[논문]다이타이로신 공유결합으로 자기조립된 펩타이드 나노입자의 합성

허윤미; 민경익

doi:10.9713/kcer.2021.59.1.112

다이타이로신 공유결합으로 자기조립된 펩타이드 나노입자의 합성
Synthesis of Self-Assembled Peptide Nanoparticles Based on Dityrosine Covalent Bonds 원문보기

Korean chemical engineering research = 화학공학, v.59 no.1, 2021년, pp.112 - 117

허윤미 (경북대학교 의생명융합공학과) , 민경익 (경북대학교 의생명융합공학과)

초록
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본 연구에서는 생물학적 공유결합인 다이타이로신 결합을 모방하여 비가역적 공유결합을 기반으로 한 펩타이드의 자기조립 방법을 연구하였다. 고밀도의 다이타이로신 결합을 달성하기 위해 Tyr-Tyr-Leu-Tyr-Tyr (YYLYY) 의 서열을 갖는 펩타이드 단량체를 선택하였다. 다이타이로신 결합으로 자기조립 된 펩타이드 나노입자는 가시광선 하에서 Ru(BPY)3Cl2 촉매를 사용하여 단일공정 광가교를 통해 합성되었다. 펩타이드 나노 입자의 크기에 대한 각 성분의 농도 효과는 동적 광산란, UV-Vis 분광법 및 투과 전자 현미경을 사용하여 확인하였다. 이를 통해 130 nm~350 nm범위의 펩타이드 나노입자의 크기별 최적의 합성 조건을 제시하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, a method of self-assembly of peptides based on irreversible covalent bonds was studied by mimicking a biological covalent bond, dityrosine bond. A tyrosine-rich short peptide monomer having the sequence of Tyr-Tyr-Leu-Tyr-Tyr (YYLYY) was selected to achieve a high-density of dityrosine bond. The peptide nanoparticles covalently self-assembled with dityrosine bonds were synthesized by one-step photo-crosslinking of a peptide using a ruthenium catalyst under visible light. The effect of the concentration of each component for the size of the peptide nanoparticle was studied using dynamic light scattering, UV-Vis spectroscopy, and transmission electron microscopy. As a result, the synthesis conditions for size of the peptide nanoparticles ranging from 130 nm to 350 nm were optimized.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Results of peptide nanoparticles synthesized from various compositions
그림 Fig. 1. Chemical structure of tyrosine-rich short peptide (YYLYY) and scheme for the synthesis of peptide nanoparticle through the formation of dityrosine bonds between peptides using Ru(BPY)Cl photo-catalyst under visible light. 32
그림 Fig. 2. Morphology and characteristics of peptide nanoparticles synthesized from 0.5 mg/mL of peptide YYLYY monomer, 0.1 mM of Ru(BPY)₃Cl₂, and 6 mM of APS under visible light for 500 sec. a, b) TEM images, c) size distribution, and d) SEM image of the peptide nanoparticles. e) UV-Vis spectra of peptide monomer (gray) and covalently cross-linked peptide nanoparticle (Black). f) Time-dependent UV absorption pro-file at 330 nm.
그림 Fig. 3. TEM images and DLS results of peptide nanoparticles as a function of various concentrations of Ru(BPY)₃Cl₂ a) 0.025, b) 0.05, c) 0.1, d) 0.2, e) 0.4, f) 1 mM, while the concentration of peptide and APS were fixed at 0.5 mg/mL and 6 mM, respectively.
그림 Fig. 4. TEM images and DLS results of peptide nanoparticles as a function of various concentrations of peptide a) 0.125, b) 0.25, c) 1, d) 2 mg/mL, while the concentration of Ru(BPY)₃Cl₂ and APS were fixed at 0.1 and 6 mM, respectively.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구에서는 펩타이드 자기조립의 한계를 극복하기 위해 생물학적 공유결합인 다이타이로신(dityrosine) 결합을 모방하여 비가역적 공유결합 기반 펩타이드 자기조립법을 연구하였다. 다이타이로신 결합은 생체 내 구조 단백질을 안정화하는 대표적인 생물학적 공유 결합 시스템으로, 두 개의 타이로신이 결합 구조를 형성하여 단백질의 물리적, 화학적 저항성을 증가시킨다[8-10].
기존의 펩타이드 자기조립 구조체는 분자간의 비공유결합을 유도하기 위하여 복잡한 다단계 합성 과정을 통해 특정한 분자(예: 양친매성, 이온성, 파이 결합 유도기)를 설계하여 진행되어 왔다[1, 11]. 본 실험에서는 일반적인 비공유결합 방식이 아닌, 생물학적 공유 결합 중의 하나인 다이타이로신 결합을 모방하여 복잡한 화학적 설계 과정 없이 펩타이드 내에 있는 타이로신 잔기들 사이의 비가역적 공유결합을 통해서 나노입자를 합성하는 방법을 연구하였다. Fig.
본 연구에서는 타이로신이 많이 포함된 짧은 사슬 펩타이드인 YYLYY 서열 펩타이드 단량체의 광가교 반응을 통해 다이타이로신 결합으로 이루어진 공유결합성 펩타이드 나노입자를 합성하는 방법을 연구하였다. 또한 펩타이드 단량체와 Ru(BPY)₃Cl₂의 농도가 펩타이드 나노입자의 크기와 균일도에 미치는 영향을 평가하였고, 용액의 조성에 따라 합성된 나노입자의 크기를 제어할 수 있었다.

