[논문]대장균 베타-갈락토시데이즈를 이용하여 합성된 Phenylethanol Galactoside의 NMR Spectroscopy 및 Mass spectrometry

이향렬; 정경환

doi:10.12925/jkocs.2020.37.5.1323

대장균 베타-갈락토시데이즈를 이용하여 합성된 Phenylethanol Galactoside의 NMR Spectroscopy 및 Mass spectrometry
NMR Spectroscopy and Mass Spectrometry of Phenylethanol Galactoside synthesized using Escherichia coli 𝛽-Galactosidase 원문보기 논문타임라인

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.37 no.5, 2020년, pp.1323 - 1329

이향렬 (한국교통대학교 생명공학전공) , 정경환 (한국교통대학교 생명공학전공)

초록
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대장균 효소 𝛽-gal를 이용하여 합성된 phenylethanol galactoside (PhE-gal)의 분자구조를 NMR (¹H-와 ¹³C-)과 고성능 mass spectrometry를 이용하여 분석하였다. 그 결과 PhE-gal은 ¹H NMR에서 2-phenylethanol (PhE)에 갈락토실기가 도입되었음을 나타내는 피크가 나타났다. 방향족 고리에서 오는 𝛿_H 7.30~7.21 ppm의 피크와 𝛿_H 2.88 ppm에 나타난 벤질기 위치의 CH₂에서 오는 피크는 PhE가 존재함을 나타낸다. 지방족 사슬 영역인 𝛿_H 4.31 ppm, 4.07 ppm과 𝛿_H 3.86~3.38 ppm에서 나타나는 7개의 proton 피크로부터 단당류가 도입되었음을 확인할 수 있었다. ¹³C NMR 스펙트럼에서 나타난 12개의 탄소 피크 중 4개의 피크는 방향족 고리인 페닐기로부터, 또한 단당류에서 기인한 6개의 탄소피크가 존재하므로 PhE에 단당이 도입되었음을 알 수 있다. PhE-gal의 분자량을 확인하기 위하여 질량분석기로 분석한 결과 m/z가 307.1181인 PhE-gal의 sodium adduct ion ([M+Na]⁺)이 나타나 생성물이 PhE-gal임을 알 수 있었다. 따라서 본 연구결과 E. coli 𝛽-galactosidase에 의한 촉매반응으로 PhE에 갈락토즈가 첨가된 생성물인 PhE-gal이 성공적으로 생합성 되었음을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

To characterize the molecular structure of PhE-gal synthesized using Escherichia coli 𝛽-gal, NMR (1H- and 13C-) spectroscopy and mass spectrometry of PhE-gal were conducted. 1H NMR spectrum of PhE-gal showed multiple peaks corresponding to the galactosyl group, which is an evidence of galactosylation on 2-phenylethanol (PhE). Downfield proton peaks at 𝛿H 7.30~7.21 ppm showed the presence of aromatic protons of PhE as well as benzyl CH2 protons at 𝛿H 2.88 ppm. Up field proton peaks at 𝛿H 4.31 ppm, 4.07 ppm and multiple peaks from 𝛿H 3.86~3.38 ppm are indicative of galactocylation on PhE. 13C NMR spectrum revealed the presence of 12 carbons suggestive of PhE-gal. Among 12 carbon peaks from PhE-gal, the four peaks at 138.7, 129.0, 128.6 and 126.5 were assigned aromatic carbons in the phenyl ring. Three peaks at 129.0, 128.6 and 126.5 showed high intensities, indicating CH aromatic carbons. 13C NMR data of PhE-gal showed 6 monosaccharide peaks from galactose and 2 peaks from aliphatic chain of PhE, indicating that PhE-gal was galactosyl PhE. The mass value (sodium adduct ion of PhE-gal, m/z = 307.1181) from mass spectrometry analysis of PhE-gal, and 1H and 13C NMR spectral data were in good agreement with the expecting structure of PhE-gal. We are expecting that through future study it will eventually be able to develop a new additive with low cytotoxicity.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. 2-Phenylethanol.
그림 Fig. 2. TLC analysis for PhE-gal synthesis using β-gal, in which 12- and 24-h samples were analyzed. Arrow indicates PhE-gal tentatively. PhE represent 1% standards of 2-phenylethanol.
그림 Fig. 3. ¹H-NMR spectrum of PhE-gal.
그림 Fig. 4. ¹³C-NMR spectrum of PhE-gal.
그림 Fig. 5. Mass spectrum of PhE-gal using LC/MS/QTOF. Arrow indicates a peak of sodium adduct ion of PhE-gal ([M+Na]⁺). In addition, molecular structure of [M+Na]⁺ is shown beside the arrow.
그림 Fig. 6. PhE-gal synthesis using β-gal by transgalactosylation reaction.

