PCR 법을 이용한 농산물 중 Clostridium perfringens 검출을 위한 전처리법 확립 Establishment of Sample Preparation Method for PCR Detection of Clostridium perfringens from Agricultural Products원문보기
본 연구에서는 PCR법을 이용하여 농산물 중 enterotoxin 생성 Clostridium perfringens를 신속 분석할 수 있도록 전 처리법을 확립하고자 수행하였다. 이를 위하여 C. perfringens 포자를 상추, 토마토, 고추, 들깻잎에 102, 103, 104, 105, 106, 107 spore/g 농도로 포자를 접종하였다. 포자가 접종된 농산물들은 pulsifier, stomacher, sonicator로 처리하고 boiling법 혹은 상용화 된 kit로 DNA를 추출한 후 PCR법을 수행하고 검출한계를 비교하였다. 그 결과, 3가지 전처리법에 있어서는 pulsifier가, DNA 추출에 있어서는 상용화된 DNA 추출 kit를 활용하는 것이 농산물 중 C. perfringens의 검출한계를 10-100배 낮출 수 있었다. 특히 들깻잎, 방울토마토처럼 전처리 방법에 따른 탁도의 변화가 큰 농산물은 전처리법과 DNA 추출법이 PCR 반응에 미치는 영향이 큰 것으로 나타났다. 따라서 본 연구 결과를 통해 볼 때 PCR법을 이용한 농산물 중 C. perfringens를 검출하는데 있어 검출감도를 높이기 위해서는 pulsifier를 이용하여 전처리하고 상용화된 DNA 추출 kit를 사용하는 것이 적절한 것으로 판단된다.
본 연구에서는 PCR법을 이용하여 농산물 중 enterotoxin 생성 Clostridium perfringens를 신속 분석할 수 있도록 전 처리법을 확립하고자 수행하였다. 이를 위하여 C. perfringens 포자를 상추, 토마토, 고추, 들깻잎에 102, 103, 104, 105, 106, 107 spore/g 농도로 포자를 접종하였다. 포자가 접종된 농산물들은 pulsifier, stomacher, sonicator로 처리하고 boiling법 혹은 상용화 된 kit로 DNA를 추출한 후 PCR법을 수행하고 검출한계를 비교하였다. 그 결과, 3가지 전처리법에 있어서는 pulsifier가, DNA 추출에 있어서는 상용화된 DNA 추출 kit를 활용하는 것이 농산물 중 C. perfringens의 검출한계를 10-100배 낮출 수 있었다. 특히 들깻잎, 방울토마토처럼 전처리 방법에 따른 탁도의 변화가 큰 농산물은 전처리법과 DNA 추출법이 PCR 반응에 미치는 영향이 큰 것으로 나타났다. 따라서 본 연구 결과를 통해 볼 때 PCR법을 이용한 농산물 중 C. perfringens를 검출하는데 있어 검출감도를 높이기 위해서는 pulsifier를 이용하여 전처리하고 상용화된 DNA 추출 kit를 사용하는 것이 적절한 것으로 판단된다.
This study was undertaken to compare the efficacy of different sample preparation (stomaching, pulsifying, and sonication) and DNA extraction methods (boiling and commercial kit) for detection of enterotoxin-producing Clostridium perfringens from produce by polymerase chain reaction (PCR). Each prod...
This study was undertaken to compare the efficacy of different sample preparation (stomaching, pulsifying, and sonication) and DNA extraction methods (boiling and commercial kit) for detection of enterotoxin-producing Clostridium perfringens from produce by polymerase chain reaction (PCR). Each produce type was inoculated at concentrations of 102, 103, 104, 105, 106, and 107 spores/g. Produce inoculated with spores was treated with three sample preparation methods, and DNA was extracted by boiling method and a commercial kit, followed by PCR. The detection limit of stomached samples was lower than that of pummeled and sonicated samples by 10-100 times. Moreover, the DNA extraction efficiency of the commercial kit was found to be superior to that of boiling. In particular, the PCR efficiency of cherry tomato and perilla leaf samples was greatly affected by sample preparation and DNA extraction method. These data suggest that DNA extraction with a commercial kit after pulsification is an optimum sample preparation method for detection of C. perfringens by PCR.
