된다.
에서는 불일치를 보였다. 따라서 침습성 감염 등에서 분리된 Mucorales의 형태학적 동정의 문제들을 해결하기 위해서는 분자생물학적 방법들과 병행하는 것이 유용할 것으로 사료된다.
임상 검체에서 분리되는 진균의 동정은 전통적인 형태학적 검사와 분자생물학적 검사를 병행하면 신속하고 정확한 결과를 제공할 수 있지만, 분자생물학적인 검사방법은 비용과 임상적 중요성 등을 고려하여야 하므로, 첫째, 무균적 검체에서 지속적으로 분리되고 동정의 근거가 되는 분생포자가 형성되지 않거나, 분생포자가 관찰되는데도 동정이 불가능한 경우, 둘째, 피부 사상균 외의 진균이 10일 이상 배양하였는데도 분생포자가 생성되지 않는 경우, 셋째, 항진균제의 선택 등을 고려하여 종 동정이 요구되는 경우, 그리고 네 번째로 집락의 특성과 현미경적 형태의 특성이 불일치하거나, 비정형의 분생포자가 관찰되는 경우를 고려하여 염기서열분석 방법 등 분자생물학적 검사를 시행한다면 사상형 진균의 동정에 유용할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
침습적 감염을 일으키는 사상형 진균들은 무엇이 있나요?
사상형 진균에 의한 침습적 감염은 여전히 Aspergillus가 대부분을 차지하고 있지만, 장기이식이나 악성 종양환자의 항암치료에 의한 면역저하 환자의 증가와 더불어 Zygomycetes, Fusarium 그리고 Scedosporium spp와 같은 다양한 사상형 진균에 의한 감염도 증가하고 있다[1, 2].
진균의 형태학적인 동정의 문제점을 극복하기 위해서 활용되는 분자생물학적 동정 방법은?
최근에 진균의 형태학적인 동정의 문제점들을 극복하기 위하여 분자생물학적 검사 방법들이 활발하게 이용되고 있다[3]. 진균의 분자생물학적 동정 방법 가운데 염기서열분석법(sequencing)은 진균 검사의 전통적인 형태학적 검사의 문제점을 극복할 수 있는 검사 방법으로 간주되고 있다[4-6].
사상균의 집락의 특징적인 형태를 현미경으로 쉽게 동정하지 못하는 이유는?
대부분의 사상균은 배양에서 자란 집락의 형태와 현미경적 특성으로 동정할 수 있는 표현형 기준으로 동정을 하지만, 집락의 특징적인 형태를 관찰하기 위해서는 균종에 따라 수일 또는 수 주일이 소요되고, 동정을 위해서는 매우 숙련된 전문가를 필요로 할 뿐만 아니라, 판독자의 주관적인 소견에 의존하기 때문에 잘못 동정하거나 동정을 하지 못하는 문제점이 있다[1].
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