[논문]LPS가 처리된 대식세포에서 Nrf2/HO-1 경로 활성을 통한 무환자나무 열매 추출물의 항산화 효과

김대용

doi:10.12925/jkocs.2020.37.5.1306

LPS가 처리된 대식세포에서 Nrf2/HO-1 경로 활성을 통한 무환자나무 열매 추출물의 항산화 효과
Anti-oxidative Effect of Sapindus mukorossi Fruits Extract in LPS-stimulated macrophages via Activation of Nrf2/HO-1 pathway 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.37 no.5, 2020년, pp.1306 - 1313

김대용 (우석대학교 한의과대학)

초록
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본 연구의 목적은 LPS로 자극된 RAW264.7 대식세포에서 Sapindus mukorossi 열매 추출물(SME)의 항산화 효능을 확인하는 것이다. 그 결과, SME가 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 ROS 생성을 현저하게 감소시켰고 전염증성 단백질인 COX-2 및 iNOS의 발현을 억제하였다. 또한 SME는 HO-1 및 Nrf2 발현을 상향 조절하였고 Akt 및 GSK-3β의 인산화를 증가시켰다. 이러한 결과는 SME가 Nrf2/HO-1 신호전달 경로의 활성화를 통하여 산화적 스트레스를 완화시킬 수 있음을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aims of this study were to determine the effects of Sapindus mukorossi fruit extracts (SME) on the anti-oxidant activity in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. The results showed that SME significantly reduced the production of ROS in LPS-stimulated RAW264.7 cells. The expression of pro-inflammatory proteins including COX-2 and iNOS were also obviously inhibited by SME in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Further studies revealed that SME up-regulated HO-1 and Nrf2 expression. Additionally, SME increased phosphorylation of Akt and GSK-3β. These results suggest that SME could attenuate oxidative stress by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. The effect of SME on cell viability. RAW264.7 cells were seeded at a density of 5 × 10⁵ cells per well (96-well plate) and MTT assay was conducted with various concentrations of SME.
그림 Fig. 2. SME supresses ROS generation in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. (A) Cells were treated with various concentrations of SME in the presence of LPS (1 μg/mL). DCF fluorescence was imaged under a fluorescence microscope. (B) The fold increase of intracellular ROS, compared to the control was quantified by measuring the DCF fluorescence intensity in the microscopic field. The results are the mean ± SD of three assays. * indicated a significant difference from the LPS-stimulated group (p<0.05).
그림 Fig. 3. SME inhibit the expression of the COX-2 and iNOS in RAW264.7 macrophages. Cells were incubated with or without SME and total proteins were prepared. The expression of COX-2 and iNOS were detected by Western blot. The relative changes in the intensities of the protein bands were measured by densitometry. The results are the mean ± SD of three assays. * indicated a significant difference from the LPS-stimulated group (p<0.05).
그림 Fig. 4. SME activate Nrf2 transcriptional activation and induces the expression of the HO-1 in RAW264.7 macrophages. Cells were incubated with or without SME and total proteins were prepared. The expression of Nrf2 and HO-1 were detected by Western blot. The relative changes in the intensities of the protein bands were measured by densitometry. The results are the mean ± SD of three assays. * indicated a significant difference from the LPS-stimulated group (p<0.05).
그림 Fig. 5. The effect of SME on the activation of Akt and GSK-3β pathway in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. Cells were incubated with or without SME and total proteins were prepared. The expression of phosphorylation level of Akt and GSK-3β were detected by Western blot. The relative changes in the intensities of the protein bands were measured by densitometry. The results are the mean ± SD of three assays. * indicated a significant difference from the LPS-stimulated group (p<0.05).

