[논문]유근피 추출물의 radical 소거 활성 성분에 대한 LC-MS/MS 스크리닝 분석법

임도연; 이경인

doi:10.5352/jls.2020.30.11.956

[국내논문] 유근피 추출물의 radical 소거 활성 성분에 대한 LC-MS/MS 스크리닝 분석법
LC-MS/MS Screening Method for Radical Scavenging Active Compounds in Extracts of Ulmus pumila Cortex 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.11, 2020년, pp.956 - 964

초록
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액체크로마토그래피 (liquid chromatography; LC) 시스템과 연동된 radical 소거 활성 측정 시스템은 식물 추출물과 같이 수많은 성분으로 구성된 시료 중의 radical 소거 활성 성분을 확인하는 유용한 도구이다. 이와 같은 시스템을 사용하여 항산화 활성 성분을 가지고 있는 생약재로 알려진 유근피의 추출물을 대상으로 DPPH와 ABTS radical 소거 활성을 측정한 후 확인된 소거 활성 성분에 대한 질량분석을 실시하여 procyanidin B2, procyanidin B3, catechin-7-O-β-D-apiofuranoside, catechin-5-O-β-D-apiofuranoside로 각각 추정되는 4가지 성분을 확인하였다. 추출물 시료들 간의 상대적인 함량 비교를 위해 4가지 성분에 대한 MRM mode 분석 조건을 설정하여 LC-MS/MS를 활용한 유근피 추출물 중 radical 소거 활성 성분의 함량 비교 가능성을 검토하였다. 95% 에탄올 추출물을 기준으로 산출한 상대적인 함량 비교 결과에서 추출 용매의 에탄올 농도가 높아지면 radical 소거 활성 성분들의 함량이 높아지는 것으로 나타났으며, 각 추출물의 radical 소거 활성 측정 결과와 마찬가지로 에탄올 농도 50% 이상의 추출물들에서 procyanidin B3로 추정된 성분을 제외한 3가지 성분의 함량 차이가 크게 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과에 각 추출물의 수율을 추가로 감안하여 50% 수준의 에탄올 농도가 유근피의 radical 소거 활성 성분 추출에 더 효과적임을 알 수 있었다. 이와 같은 활성 측정 및 분석 방법을 활용하게 되면 유근피 자체의 품질관리뿐만이 아니라 추출물을 활용하는 다양한 제품 개발 단계에서 기존의 LC-UV 검출기 profile 비교보다 활용도가 높은 방법이 될 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The radical scavenging activity measurement system linked with liquid chromatography (LC) is a useful tool for identifying the radical scavenging active compound in a sample composed of numerous compounds such as plant extracts. Using this system, DPPH and ABTS radical scavenging activity were measured on extracts of Ulmus pumila cortex, which is known as an herbal medicine with antioxidant activity. Mass spectrometry (MS) was performed on the identified radical scavenging active compounds to identify the four components estimated to be procyanidin B2, procyanidin B3, catechin-7-O-β-D-apiofuranoside, and catechin-5-O-β-D-apiofuranoside, respectively. In order to compare the relative contents between extract samples, multiple reaction monitoring (MRM) mode analysis conditions were set for the four compounds in order to examine the possibility of comparing the content of radical scavenging active compounds in Ulmus pumila cortex extract using LC-MS/MS. As a result of the relative content comparison, it was found that the higher the ethanol concentration of the extraction solvent, the higher the content of radical scavenging active compounds. As with the results of measuring the radical scavenging activity of each extract, it was confirmed that the content difference of three of the compounds (all except the compound estimated as procyanidin B3) was not significantly observed in the extracts with an ethanol concentration of 50% or more.

주제어

표/그림 (12)