This study was undertaken to compare the efficacy of different sample preparation (stomaching, pulsifying, and sonication) and DNA extraction methods (boiling and commercial kit) for detection of enterotoxin-producing Clostridium perfringens from produce by polymerase chain reaction (PCR). Each produce type was inoculated at concentrations of 102, 103, 104, 105, 106, and 107 spores/g. Produce inoculated with spores was treated with three sample preparation methods, and DNA was extracted by boiling method and a commercial kit, followed by PCR. The detection limit of stomached samples was lower than that of pummeled and sonicated samples by 10-100 times. Moreover, the DNA extraction efficiency of the commercial kit was found to be superior to that of boiling. In particular, the PCR efficiency of cherry tomato and perilla leaf samples was greatly affected by sample preparation and DNA extraction method. These data suggest that DNA extraction with a commercial kit after pulsification is an optimum sample preparation method for detection of C. perfringens by PCR.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 PCR법을 이용하여 농산물 중 enterotoxin 생성 C. perfringens를 신속 분석할 수 있도록 전처리법을 비교 평가하였다.
제안 방법
또한 PCR thermal cycler의 반응 조건은 pre-denaturation 94 C 에서 5분, denaturation 94 C에서 1분, annealing 각각 55 C에서 30초, extension 72 C에서 1분간 30 cycle을 진행하고, final extension을 72 C에서 7분간 실시하였다. PCR에 의한 증폭생성물은 1.8% agarose gel 전기영동에 의해 확인하였다.
농산물 중 C. perfringens를 PCR법으로 검출하기 위하여 전처리법을 확립하였다. 본 연구에 사용된 균주는 C.
pre-mix 에는 reaction buffer, taq polymerase가 함유되어 있어 10pM primer 와, 5μL의 DNA를 첨가하고 3차 멸균 증류수를 사용하여 최종 반응용액을 20 μL로 조절하였다. 또한 PCR thermal cycler의 반응 조건은 pre-denaturation 94 C 에서 5분, denaturation 94 C에서 1분, annealing 각각 55 C에서 30초, extension 72 C에서 1분간 30 cycle을 진행하고, final extension을 72 C에서 7분간 실시하였다. PCR에 의한 증폭생성물은 1.
이후 DNA는 Inclone사의 DNA 추출 kit (G-spin Genomic DNA Extraction Kit, Intron, Korea)를 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 추출하였다. 또한 PCR 방법으로 α-toxin과 enterotoxin 생성유전자를 검출하였다. α-toxin 유전자를 검출하기 위한 primer 서열은 Augustynowicz 등의 연구를, enterotoxin 유전자를 검출하기 위한 primer 서열은 Miki 등의 연구를 참고하여 제작하였다.
유전자 추출 방법에 따른 농산물 중 C. perfringens의 PCR검출한계를 비교하였다. Fig.
유전자 추출법에 따른 농산물 중 C. perfringens의 PCR 검출한계를 비교하기 위하여 상추, 토마토, 고추, 들 깻잎에 포자 농도 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 spore/g농도로 접종하였다. 포자가 접종된 농산물들은 pulsifier로 15초간 처리하였다.
포자가 접종된 농산물들은 pulsifier로 15초, stomacher 2분, sonicator 2분간 처리하였다. 이후 DNA는 Inclone사의 DNA 추출 kit (G-spin Genomic DNA Extraction Kit, Intron, Korea)를 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 추출하였다. 또한 PCR 방법으로 α-toxin과 enterotoxin 생성유전자를 검출하였다.