제안 방법

Ru(BPY)₃Cl₂ 농도가 펩타이드 나노입자 형성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 펩타이드의 농도와 APS의 최종 농도를 각각 0.5 mg/mL, 6 mM로 고정하고, Ru(BPY)₃Cl₂ 용액의 농도(entry no. 1~6)를 변화하여 형성된 나노입자의 크기를 분석하였다. Fig.
1에 고밀도의 다이타이로신 결합을 형성하기 위한 Tyr-Tyr-Leu-Tyr-Tyr (YYLYY) 서열의 펩타이드 단량체 구조와 합성 방법을 나타내었다. 다이타이로신 결합으로 자기조립 된 펩타이드 나노입자는 잘 알려진 Ru(BPY)₃Cl₂ 촉매와 APS를 사용하여 가시광선 하에서 광 가교를 통해 합성하였다[12-14]. Ru(BPY)₃Cl₂ 촉매와 APS는 가시광선의 빛 에너지를 받아 산화환원 반응을 통해 라디칼을 형성하고, 이때 타이로신 잔기인 페놀(phenol)의 산화 및 라디칼을 형성하면서, 두 분자의 타이로신이 결합하게 한다[12-14].
연구하였다. 또한 펩타이드 단량체와 Ru(BPY)₃Cl₂의 농도가 펩타이드 나노입자의 크기와 균일도에 미치는 영향을 평가하였고, 용액의 조성에 따라 합성된 나노입자의 크기를 제어할 수 있었다. 또한 광가교 반응의 시간에 따른 펩타이드 나노입자의 크기 및 형태의 변화를 확인하여 5분이내에 나노입자가 빠르게 형성되는 것을 확인하였고, 이를 통해 130 nm ~ 350 nm범위의 펩타이드 나노입자의 크기별 최적의 합성 조건을 제시하였다.
먼저, 펩타이드 단량체의 공유적 상호작용에 의한 자기조립 펩타이드 나노입자의 형성 유무를 확인하기 위하여, 펩타이드, Ru(BPY)₃Cl₂, APS의 농도를 각각 0.5 mg/mL, 0.1 mM, and 6 mM (entry no. 3)로 설정하여 광가교반응을 진행하였고, DLS, TEM, UV-Vis 분광법으로 분석하였다. Fig.
기존의 보고에서는 Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Tyr (YYAYY) 서열의 펩타이드 단량체로 131 ~ 315 nm 크기의 펩타이드 나노입자를 만든 연구가 보고되었다[15]. 본 연구에서는 가운데 알라닌 아미노산이 아이소뷰틸 작용기를 가지는 류신으로 치환된 펩타이드를 사용함으로써 보다 더 소수성을 띠게 하였다.
다이타이로신 결합은 생체 내 구조 단백질을 안정화하는 대표적인 생물학적 공유 결합 시스템으로, 두 개의 타이로신이 결합 구조를 형성하여 단백질의 물리적, 화학적 저항성을 증가시킨다[8-10]. 본 연구에서는 고밀도의 다이타이로신 결합을 이룰 수 있도록 Tyr-Tyr-Leu- Tyr-Tyr (YYLYY) 의 서열을 가지는 펩타이드 단량체를 선정하여, 합성에 사용되는 광촉매와 펩타이드의 농도에 따른 나노 구조체의 모양, 크기, 균일도 영향을 비교하였고, 시간에 따른 펩타이드 광 가교 과정을 분석하였다. 최적화된 광촉매 단일 공정으로 펩타이드를 고분 자화함으로써, 수분 안에 공유결합 기반 펩타이드 자기조립 나노입자를 합성하였다.