AI 본문요약
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문제 정의

즉, galactose 유도체가 보다 안전하다는 실험적인 증거를 확인하였다. 본 연구에서도 이러한 결과를 근거로 PhE의 galactoside 유도체인 PhE-gal의 합성 연구를 수행하였다.
본 연구팀에서는 이미 항균 활성을 가지고 있어서 화장품 보존제로 사용되고 있는 chlorphenesin (CPN)[6,7], phenoxyethanol (PE)[8,9], 1 ,2-hexanediol (HD)의 galactoside 유도체 합성[10,11]을 대장균 효소(Escherichia coli β-galactosidase)를 사용하여 transgalactosylation 방법으로 합성하는 연구를 수행하였다.
그러나, PhE의 안전성 문제는 화장품의 방향 성분에 대하여 꾸준히 제기되고 있는 부작용 문제와 함께 관심의 대상으로 떠오르고 있다[3,4,5]. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 연구에서는 PhE에 galactose 한 분자를 결합시켜 PhE의 galactoside 유도체(phenylethanol galactoside, PhE-gal)를 합성하는 연구를 수행하였다.
이 때, PE-gal의 항균력은 PE과 큰 차이가 없었으며, PE-gal의 인간 피부세포에 대한 독성이 PE와 비교하여, 현저하게 감소되는 것을 관찰하였다[8,9]. 이러한 선행 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 우선 PhE로부터 PhE-gal이 합성되는지를 관찰하는 연구를 수행하였다. 앞으로, PhE-gal의 합성 최적조건 확인, PhE-gal의 분리/정제 연구, 항균력 검증시험과 피부세포 독성 연구 순으로 계속 연구를 진행할 예정이다.

제안 방법

)를 사용하여 실시하였다. Ionization source는 ESI (electrospray ionization)으로, analyze type은 time of flight (TOF)로 물질의 m/z (mass to charge ratio)를 확인하였다.
96 U/ml β-gal, 1% PhE를 녹인 후, shaking incubator (40℃, 100 rpm) 에서 24 시간 동안 반응시켜 PhE-gal을 합성하였다. Silica gel chromatography (이동상, Ethyl acetate: Methanol: Distilled water = 17:2:1)를 이용하여 PhE-gal 로 추정되는 물질이 포함된 분획을 모은 후, rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축하였다. 자세한 조건과 방법은 선행연구에 상세히 기술하였다[8,9].
자세한 조건과 방법은 선행연구에 상세히 기술하였다[8,9]. 그리고, 이 농축 물질에 대하여 NMR spectroscopy와 mass spectrometry 분석을 실시하였다.
대장균 효소인 β-gal을 이용하여 PhE-gal을 합성하기 위하여 transgalactosylation 반응을 실시한 후, PhE-gal 합성 추정 물질을 NMR (1Hand 13C-) spectroscopy와 mass spectrometry로 분석하였다.
2와 같이 합성된 PhE-gal 추정 물질을 TLC로 확인 하였다. 이 물질을 silica-gel chromatography를 이용하여 정제한 후, ¹Hand ¹³C-NMR spectroscopy, 그리고 mass spectrometry 분석을 실시하였다.
정제된 PhE-gal의 질량 분석은 고분해능 Q-TOF mass spectrometer (MicroQTOF III, Bruker Co.)를 사용하여 실시하였다. Ionization source는 ESI (electrospray ionization)으로, analyze type은 time of flight (TOF)로 물질의 m/z (mass to charge ratio)를 확인하였다.
효소를 이용하여 합성된 화합물 PhE-gal의 구조를 분석하기 위해 400 MHz NMR Spectrometer (Bruker Ascend 400, Bruker, Germany)를 이용하여 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 얻었다. 이 때, 사용한 solvent는 D2O이며, 정제된 PhE-gal 약 20 mg을 1000 μl 용매에 녹여 NMR 시료를 제조하였다.

대상 데이터

2-Phenylethanol은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였고, TLC (thin-layer chromatography) plate는 MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG (Düren, Germany)의 precoated plates SIL HD UV254 (MN809222)를 사용하였다.
Galactoside 유도체(CPN-gal, PE-gal, HD-gal) 합성에는 대장균에서 발현된 β-galactosidase (β-gal)를 사용하였으며, 대장균 세포 안에 발현된 β-gal을 정제하지 않고, whole cell을 효소로서 사용하였다.
PhE-gal 정제를 위한 Silica gel은 Zeochem (Uetikon am See, Switzerland)의 ZEOprep 60 (60-200 μm)을 사용하였고, 기타 본 연구에 사용한 시약들은 reagent-grade를 사용하였다.
선행 연구에서 유사한 구조의 PE의 galactoside 유도체인 PE-gal를 본 연구와 같은 효소를 이용하여 방법으로 합성하였다. 이 때, PE-gal의 항균력은 PE과 큰 차이가 없었으며, PE-gal의 인간 피부세포에 대한 독성이 PE와 비교하여, 현저하게 감소되는 것을 관찰하였다[8,9].
이 때, 사용한 solvent는 D2O이며, 정제된 PhE-gal 약 20 mg을 1000 μl 용매에 녹여 NMR 시료를 제조하였다.