그림 Fig. 1. Scheme of on-line LC profile and radical scavenging abil-ity measurement system.
표 Table 1. Mass spectroscopy parameters for analysis of major ac-tive peaks
표 Table 2. Extraction yields of extracts of Ulmus pumila cortex
표 Table 3. DPPH and ABTS radical scavenging activities of ex-tracts of Ulmus pumila cortex
그림 Fig. 2. On-line LC radical scavenging effects and major active peaks of the extract of Ulmus pumila cortex. (A) Full scale chromatogram of DPPH and ABTS radical scavenging effect, (B) enlarged chromatogram of DPPH radical scavenging effect (UV-517 nm, negative mode), (C) enlarged chromatogram of ABTS radical scavenging effect (UV-700 nm, negative mode). Different superscript numbers (1~4) are major active peaks.
그림 Fig. 3. LC-MS analysis results of the major active peak 1. (A) negative mode MS spectra of the major peak 1, (B) MS² spectra of m/z 577.1([M-H]^-).
그림 Fig. 4. LC-MS analysis results of the major active peak 2. (A) negative mode MS spectra of the major peak 2, (B) MS² spectra of m/z 577.1([M-H]^-).
그림 Fig. 5. LC-MS analysis results of the major active peak 3. (A) negative mode MS spectra of the major peak 3, (B) MS² spectra of m/z 421.1([M-H]^-).
그림 Fig. 6. LC-MS analysis results of the major active peak 4. (A) negative mode MS spectra of the major peak 4, (B) MS₂ spectra of m/z 421.1([M-H]^-).
그림 Fig. 7. LC-UVD and LC-MS/MS MRM chromatogram of the major active peaks. (A) UV-275 nm chromatogram, (B) LC-MS/MS MRM mode chromatogram.
표 Table 4. Negative ESI mode multiple reaction monitoring con-ditions of LC-MS/MS for major active peaks
표 Table 5. Relative ratio of major active peak area of extracts of Ulmus pumila cortex

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 생약 추출물의 profile 분석과 radical 소거 활성 측정을 동시에 수행하고 활성이 확인된 성분 peak에 대한 LC-MS 분석을 동일한 시스템 및 분리 조건에서 수행한다면 추출물 또는 분획물 수준에서 활성 성분을 특정할 수 있는 data를 얻을 수 있으므로 기존의 방법에 비해 시간과 노력, 시약의 소모량 등을 줄일 수 있으며, 활성 성분 정성분석과 시료들간의 함량 비교에 활용할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 항산화 활성 성분을 가지고 있는 생약재로 알려진 유근피[1, 14, 17]의 추출물을 대상으로 하여 DPPH와 ABTS radical 소거 활성을 LC profile 분석과 동시에 측정한 후 확인된 소거 활성 성분 peak의 MRM mode 분석 조건을 설정하여 LC-MS/MS를 활용한 유근피 추출물 중 radical 소거 활성 성분의 함량 비교 가능성을 검토하였다.
다만, 이와 같이 분리용 column 이후에 radical 용액이 추가되고 반응을 위한 tubing 길이의 영향으로 인해 분리된 성분이 확산되는 등 인접한 성분과의 간섭 현상들이 발생될 수 있다. 따라서 이와 같은 영향을 최소화하기 위해 사전에 radical 농도 및 tubing 조건의 최적화를 수행하여 본 연구를 수행하였다.

