[논문]고본양정방 투여가 TCDD 유도 랫드의 항산화 변화에 미치는 영향

양동현; 오지혜; 박운규; 조충식; 황석연

doi:10.5762/kais.2020.21.10.231

고본양정방 투여가 TCDD 유도 랫드의 항산화 변화에 미치는 영향
The Effects of Gobonyangjeonbang Administration on Antioxidative of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) induced Rats. 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.21 no.10, 2020년, pp.231 - 239

양동현 (대전대학교 임상병리학과) , 오지혜 (대전대학교 임상병리학과) , 박운규 (대전대학교 임상병리학과) , 조충식 (대전대학교 한의과대학) , 황석연 (대전대학교 임상병리학과)

초록
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본 연구의 목적은 TCDD로 인해 발생하는 산화적 스트레스에 대한 GYB의 내분비 기능 및 항산화 효능에 미치는 영향을 평가하기 위한 것이다. 2017년도에, 산화적 스트레스에 대한 GYB의 효능을 평가하기 위해 35마리의 수컷 SD랫드를 5개의 그룹으로 나누어 실험하였다. 정상 대조군은 vehicle 및 saline을 투여하였으며, TCDD 단독투여그룹은 TCDD(2 ㎍/kg, weeks) 및 생리식염수를 복강 내 투여하였으며, 시험 군은 6주 동안 GYB (75, 150, 300 mg/kg)를 3가지 농도로 나누어 경구로 투여하였다. 체중은 NC 그룹의 랫드와 비교하였을 때 TCDD 노출 후 6주 후에 유의하게 감소하였다(p<0.001). 그러나 TCDD에 의한 체중 감소는 GYB 300 mg/kg 투여에 의해 현저하게 보호되었다(p<0.01). TCDD로 유도된 랫드의 간은 세포질의 공포 변성이 나타났으며, 간의 동양 혈관과 중량의 증가를 나타냈다. MDA, SOD를 측정한 결과, TCDD 투여에 의하여 두 항목 모두 감소하는 경향이 나타났다. 반면, GYB 투여에 의한 변화는 나타나지 않았고, SOD 결과에서 GYB 300군에서 NC군 대비 유의성이 관찰(p<0.05) 되었다. 이러한 발견은 GYB가 랫드에서 TCDD 유도 간 독성에 대해 보호 효과를 가질 수 있음을 증명하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to evaluate the effects of gobonyangjeonbang (GYB) on the endocrine function and the antioxidant efficacy of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)-induced oxidative stress in rats. In 2017, to evaluate the efficacy of GYB on oxidative stress, 35 male SD rats were divided into five groups and tested. The normal control group was administered saline as a vehicle, while the TCDD-alone group was administered TCDD (2 ㎍/kg per week) intraperitoneally and with physiological saline, and the test group was administered GYB orally by dividing it into three concentrations (75, 150, and 300 mg/kg) for six weeks. Bodyweight decreased significantly after six weeks of TCDD exposure, when compared to rats in the NC group (p<0.001). However, weight loss from TCDD was significantly protected by administration of GYB at 300 mg/kg (p<0.01). The rat liver induced by TCDD showed cytoplasmic vacuole degeneration, and the hepatic sinusoid and weight increased. As a result of measuring MDA and SOD, both items tended to decrease under TCDD administration. On the other hand, there was no change due to GYB administration, and significance was observed in the GYB 300 mg/kg group compared to the NC group in the SOD result (p<0.05). These findings demonstrated that GYB may have a protective effect against TCDD-induced liver toxicity in rats.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Experimental Protocol for the Effect of GYB on TCDD Abbreviation : NC, Normal control group male SD rats received vehicle (corn oil and trace amount of DMSO and acetone) and saline ; TA, TCDD alone group received TCDD (2 μg/kg b.w. weeks) and saline; GYB, group received TCDD (2 μg/kg b.w. weeks) and GYB (75, 150, 300 mg/kg b.w.) in male SD rats.
표 Table 1. Changes of body weight in TCDD induced and GYB administration in male SD rats. Unit (g)
표 Table 2. Absolute and Relative Liver weight of Major organ in TCDD induced and GYB administration in male SD rats.
표 Table 3. The effects of GYB administration on red blood cell and White blood cell index in TCDD induced male SD rats.
표 Table 4. The effects of GYB administration on antioxidant parameter in TCDD induced male SD rats.
표 Table 5. The effects of GYB administration on interleukin and tumor necrosis-alpha in TCDD induced male SD rats.
그림 Fig. 2. Hepatic histopathologic changes of central vein in the TCDD-induced sinusoid and vacuolation change liver of rats. (a) Normal control (b) TCDD alone group (c) GYB 75mg/kg (d) GYB 150mg/kg. (e) GYB 300mg/kg.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구에서는 TCDD로 인해 발생하는 산화적스트레스에 대한 문제를 해결하기 위하여 항산화 효능을 가지고 있으며 간 장해 모델 실험이 많이 이루어졌던, 기존 처방의 대체 물질로써 고본양정방(GYB: Gobonyangjeonbang)이라는 구기자, 인삼, 토사자, 오미자, 복분자, 가구자로 6가지의 한방재료를 선정하여 TCDD-유도 독성을 유발한 랫드에서 내분비 기능 및 항산화 활성 관련 지표에 미치는 영향을 조사하고자 본 연구를 시행하였다.
최근 항산화에 관한 연구들이 많이 시행되고 있는데 이와 관련하여 실험적 산화적 손상 유발은 폴리클로린화디벤조-p-다이옥신으로 이 계열 중 가장 약효가 강력한 화합물인 TCDD로 유도하여 산화적 스트레스 및 세포 손상, 질병을 유발하는 ROS를 생성하여 유발하는 방법이 있다. 이에 본 실험에서는 TCDD에 의한 산화적 손상 유발 흰쥐에 대한 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 GYB를 통해 항산화 효과를 평가하고자 하였다.