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 항산화 효능을 가지 기능성 소재에 대한 기초자료를 제시하고자 대식세포에 LPS를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하고 무환자나무 열매 추출물을 전처리하여 항산화 효능을 관찰하였다. 그 결과, 무환자나무 열매 추출물에 의하여 ROS의 생성 감소, COX-2, iNOS, HO-1의 단백질 발현의 감소, Nrf2의 핵 이동 증가, Akt와 GSK-3β의 인산화 증가의 결과가 관찰되었다.
본 연구에서는 SME에 의해서 활성화되는 Nrf2가 Akt와 GSK-3β의 신호경로에 의한 것인지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 그 결과, LPS에 의해 감소된 Akt의 인산화가 SME에 의해서 증가됨을 확인하였다.
7 대식세포를 이용하여 LPS에 의한 산화적 스트레스를 유도하고 이에 대한 추출물의 항산화 효능을 연구하였다. 이를 통해 무환자나무 열매 추출물이 가지고 있는 항산화 효과를 확인하고 그 기전을 밝혀, 기능성 소재로서 화장품 개발에 활용할 수 있는 기초자료를 제시하고자 하였다.
이에 본 연구에서는 무환자나무 열매 추출물의 항산화 효능을 확인하기 위하여 RAW264.7 대식세포를 이용하여 LPS에 의한 산화적 스트레스를 유도하고 이에 대한 추출물의 항산화 효능을 연구하였다. 이를 통해 무환자나무 열매 추출물이 가지고 있는 항산화 효과를 확인하고 그 기전을 밝혀, 기능성 소재로서 화장품 개발에 활용할 수 있는 기초자료를 제시하고자 하였다.

제안 방법

LPS로 유도된 대식세포에서 ROS는 과잉 생산되고 이는 염증 유발로 이어진다[3]. 그러므로 본 연구에서는 ROS 생성에 대한 SME의 억제 효과를 평가하였다. 대식세포에 LPS를 처리하므로써 ROS 생성이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.
본 연구에서도 SME가 산화적 스트레스에 의한 염증에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 COX-2와 iNOS의 발현을 측정하였다. 그 결과로, LPS에 의하여 증가된 COX-2와 iNOS의 발현이 SME에 의하여 농도의존적으로 감소됨을 확인하였다.

대상 데이터

마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 10% heat-inactivated FBS (HyClone, USA), 100 U/㎖ penicillin/streptomycin (HyClone, USA)을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, HyClone, USA) 배양액에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.
무환자나무 열매 추출물(Sapindus mukorossi Fruits extract, SME)은 한국융합기술연구소(주)에서 제조하여 제공하였다. 시료 중량 10배의 증류수와 혼합하여 진탕배양기(Daihan Scientific, Korea)를 이용하여 상온에서 24시간 30 rpm으로 교반하면서 열수추출물을 얻었다.

데이터처리

, USA)을 이용하였다. 통계학적인 유의성 검증은 p = 0.05에서 Duncan’s multiple range test를 진행하였다.

이론/모형

세포는 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit (ThermoFisher scientific, USA)를 사용하여 핵과 세포질을 분리하였다. Nrf2의 활성은 western blot analysis를 이용하여 측정하였다.
SME의 세포 독성을 실험하기 위하여 CellTiter 96^® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, Medison,WI)를 사용하였다. 대식세포를 5 × 10⁵ cells/mL 농도로 96-well plate에 분주하고 37℃에서 24시간 동안 CO₂incubator에서 배양하였다.