성능/효과

C-) spectroscopy와 mass spectrometry로 분석하였다. PhE의 hydroxyl group (-OH)에 galactose 한 분자를 결합된 PhE-gal의 분자구조와 질량을 확인할 수 있었으며, 이 때, 합성 반응이 Fig. 6과 같은 transgalactosylation 반응에 의하여서 일어난다고 추론할 수 있었다. 앞으로 방향족성 알코올과 지방족성 알코올의 transgalactosylation 반응생성물의 입체구조와 메 커니즘 연구를 통해 다양한 입체배열을 가지는 생리활성 galactoside 화합물을 합성하는데 기여할 수 있는 연구를 진행할 계획이다.
결론적으로 대장균 β-gal의 transgalactosylation 반응에 의하여 PhE로부터 PhE-gal가 합성되었음을 확인할 수 있었다.
이 선행연구 결과에서 chlorphenesin galactoside (CPNgal)[7], phenoxyethanol galactoside (PE-gal)[8], 1 ,2-hexanediol galactoside (HD-gal)[12]와 같이 한 분자의 galactose가 결합된 galactoside 유도체와 그렇지 않은 CPN, PE, HD와의 인간 피부세포에 대한 독성을 비교 연구하였다. 그 결과, 합성된 galactoside 유도체(CPN-gal, PE-gal, HD-gal)의 세포 독성이 CPN, PE, HD 보다 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, galactose 유도체가 보다 안전하다는 실험적인 증거를 확인하였다.
단당류의 proton들은 지방족 사슬 영역에서 나타나는데, δH 4.31 ppm, 4.07 ppm과 δH 3.86~3.38 ppm에서 나타나는 7개의 proton피크로부터 단당류가 도입되었음을 확인할 수 있다.
당과 방향족 알코올과의 반응으로 형성된 PhE-gal의 아세탈 위치의 절대 배열은 β–anomer를 형성하는 것으로 나타났다.
본 연구의 출발물인 PhE도 방향족성 알코올로써 기존 연구결과와 마찬가지로 한 종류의 입체이성질체인 β–anomer만 특이적으로 관찰되어 모두 일치된 결과를 보이고 있다.
그 결과, 합성된 galactoside 유도체(CPN-gal, PE-gal, HD-gal)의 세포 독성이 CPN, PE, HD 보다 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, galactose 유도체가 보다 안전하다는 실험적인 증거를 확인하였다. 본 연구에서도 이러한 결과를 근거로 PhE의 galactoside 유도체인 PhE-gal의 합성 연구를 수행하였다.
115] [C₁₄H₂₀NaO₆⁺]. 측정된 화합물의 이온질량[307.1181 (m/z)]이 Na⁺가 첨가된 화합물의 이론적 질량[307.115 (m/z)]과 거의 일치하므로 이 피크를 PhE-gal의 sodium adduct ion이라고 확인할 수 있었다. 결론적으로 대장균 β-gal의 transgalactosylation 반응에 의하여 PhE로부터 PhE-gal가 합성되었음을 확인할 수 있었다.

후속연구

본 연구에서도 대장균 효소 β-gal을 이용하여 PhE-gal이 합성dl 가능한지를 확인하기 위하여, 1H- and 13C-NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy과 mass spectrometry를 이용하여 확인 분석을 수행하였으며, 이러한 연구 결과를 바탕으로 보다 안전하고, 부작용 없는 화장품 및 식품용 첨가 물질 연구를 계속하기 위한 후속 연구를 수행할 예정이다.
6과 같은 transgalactosylation 반응에 의하여서 일어난다고 추론할 수 있었다. 앞으로 방향족성 알코올과 지방족성 알코올의 transgalactosylation 반응생성물의 입체구조와 메 커니즘 연구를 통해 다양한 입체배열을 가지는 생리활성 galactoside 화합물을 합성하는데 기여할 수 있는 연구를 진행할 계획이다.
이러한 선행 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 우선 PhE로부터 PhE-gal이 합성되는지를 관찰하는 연구를 수행하였다. 앞으로, PhE-gal의 합성 최적조건 확인, PhE-gal의 분리/정제 연구, 항균력 검증시험과 피부세포 독성 연구 순으로 계속 연구를 진행할 예정이다. 선행연구에 비추어 볼 때, 독성이 감소되고, 항균력은 유지되는 PhE-gal의 특성이 확인될 수 있을 것으로 기대하고 있다.

참고문헌 (15)
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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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