제안 방법

TCDD (1 mg)를 소량의 아세톤(900 μL)과 미량의 DMSO (100 μL))를 사용하여 녹여 초음파 처리 후, 옥수수기름(corn oil 500 mL, Sigma-aldrich, USA)을 이용하여 1:9 비율로 희석하여 실험에 사용하였다. TCDD의 투여 농도는 Beytur 등, Ciftci 등의 방법에 따라 2 μg/kg b.w.의 농도로 주 1회 복강(intraperitoneal, i.p)으로 총 6주간 투여하였다(Figure 1).
간 조직의 지질 과산화 반응의 변화를 규명하기 위해 생체 내 생성 정도를 알 수 있는 반응 산물인 MDA와 SOD 함량을 측정하였다. 생체의 각 세포는 독성 물질을 제거하는 작용을 하며 세포의 효소가 처리할 수 없는 양이거나 충분한 효소가 없을 시 세포는 암세포로 변성될 위험성이 있다.
연구대상 변수의 거의 완벽한 통제가 가능한 실험실 환경에서 수행함으로써 정확한 측정 및 내적 타당성을 가질 수 있게 설정하였다. 실험군은 정상 대조군 (N.C: Normal Control), TCDD 단독투여군(TA: TCDD alone), TCDD-GYB의 병행 투여군 GYB75 (75 mg/kg b.w.), GYB150 (150 mg/kg b.w.), GYB300 (300 mg/kg b.w.)으로 총 5개의 군으로 설정하였다. 실험동물은 일정 시간(오전 11:00∼오후 14:00) 내에서 처치하였다.
GYB를 구성하는 한약 처방은 난임뿐만 아니라 각각의 성분이 우수한 항산화 효능을 가지고 있다고 알려져 있다. 이에 한국신텍스제약에 의뢰하여 개별 추출하고 동결 건조하여 처방 비율에 따라 저(75 mg/kg b.w.), 중(150 mg/kg b.w.), 고(300 mg/kg b.w.)용량으로 혼합하여 총 6주간 1일 1회 경구투여(per oral, p.o)하였다(Figure 1).
조직병리학적 검사를 위하여 적출된 장기들을 대한병리학회 가이드라인에 의하여 10 % NBF (neutral buffered formalin)에 24시간 고정하였으며, 조직처리기(tissue Prosessor, Thermo shandon, USA)에서 탈수, 투명, 침투 과정을 거쳐 조직 포매 장치를 이용하여 조직 block을 제작하였다. 제작된 block을 박절기(RM 2245, LEICA BIOSYSTEMS, Germany)를 이용하여 3μm로 박절하여 간 조직에 대하여 hematoxylin and eosin staining (H&E) 염색을 한 후, 광학현미경(microscope, ZEISS, Germany)으로 조직의 변화 및 이상 유무 등 조직병리학적 소견을 관찰하였다.