성능/효과

본 연구는 항산화 효능을 가지 기능성 소재에 대한 기초자료를 제시하고자 대식세포에 LPS를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하고 무환자나무 열매 추출물을 전처리하여 항산화 효능을 관찰하였다. 그 결과, 무환자나무 열매 추출물에 의하여 ROS의 생성 감소, COX-2, iNOS, HO-1의 단백질 발현의 감소, Nrf2의 핵 이동 증가, Akt와 GSK-3β의 인산화 증가의 결과가 관찰되었다.
본 연구에서도 SME가 산화적 스트레스에 의한 염증에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 COX-2와 iNOS의 발현을 측정하였다. 그 결과로, LPS에 의하여 증가된 COX-2와 iNOS의 발현이 SME에 의하여 농도의존적으로 감소됨을 확인하였다. 이것은 산화적 스트레스에 의해 유도된 염증 매개물질이 무환자나무 열매 추출물에 의하여 감소된 것으로, 무환자나무 열매 추출물이 항염증 활성을 가지는 기능성 소재로서의 가능성을 제시하고 있다.
산화적 스트레스와 염증 상태에서 발현이 증가된 HO-1은 세포 보호에 중요한 역할을 수행한다[3]. 그러므로 산화적 스트레스 및 염증과 관련된 다양한 질환에서 Nrf2/HO-1 신호전달 경로의 유도를 통한 세포 보호 작용은 중요한 표적이 될 수 있을 것이다.
그러므로 본 연구에서는 ROS 생성에 대한 SME의 억제 효과를 평가하였다. 대식세포에 LPS를 처리하므로써 ROS 생성이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 그리고 SME를 전처리한 경우에는 ROS 생성이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다.
본 실험의 결과로, SME에 의해서 증가된 Akt가 GSK-3β의 인산화를 유도하여 불활성화시키고, GSK-3β의 불활성화로 인해 Nrf2의 활성은 증가하여 항산화 효과를 나타난 것으로 사료된다.
그러므로 과도한 염증을 억제하기 위해서는 ROS의 과잉 생산을 억제해야한다. 본 연구에서 SME를 처리한 결과, 대식세포에서 HO-1 발현이 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 4B).
이상의 결과로부터 무환자나무 열매 추출물이 LPS에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대항하여 Nrf2/HO-1 경로를 통하여 항산화 효능을 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 항산화 효능을 가지는 기능성 소재로서 무환자나무 추출물이 이용될 수 있는 근거를 제공할 수 있다고 사료된다.
그리고 SME를 전처리한 경우에는 ROS 생성이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다. 즉, SME가 ROS의 생성을 억제할 수 있는 항산화 효능을 가지고 있다는 것을 확인하였다.

후속연구

그 결과로, LPS에 의하여 증가된 COX-2와 iNOS의 발현이 SME에 의하여 농도의존적으로 감소됨을 확인하였다. 이것은 산화적 스트레스에 의해 유도된 염증 매개물질이 무환자나무 열매 추출물에 의하여 감소된 것으로, 무환자나무 열매 추출물이 항염증 활성을 가지는 기능성 소재로서의 가능성을 제시하고 있다.
이상의 결과로부터 무환자나무 열매 추출물이 LPS에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대항하여 Nrf2/HO-1 경로를 통하여 항산화 효능을 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 항산화 효능을 가지는 기능성 소재로서 무환자나무 추출물이 이용될 수 있는 근거를 제공할 수 있다고 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Nrf2는 무엇인가?	Nrf2 (nuclear factor erythroid-2 related factor 2)는 항산화 및 세포 보호 기능을 갖는 catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), heme oxygenase-1 (HO-1), glutathione peroxidase (GPx)와 같은 단백질의 발현을 조절하는 전사인자이다[2]. 산화적 스트레스가 발생하면 Nrf2가 활성화되어 핵으로 이동하여 항산화와 관련된 유전자의 전사를 촉진한다.
	무환자나무는 무엇인가?	무환자나무는 Sapindaceae과에 속하는 soapnut 나무로 일본에서부터 인도에 이르기까지 아시아의 열대 및 아열대 기후에서 발견되는 나무 중 하나이다. Soapnut은 과피에 triterpenoid saponin이 함유된 과일로 유명하며, 이는 천연 세제로 널리 사용되고 있다.
	Soapnut 나무의 과피, 줄기, 열매가 어떤 성분을 함유하고 있다는 것이 보고되었는가?	trifoliatus)가 주요 품종으로 알려져 있다. 과피, 줄기 및 열매에서는 triterpenoid saponin 뿐만 아니라 지방산 및 플라보노이드 등이 함유된 것으로 밝혀졌다. S.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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