제안 방법

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) 라디칼 소거능은 Re 등의 방법을 일부 변형하여 측정하였다[16].
유근피 추출물의 LC profile 확인과 radical 소거능 동시 측정을 위해 LC-30A (Shimadzu, Japan) 액체크로마토그래피와 column으로서 Kinetex C18 (2.1×150 mm, 2.6 μm, Phenomenex, USA)을 기본 장비 구성으로 하여 분석을 실시하였으며, 시료 주입량은 1 μl, column oven은 40℃를 유지하였다.
농도별로 메탄올에 희석시킨 추출물 시료액 20 μl와 ABTS용액 180 μl를 혼합하여 30분간 암소에서 방치한 후 735 nm에서 흡광도를 측정하였다.
유근피(Cortex of Ulmus pumila)는 전남 화순에 위치한 전남생약농업협동조합에서 구입한 것을 blender (Warning, USA)로 분쇄 후 냉장 보관하면서 사용하였다. 분쇄된 유근피 시료 50 g에 정제수, 25% 에탄올, 50% 에탄올, 75% 에탄올, 95% 에탄올을 각각 1 l를 혼합하여 각 용매의 끓는점에서 3시간 동안 추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 감압농축 및 동결건조를 실시한 후 실험에 사용하였다.
시료의 항산화 활성을 확인하기 위해 2,2-Diphenyl-1-pic-rylhydrazyl (DPPH)을 이용하여 라디칼 소거능을 측정하였다[2]. 메탄올에 100 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180 μl와 농도별로 메탄올에 희석시킨 추출물 시료액 20 μl를 혼합한 후 암실에서 20분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
메탄올에 100 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180 μl와 농도별로 메탄올에 희석시킨 추출물 시료액 20 μl를 혼합한 후 암실에서 20분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 메탄올을 사용한 바탕시험을 기준으로 소거능을 산출하였다.
농도별로 메탄올에 희석시킨 추출물 시료액 20 μl와 ABTS용액 180 μl를 혼합하여 30분간 암소에서 방치한 후 735 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 메탄올을 사용한 바탕시험 흡광도를 기준으로 소거능을 산출하였다.
6 μm, Phenomenex, USA)을 기본 장비 구성으로 하여 분석을 실시하였으며, 시료 주입량은 1 μl, column oven은 40℃를 유지하였다. 이동상으로 물 (A)과 메탄올 (B)을 사용하여 초기 2% B에서 시작하여 100% B까지 순차적으로 변화시킨 후 다시 0% B로 낮춰서 60분간 분석을 실시하였으며, 유속은 0.3 ml/min으로 유지하였다. 전체적인 시스템의 구성은 Fig.
Radical 소거 활성 성분에 대한 질량분석에는 LC-30A (Shimadzu, Japan) 액체크로마토그래피와 연동된 LCMS-8050(Shimadzu, Japan) 삼중사중극자 질량분석기를 사용하였으며, LC profile과 radical 소거 활성 동시 측정 조건과 동일한 분리 조건을 적용하여 electro-spray ionization (ESI) 장치로 시료를 이온화시킨 후 Table 1과 같은 조건을 적용하여 분석을 실시하였다.
추출 조건별 radical 소거 활성 측정에서 가장 높은 활성을 나타낸 95% 에탄올 추출물에 존재하는 radical 소거 활성 성분을 확인하기 위해 Fig. 1과 같이 액체크로마토그래피(Liquid chromatography; LC) 기기와 결합된 radical 소거 활성 측정 시스템을 활용하였다. 이와 같은 시스템을 활용하면 LC의 column에서 분리된 성분의 개별적인 radical 소거 활성을 측정할 수 있게 되어 활성 성분의 추적이나 분리, 분석 등에 필요한 자료를 비교적 단시간에 얻을 수 있게 된다[5, 7-9, 19].
본 연구에서 확인된 주요 radical 소거 활성 peak의 질량분석기(mass spectroscopy; MS) spectra를 Fig. 3 ~ Fig.6과 같이 제시하였으며, 상기의 기존 연구보고에서 밝히고 있는 성분들과 비교하여 다음과 같이 각 성분에 대한 검토 결과를 도출하였다. Peak 1의 MS spectra (Fig.
Radical 소거 활성을 가지는 것으로 확인된 성분의 효과적인 분석을 위해 유근피95% 에탄올 추출물로부터 분리된 각 활성 peak의 성분을 사용하여 LC-MS/MS의 multiple reaction monitoring (MRM) mode 분석 조건을 설정하였다. LC-MS/MS의 MRM mode 분석은 설정된 precursor ion으로부터 생성된 product ion만을 검출하는 특성으로 인해 Fig.
설정된 MRM 조건을 적용하여 추출 용매별 유근피 추출물을 분석한 결과를 Table 5에 제시하였다. 각 추출물의 peak별 상대함량은 가장 radical 소거 활성이 높았던 95% 에탄올 추출물의 성분별 peak area를 기준으로 산출하였다. 전반적으로 에탄올 농도가 높아지면 radical 소거 활성 성분들의 함량이 높아지는 것으로 나타났으며, Table 3에 제시한 추출물의 radical 소거 활성 측정 결과와 유사하게 에탄올 농도 50% 이상의 추출물들에서 procyanidin B3로 추정된 peak 1을 제외한 성분들의 함량 차이가 크게 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

대상 데이터

유근피(Cortex of Ulmus pumila)는 전남 화순에 위치한 전남생약농업협동조합에서 구입한 것을 blender (Warning, USA)로 분쇄 후 냉장 보관하면서 사용하였다. 분쇄된 유근피 시료 50 g에 정제수, 25% 에탄올, 50% 에탄올, 75% 에탄올, 95% 에탄올을 각각 1 l를 혼합하여 각 용매의 끓는점에서 3시간 동안 추출을 실시하였다.
MRM 설정에 필요한 precursor ion은 negative mode에서의 모분자 형태인 [M-H]-ion을 선택하였으며, product ion은 MS² spectra에서 상대적으로 높은 감도를 나타낸 3개를 선택하였다. 선택된 ion 조합을 기준으로 collision energy 등의 세부 질량분석 조건 최적화 과정을 거친 후 최종 MRM mode 분석 조건을 Table 4와 같이 설정하였다.