대상 데이터

TCDD는 AccuStandard Inc. (New Haven, CT, USA)로부터 순도 99.1 % 이상의 화합물을 구입하였다. TCDD (1 mg)를 소량의 아세톤(900 μL)과 미량의 DMSO (100 μL))를 사용하여 녹여 초음파 처리 후, 옥수수기름(corn oil 500 mL, Sigma-aldrich, USA)을 이용하여 1:9 비율로 희석하여 실험에 사용하였다.
실험에 사용되는 GYB는 대전대학교 둔산 한방병원에서 난임을 겪는 성인 남성에게 투약하는 한약 처방으로 구기자, 토사자, 복분자, 인삼, 가구자, 오미자로 구성되었고, 비율은 성인 1회 섭취량을 고려하여 설정한 임상에서 사용되는 처방 비율인 9:7:5:5:3:1이다. GYB를 구성하는 한약 처방은 난임뿐만 아니라 각각의 성분이 우수한 항산화 효능을 가지고 있다고 알려져 있다.
체중 200±20 g의 수컷 SD rat (Sprague-Dawley계)를 ㈜ 라온바이오(경기 용인시)로부터 구입하여 1주간의 동물실의 사육환경에 적응, 1주간 존데 적응훈련을 한 뒤, 실험에 이용하였다. 실험동물의 사육은 온도 23±1℃, 습도 50±10 %, 명암주기 12시간으로 유지되는 항온, 항습 사육실에서 사육하였다.

데이터처리

05에서 통계적 유의성을 검정하였다. TCDD 투여와 GYB의 투여에 따른 변화에 대한 통계적 유의성을 일원배치 분산분석(One way ANOVA)의 샤페의 사후검정(Scheffe test)을 실시하여 평균 간의 유의성을 검정하고, 독립표본 T 검정(Student t-test)을 이용하여 분석하였다.
각 실험군 간 유의성 검정은 IBM SPSS Statistics version 20 통계 package를 이용하였으며, 유의수준 p<0.05에서 통계적 유의성을 검정하였다. TCDD 투여와 GYB의 투여에 따른 변화에 대한 통계적 유의성을 일원배치 분산분석(One way ANOVA)의 샤페의 사후검정(Scheffe test)을 실시하여 평균 간의 유의성을 검정하고, 독립표본 T 검정(Student t-test)을 이용하여 분석하였다.

이론/모형

일반혈액학적 검사를 위하여 복대동맥으로부터 ethylenediaminetetraaceticacid tube (EDTA tube, BD, USA)에 채혈 후 clinical and laboratory standards insitute (CLSI, USA, 2017) 기준에 따라 6~8회 위아래로 섞은 후 자동혈액 분석기(Advia 2120i, SIEMENS, Germany)를 이용하여 적혈구 지수, 백혈구, 백혈구 백분율, 혈소판 수를 분석하였다.