각 구성성분의 최종 농도는 Table 1에 나타내었다. 상기 혼합 용액을 직경이 1 cm인 석영 관에 담고, 상온에서 10 cm 거리의 백색광 램프(OSRAM, DULUX 1.LED, 18 W, 2개) 빛에 시간에 따라 노출 시켰다. 광가교 반응이 끝난 펩타이드 혼합액은 생성된 펩타이드 나노입자를 분리하기 위하여 13, 500 rpm에서 2분간 원심 분리하고, 침전된 샘플을 회수하여 증류수로 세척하는 과정을 3번 반복한 후 다시 증류수에 분산시켰다.
펩타이드 나노입자의 크기와 모양 분석을 위해 세척 후의 펩타이드 나노입자 용액 10 μL를 200-mesh 탄소 코팅 구리 그리드와 실리콘 웨이퍼 조각에 각각 떨어뜨리고, 1~5 분간 보존한 후에 건조시켰다. 준비된 시료는 70^oC 오븐에서 72 시간 동안 완벽히 건조된 후 TEM 및 FE-SEM을 이용하여 분석하였다.
본 연구에서는 고밀도의 다이타이로신 결합을 이룰 수 있도록 Tyr-Tyr-Leu- Tyr-Tyr (YYLYY) 의 서열을 가지는 펩타이드 단량체를 선정하여, 합성에 사용되는 광촉매와 펩타이드의 농도에 따른 나노 구조체의 모양, 크기, 균일도 영향을 비교하였고, 시간에 따른 펩타이드 광 가교 과정을 분석하였다. 최적화된 광촉매 단일 공정으로 펩타이드를 고분 자화함으로써, 수분 안에 공유결합 기반 펩타이드 자기조립 나노입자를 합성하였다.
펩타이드 혼합 용액이 담긴 석영 관을 백색광 램프에 노출시킨 시간에 따라 반응을 중지시키고 곧바로 UV-Vis 스펙트럼을 측정하였고, 다이타이로신 결합 형성은 펩타이드 용액의 시간에 따른 330 nm 흡광도 측정을 통해 확인하였다. 펩타이드 나노입자의 크기와 분포는 세척 전의 펩타이드 광 반응액 100 μL와 증류수 800 μL을 큐벳에서 혼합하여 희석액을 제조해 DLS를 사용하여 측정하였다. 펩타이드 나노입자의 크기와 모양 분석을 위해 세척 후의 펩타이드 나노입자 용액 10 μL를 200-mesh 탄소 코팅 구리 그리드와 실리콘 웨이퍼 조각에 각각 떨어뜨리고, 1~5 분간 보존한 후에 건조시켰다.
펩타이드 나노입자의 합성을 위해 200 μL의 Ru(BPY)₃Cl₂ (0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 및 5 mM), 600 μL의 10 mM APS 수용액, 200 μL의 pH 10 완충 용액 에 녹인 YYLYY 서열 펩타이드 용액(0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 mg/mL)을 혼합하여 총 1 mL의 펩타이드 나노입자 합성용액을 제조하여 실험을 진행하였다. 각 구성성분의 최종 농도는 Table 1에 나타내었다.
펩타이드 혼합 용액이 담긴 석영 관을 백색광 램프에 노출시킨 시간에 따라 반응을 중지시키고 곧바로 UV-Vis 스펙트럼을 측정하였고, 다이타이로신 결합 형성은 펩타이드 용액의 시간에 따른 330 nm 흡광도 측정을 통해 확인하였다. 펩타이드 나노입자의 크기와 분포는 세척 전의 펩타이드 광 반응액 100 μL와 증류수 800 μL을 큐벳에서 혼합하여 희석액을 제조해 DLS를 사용하여 측정하였다.
펩타이드의 농도가 펩타이드 나노입자 크기에 미치는 영향을 분석하기 위하여 APS 와 Ru(BPY)₃Cl₂의 최종 농도를 각각 6 mM, 0.5 mM로 고정한 상태에서, 펩타이드의 농도(entry no. 7~10) 를변화하여 형성된 나노입자의 크기를 분석하였다. Fig.