데이터처리

추출 수율을 제외한 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차(mean ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc, Chicago, USA)을 이용하였다.
각 군 간의 측정치 비교는 One-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후 사후분석으로 Duncan's multiple range test를 실시하여 p<0.05 수준에서 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

이론/모형

Radical 소거 활성 측정에는 일반적으로 항산화 활성 관련 연구에서 빈번하게 이용되는 DPPH radical과 ABTS radical 소거능 측정 방법을 활용하였다. 두 가지의 radical 소거능 측정 방법은 각각의 radical 물질과 소거 활성 물질이 결합함으로써 색상이 변하는 정도를 분광학적으로 확인하게 된다.

성능/효과

유근피를 열수와 농도별 에탄올을 용매로 하여 추출물을 제조하여 각 추출 조건별 수율을 측정한 결과를 Table 2에 제시하였다. 열수 추출물과 25% 에탄올 추출물의 수율이 각각 25.82%와 25.17%로 유사한 수준을 나타냈으며, 50% 이상의 에탄올 추출물에서는 에탄올 농도가 높아짐에 따라 추출물의 수율이 낮아지는 경향을 나타내었다.
)를 Table 3에 나타내었다. 두 가지 radical 소거 활성 모두에서 에탄올 농도 50% 이상의 추출물에서 상대적으로 우수한 radical 소거 활성을 가지는 것으로 확인되었으며, 특히 에탄올 농도가 가장 높은 95% 에탄올 추출물이 가장 높은 radical 소거 활성을 나타내었다.
본 연구에서 사용한 측정 시스템에서 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능 측정 결과에서 동일한 양상을 나타내었으며, UV 275 nm 측정 조건에서의 LC profile 분석으로 얻어진 chromatogram 패턴에서 확인된 주요 peak와도 유사한 경향을 보였다. 다만 UV 275 nm에서 1차 측정 후 radical 용액과 반응하는 reaction tubing의 길이로 인하여 0.
2분임을 확인할 수 있었다. 각각의 활성 peak가 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능 측정 결과에서 동일한 retention time을 나타냄에 따라 각 peak가 동일한 성분에 의한 radical 소거 활성 peak임을 확인할 수 있었다.
1 m/z가 확인됨에 따라 모분자량이 578인 성분으로 추정할 수 있었다. 또한 MS² spectra (Fig. 3B)에서 577.1 m/z로부터 생성된 주요 fragment ion으로서 425.1, 407.1, 289.1 m/z가 나타남에 따라 분자량이 290인 catechin의 dimer 형태인 procyanidin B계열의 화합물임을 예상할 수 있었다. Fig.
1 m/z가 나타남에 따라 분자량이 290인 catechin의 dimer 형태인 procyanidin B계열의 화합물임을 예상할 수 있었다. Fig. 4에 제시한 peak 2의 MS spectra (Fig. 4A)와 MS² spectra (Fig. 4B) 경우, peak 1의 질량분석 결과와 동일한 패턴임을 확인할 수 있었으며, 이를 바탕으로 peak 1과 마찬가지로 procyanidin B 계열의 화합물임을 예상할 수 있었다.
Peak 3의 negative mode MS spectra (Fig. 5A)에서 [M-H]^-형태인 421.1 m/z가 확인됨에 따라 모분자량이 422인 성분으로 추정할 수 있었으며, MS² spectra (Fig. 5B)에서 422.1 m/z로부터 생성된 주요 fragment ion으로서 289.1, 245.1, 203.1, 137.1 m/z 등이 확인됨에 따라 분자량이 290인 catechin에 fentose가 결합되어 있는 화합물임을 예상할 수 있었다. Fig.
1 m/z 등이 확인됨에 따라 분자량이 290인 catechin에 fentose가 결합되어 있는 화합물임을 예상할 수 있었다. Fig. 6에 제시한 peak 4의 MS spectra (Fig. 6A)와 MS² spectra (Fig. 6B) 경우, peak 3의 질량분석 결과와 유사한 패턴임을 확인할 수 있었으며, 이를 바탕으로 peak 3과 마찬가지로 catechin에 fentose가 결합되어 있는 화합물임을 예상할 수 있었다. 이와 같은 질량분석 결과와 기존의 유근피 성분 연구 관련 문헌들을 검토하여 peak 1, 2, 3, 4를 각각 procyanidin B3, procyanidin B2, catechin-7-O-β-D-apiofuranoside, catechin-5-O-β-D-apiofuranoside로 추정할 수 있었다[10, 14].
각 추출물의 peak별 상대함량은 가장 radical 소거 활성이 높았던 95% 에탄올 추출물의 성분별 peak area를 기준으로 산출하였다. 전반적으로 에탄올 농도가 높아지면 radical 소거 활성 성분들의 함량이 높아지는 것으로 나타났으며, Table 3에 제시한 추출물의 radical 소거 활성 측정 결과와 유사하게 에탄올 농도 50% 이상의 추출물들에서 procyanidin B3로 추정된 peak 1을 제외한 성분들의 함량 차이가 크게 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과에 Table 2의 추출 수율을 추가로 감안하여 50% 수준의 에탄올 농도가 유근피의 radical 소거 활성 성분 추출에 더 효과적임을 알 수 있었다.
전반적으로 에탄올 농도가 높아지면 radical 소거 활성 성분들의 함량이 높아지는 것으로 나타났으며, Table 3에 제시한 추출물의 radical 소거 활성 측정 결과와 유사하게 에탄올 농도 50% 이상의 추출물들에서 procyanidin B3로 추정된 peak 1을 제외한 성분들의 함량 차이가 크게 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과에 Table 2의 추출 수율을 추가로 감안하여 50% 수준의 에탄올 농도가 유근피의 radical 소거 활성 성분 추출에 더 효과적임을 알 수 있었다. 이상의 연구 결과에서 LC 시스템과 연동된 radical 소거 활성 측정 시스템이 추출물과 같은 복잡한 성분 구성을 가지는 시료 중의 radical 소거 활성 성분을 확인하는 유용한 도구로 사용될 수 있으며, 확인된 성분의 정성분석과 상대적인 함량 비교를 위한 MRM mode의 LC-MS/MS 활용이 효과적임을 알 수 있었다.
이와 같은 결과에 Table 2의 추출 수율을 추가로 감안하여 50% 수준의 에탄올 농도가 유근피의 radical 소거 활성 성분 추출에 더 효과적임을 알 수 있었다. 이상의 연구 결과에서 LC 시스템과 연동된 radical 소거 활성 측정 시스템이 추출물과 같은 복잡한 성분 구성을 가지는 시료 중의 radical 소거 활성 성분을 확인하는 유용한 도구로 사용될 수 있으며, 확인된 성분의 정성분석과 상대적인 함량 비교를 위한 MRM mode의 LC-MS/MS 활용이 효과적임을 알 수 있었다. 이와 같은 방법은 선택적 ion 검출 방법인 MRM mode의 특성으로 인해 기존의 LC-UV 검출기 시스템을 사용한 단순 profile 분석에 비해 활성성분에 대한 검토에 유리하며, 다양한 연구보고들에서 밝히고 있는 MRM조건들을 활용하면 표준품이 없는 성분에 대한 정성이나 시료들 간의 상대적인 함량 비교에 보다 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