성능/효과

TCDD와 GYB 투여에 의한 간 조직의 면역기능 지표에 미치는 영향을 평가하기 위하여 인터루킨 3(IL-3: Interleukin-3), 인터루킨 6(IL-6, Interleukin-6), 종양괴사인자 알파(TNF-α: Tumor Necrosis Factor alpha)를 측정한 결과, GYB 150군을 제외하고 유의성이 관찰되었다(p<0.05~0.001). IL-3 치는 NC군 대비 TA군에서 55 % 수준으로 감소하였으며, IL-6 수치 역시 55 % 수준으로 감소하였다.
TCDD와 GYB 투여에 의한 간 조직의 항산화 지표에 미치는 영향을 평가하기 위하여 말론디알데하이드 (MDA: Malondialdehyde), 슈퍼옥사이드 디뮤타제 (SOD: Superoxide dismutase)를 측정한 결과, TCDD 투여에 의하여 두 항목 모두 감소하는 경향이 나타났다. 반면, GYB 75, 150군에서 TA군과 비교하였을 때, SOD와 MDA가 증가하는 것을 나타냈으나 유의성은 관찰되지 않았다(Table 4).
간 기능의 변화를 알아보기 위해 측정한 혈청 생화학적 수치를 볼 때 아스파르트산 아미노기전달효소(aspartate aminotransferase, AST) 수치는 NC군 대비 TA군에서 49 % 증가한 수치를 나타냈으며, 간 기능의 장애가 유도되었다. 한편 GYB 투여군에서는 TA군 대비 GYB 300군에서 79 % 수준으로 감소하였다.
최근 홍삼 추출물이 TCDD 투여로 인하여 나타나는 고환 독성을 크게 완하시켰고, 간독성에 있어서도 다소 억제 효과가 있다고 보고하였으나, 지금까지 TCDD로 인해 유발되는 간독성에 대하여 효과적으로 방어할 수있는 물질들은 거의 보고된 바 없다. 본 연구 결과, TCDD를 통해 유발된 동물모델에서 GYB에 의한 간 독성 개선 및 항산화 효소의 활성에 효능이 있음을 확인할수 있었다. 앞으로 TCDD 와 같이 간독성을 일으킬 수있는 다양한 화학물질에 대해서도 응용될 수 있을 것으로 기대되며, 활성 성분에 대해서 좀 더 깊은 연구가 이루어져야 할 것으로 판단된다.
본 연구에서 GYB 투여 용량설정에 있어 TCDD를 이용해, 독성을 유발한 후, GYB를 125, 250, 500 mg/kg.bw.로 투여하여 예비 실험한 결과, 농도 의존적인 효과가 나타났다. 이중 가장 효능이 있다고 판단되는 저농도 수준의 농도를 본 실험의 중간 농도로 설정 후 단계별로 저농도, 고농도로 설정하여 실험에 사용하였다.
이러한 기전으로 라디칼이 생성되면 SOD를 포함한 세포의 효소가 독소가 세포에 손상을 일으키기 전에 미리 제거한다. 연구 결과 TCDD 투여군의 간 조직에서 MDA, SOD의 함량이 감소됨을 확인하였고, GYB에 의해 증가됨을 확인하였다. MDA가 TA군에서 감소하는 경향을 보였는데, 이는 MDA는 고환절제 동물에서 정상군보다 MDA가 감소한 것으로 보아, testosterone의 생체 농도와 밀접한 관련이 있다고 알려져 있어 [22], TCDD 투여로 인한 성호르몬의 변화로 나타났을 것으로 생각되며, GYB투여로 인해 회복되면서 증가하였을 것으로 판단된다.
한편 절대 장기중량의 변화에서 GYB를 투여한 군은 TA군 대비 GYB 75, 150군에서는 간의 장기중량이 각각 5 % 증가, GYB 300군에서는 3 % 감소하였고, 유의성은 나타나지 않았다. 한편, 상대 장기중량의 변화에서 GYB 투여군은 TA 군 대비 GYB 75군과 GYB 300군은 각각 99 %, 94 %수준으로 감소하였으며, GYB 150군은 103 % 수준으로 증가한 결과가 나타났다(Table 2).
한편 GYB 투여군에서 TA군 대비 회복 효과는 보였으나 유의성은 보이지 않았다. 헤모글로빈, 헤마토크릿 수치의 경우 NC군에 비해 TA군에서 각각 82 %, 80 % 수준의 결과를 나타냈고, 모든 군에서 유의성이(p<0.001) 관찰되었으며, GYB 투여에 의해 회복되는 경향을 나타냈으나 유의성은 없었다(Table 3)