대상 데이터

시약으로서 YYLYY 서열 펩타이드(순도 98%)는 GL Biochem (China)에서, 트리스 2, 2’-바이피리딜디클로로루테늄(II) 헥사 하이드레이트(Tris(2, 2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate, Ru (BPY)₃Cl₂)와 과황산암모늄(ammonium persulfate, APS)는 Sigma Aldrich사에서, pH 10 완충 용액은 Samchun chemical 사에서, 투과전자현미경 분석에 사용된 그리드(FC-200 mesh Cu)는 Ted Pella 사에서 각각 구입하여 사용하였다.

데이터처리

광가교 반응이 끝난 펩타이드 혼합액은 생성된 펩타이드 나노입자를 분리하기 위하여 13, 500 rpm에서 2분간 원심 분리하고, 침전된 샘플을 회수하여 증류수로 세척하는 과정을 3번 반복한 후 다시 증류수에 분산시켰다. 모든 실험은 3번 반복으로 진행하였으며, 평균값으로 표시하였다.

이론/모형

펩타이드 나노입자의 특성 파악을 위하여, 광가교 반응 시간에 따른 자외선 및 가시광선 분광분석법(UV-Vis spectrophotometer, Nanodrop 2000c, Thermo Fisher Scientific), 동적광산란광도계 (Dynamic light scattering, DLS, ELSE-2000, Otsuka electronics, Japan), 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM, Hitachi, HT 7700) 및 전계방사형 주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscop, FE-SEM, Hitachi SU8220)을 사용하였다. 펩타이드 혼합 용액이 담긴 석영 관을 백색광 램프에 노출시킨 시간에 따라 반응을 중지시키고 곧바로 UV-Vis 스펙트럼을 측정하였고, 다이타이로신 결합 형성은 펩타이드 용액의 시간에 따른 330 nm 흡광도 측정을 통해 확인하였다.