후속연구

따라서 생약 추출물의 profile 분석과 radical 소거 활성 측정을 동시에 수행하고 활성이 확인된 성분 peak에 대한 LC-MS 분석을 동일한 시스템 및 분리 조건에서 수행한다면 추출물 또는 분획물 수준에서 활성 성분을 특정할 수 있는 data를 얻을 수 있으므로 기존의 방법에 비해 시간과 노력, 시약의 소모량 등을 줄일 수 있으며, 활성 성분 정성분석과 시료들간의 함량 비교에 활용할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 항산화 활성 성분을 가지고 있는 생약재로 알려진 유근피[1, 14, 17]의 추출물을 대상으로 하여 DPPH와 ABTS radical 소거 활성을 LC profile 분석과 동시에 측정한 후 확인된 소거 활성 성분 peak의 MRM mode 분석 조건을 설정하여 LC-MS/MS를 활용한 유근피 추출물 중 radical 소거 활성 성분의 함량 비교 가능성을 검토하였다.
이상의 연구 결과에서 LC 시스템과 연동된 radical 소거 활성 측정 시스템이 추출물과 같은 복잡한 성분 구성을 가지는 시료 중의 radical 소거 활성 성분을 확인하는 유용한 도구로 사용될 수 있으며, 확인된 성분의 정성분석과 상대적인 함량 비교를 위한 MRM mode의 LC-MS/MS 활용이 효과적임을 알 수 있었다. 이와 같은 방법은 선택적 ion 검출 방법인 MRM mode의 특성으로 인해 기존의 LC-UV 검출기 시스템을 사용한 단순 profile 분석에 비해 활성성분에 대한 검토에 유리하며, 다양한 연구보고들에서 밝히고 있는 MRM조건들을 활용하면 표준품이 없는 성분에 대한 정성이나 시료들 간의 상대적인 함량 비교에 보다 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

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