후속연구

본 연구 결과, TCDD를 통해 유발된 동물모델에서 GYB에 의한 간 독성 개선 및 항산화 효소의 활성에 효능이 있음을 확인할수 있었다. 앞으로 TCDD 와 같이 간독성을 일으킬 수있는 다양한 화학물질에 대해서도 응용될 수 있을 것으로 기대되며, 활성 성분에 대해서 좀 더 깊은 연구가 이루어져야 할 것으로 판단된다. 이를 위해 본 연구에서 평가한 항산화 지표에 더하여 다양한 인자들에 대한 추가 적인 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 생각된다.
앞으로 TCDD 와 같이 간독성을 일으킬 수있는 다양한 화학물질에 대해서도 응용될 수 있을 것으로 기대되며, 활성 성분에 대해서 좀 더 깊은 연구가 이루어져야 할 것으로 판단된다. 이를 위해 본 연구에서 평가한 항산화 지표에 더하여 다양한 인자들에 대한 추가 적인 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 생각된다. 특히, 본 연구에서 TCDD 투여로 인한 MDA의 감소가 간 독성만으로 일어난 변화라고 판단하는 데 한계가 있어, 추후 TCDD 투여로 인해 나타날 수 있는 생식독성 여부 및 남성 호르몬에 미치는 영향과 연관된 MDA의 변화에 대한 연구를 진행하여 GYB의 추가적인 효능 탐색이 필요할 것으로 보인다.
이를 위해 본 연구에서 평가한 항산화 지표에 더하여 다양한 인자들에 대한 추가 적인 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 생각된다. 특히, 본 연구에서 TCDD 투여로 인한 MDA의 감소가 간 독성만으로 일어난 변화라고 판단하는 데 한계가 있어, 추후 TCDD 투여로 인해 나타날 수 있는 생식독성 여부 및 남성 호르몬에 미치는 영향과 연관된 MDA의 변화에 대한 연구를 진행하여 GYB의 추가적인 효능 탐색이 필요할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	내분비 장애 물질의 문제점은?	내분비 장애 물질은 직접 노출된 동물의 다음 세대에까지 독성을 나타내며, 내분비 작용을 방해하는 외인성 물질로서 호르몬에 민감한 조직과 생식기에 암과 같은 퇴행성 질환을 일으킨다는 점에서 사회적인 문제점을 야기하고 있다[1]. 환경호르몬인 다이옥신계 화합물 중에서 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)는 대표적인 내분비계 장애 물질로서 면역, 내분비계, 생식기계 기능을 파괴하고, 간 기능과 지질대사에 이상을 초래하는 것으로 알려져 있다[1].
	인삼의 효능은?	A. Meyer)은 건강을 개선하는 동시에 간 기능, 신장 기능을 개선한다고 알려져 있다[10]. 토사자(Cuscutae Semen)는 산화적 스트레스의 저해 효과, 급성 간독성에 대해 보호하는 효과도 나타낸다고 알려져 있다[11].
	다이옥신계 화합물 중 TCDD은 어떤 문제를 야기하나?	또한, TCDD는 세포 내 단백질인 aryl hydrocarbon receptor에 붙어 핵 속에 침투하여 DNA의 특정 부위에 결합하여 독성을 일으키고, 간에서 심각한 문제를 야기한다고 알려져 있다[2, 3]. 이러한 현상은 TCDD가 간의 대사과정 중 생체 내 활성산소 생성의 주요 급원인 cytochrome p-450 효소계에 영향을 줌으로 독성이 유발되는 것으로 추정되고 있다[4, 5, 6].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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