성능/효과

1~6)를 변화하여 형성된 나노입자의 크기를 분석하였다. Fig. 3의 루테늄 농도 변화에 따른 펩타이드 나노 입자 크기의 변화를 살펴보면, 0.05 mM의 루테늄 농도에서는 141.8 ± 37.1 nm, 0.1 mM 에서는 183.2 ± 55.1 nm, 0.2 mM 에서는 229.1 ± 52.7 nm, 0.4 mM 에서는 277.9 ± 36.1 nm 크기의 비교적 균일한 펩타이드 나노 입자가 형성되었음을 확인하였다. 전체적으로 Ru(BPY)₃Cl₂의 농도가 증가함에 따라 펩타이드 나노 입자의 크기가 소폭 증가하는 양상을 보였다.
또한 펩타이드 단량체와 Ru(BPY)₃Cl₂의 농도가 펩타이드 나노입자의 크기와 균일도에 미치는 영향을 평가하였고, 용액의 조성에 따라 합성된 나노입자의 크기를 제어할 수 있었다. 또한 광가교 반응의 시간에 따른 펩타이드 나노입자의 크기 및 형태의 변화를 확인하여 5분이내에 나노입자가 빠르게 형성되는 것을 확인하였고, 이를 통해 130 nm ~ 350 nm범위의 펩타이드 나노입자의 크기별 최적의 합성 조건을 제시하였다. 본 연구에서 다뤄진 방법은 짧은 펩타이드의 자기 조립에 대한 대안 중 하나로서 펩타이드 기반 기능성 나노 물질 합성으로의 활용 가능성을 시사하며, 생명공학, 의학 등의 다양한 분야에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
025 및 1 mM에서 합성된 결과물은 균일하지 않은 응집체를 형성하였다. 이를 통해 나노스케일에서 크기 및 모양이 재현성있게 잘 정의된 구조를 합성하기 위해서는 0.05 mM 에서 0.4 mM 사이의 Ru(BPY)₃Cl₂ 농도를 사용해야 한다는 합성 조건을 확인하였다.
11)을 광조사 하였을 때는 어떠한 나노구조체도 형성되지 않았음을 확인하였다. 이를 통해, pH 10 완충 용액에 녹아 있는 펩타이드는 어떠한 자기조립 나노구조체가 형성되지 않았으므로, Ru(BPY)₃Cl₂의 광가교 개시에 의해 펩타이드 나노입자가 형성되었다는 것을 알 수 있었다. Fig.
2 nm 크기의 펩타이드 나노 입자가 형성되었다. 이를 통해, 펩타이드 농도가 증가함에 따라 나노 입자의 크기도 증가하는 것을 알 수 있었다. 한편, 0.
1 nm 크기의 비교적 균일한 펩타이드 나노 입자가 형성되었음을 확인하였다. 전체적으로 Ru(BPY)₃Cl₂의 농도가 증가함에 따라 펩타이드 나노 입자의 크기가 소폭 증가하는 양상을 보였다. 이러한 결과는 Ru(BPY)₃Cl₂ 농도가 증가할수록 라디칼이 많이 형성되어 펩타이드의 성장을 향상시키기 때문으로 보인다.
이는 광가교에 의한 합성 과정에서 비가역적으로 타이로신들이 결합되어 펩타이드 분자가 자체 오류 수정을 거치지 않고 펩타이드 나노입자로 성장되었기 때문이다[15]. 한편, 비교 반응으로서 pH 10 완충 용액에 녹인 펩타이드 용액(entry no. 11)을 광조사 하였을 때는 어떠한 나노구조체도 형성되지 않았음을 확인하였다. 이를 통해, pH 10 완충 용액에 녹아 있는 펩타이드는 어떠한 자기조립 나노구조체가 형성되지 않았으므로, Ru(BPY)₃Cl₂의 광가교 개시에 의해 펩타이드 나노입자가 형성되었다는 것을 알 수 있었다.

후속연구

또한 광가교 반응의 시간에 따른 펩타이드 나노입자의 크기 및 형태의 변화를 확인하여 5분이내에 나노입자가 빠르게 형성되는 것을 확인하였고, 이를 통해 130 nm ~ 350 nm범위의 펩타이드 나노입자의 크기별 최적의 합성 조건을 제시하였다. 본 연구에서 다뤄진 방법은 짧은 펩타이드의 자기 조립에 대한 대안 중 하나로서 펩타이드 기반 기능성 나노 물질 합성으로의 활용 가능성을 시사하며, 생명공학, 의학 등의 다양한 분야에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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