전처리법 확립을 위하여 포자농도 10 CFU/g농도로 접종된 상추, 토마토, 고추, 들깻잎을 pulsifier, stomacher, sonicator로 처리하였다. 이후 cpa 유전자 증폭 결과 고추, 상추의 검출한계는 전처리 방법에 따른 차이가 없었다(Fig.
대상 데이터
perfringens를 PCR법으로 검출하기 위하여 전처리법을 확립하였다. 본 연구에 사용된 균주는 C. perfringens H3 (Hobb's serotypes 3, NTCT 8239)를 사용하였으며 C. perfringens는 혐기성 세균으로 자연환경 속에서는 대부분 포자형태로 존재하기 때문에 포자 상태로 농산물에 접종하여 본 연구를 수행하였다.
이론/모형
반응액은 13, 000 rpm, 5분 원심분리 후 상등액 200 μL를 취하여 PCR에 사용하였다. DNA extraction kit 사용한 추출법은 Intron사의 매뉴얼에 따라 실험을 하였다. 이후 PCR 조건은 앞서 언급한 바와 같다.
포자가 접종된 농산물들은 pulsifier로 15초간 처리하였다. DNA추출방법은 boiling법과 DNA extraction kit를 사용한 방법 두 가지를 적용하였다. Boiling법은 전처리 용액 10mL를 취하여 4, 000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다.
또한 PCR 방법으로 α-toxin과 enterotoxin 생성유전자를 검출하였다. α-toxin 유전자를 검출하기 위한 primer 서열은 Augustynowicz 등의 연구를, enterotoxin 유전자를 검출하기 위한 primer 서열은 Miki 등의 연구를 참고하여 제작하였다. PCR 반응 용액은 Intron 사의 PCR pre-mix (Intron, Korea)를 사용하였다.
성능/효과
. C. perfringens가 분비하는 장독소는 대장균의 장독소와 유사하며 주 증상은 설사로 경과는 비교적 짧은 편이다 . 국내에서 C.
따라서 토마토와 들깻잎에서는 3가지 방법 중 pulsifier가 가장 PCR 검출한계를 낮출 수 있다. cpe 유전자 증폭 결과 토마토 전처리법에 따른 검출한계는 stomacher 1.1×10 spore/g, pulsifier와 sonicator는 1.1×10 spore/g이었고, 고추는 stomacher, sonicator 8.4×10 spore/g, pulsifier 8.4×10 spore/g이었다 (Fig. 2). 상추의 전처리법에 따른 검출한계는 sonicator 3.
15, 541 NTU로 전처리 후 탁도가 상당히 증가하였고 전처리 후 탁도를 형성하는 농산물 부서러기, 거품 및 농산물추출액은 PCR, ATP 측정 등 미생물 분석에 영향을 줄 수 있다고 보고 하였다. 따라서 들깻잎과 같은 엽채류는 표면적이 넓고 샘플 표면이 서로 겹쳐서 초음파가 도달하기 어렵고 stomacher 후 탁도를 높게 형성하기 때문에 pulsifier 와 같은 전처리 후 탁도가 낮고 진동이 충분히 전달되어 농산물표면으로부터 식중독세균의 탈리가 용이한 방법을 선택하는 것이 적절할 것으로 판단된다.
7 log CFU/cm 정도 낮았다. 또한 방울토마토 추출액에 15분 동안 식중독세균을 노출하였을 때 0.3-0.5 log CFU/mL 정도 감소하였다. 따라서 방울토마토의 경우는 pulsifier나 sonicator처럼 농산물을 파괴하지 않고 표면에 존재하는 식중독세균을 회수할 수 있는 방법으로 전처리한 후 PCR법 등 식중독세균 분석법에 적용하는 것이 필요하다.
1×10 spore/g이었다. 또한 상추에서 cpa 유전자 증폭시 kit 법의 검출한계는 3.1×10 spore/g, boiling 법은 3.1×10 spore/g이었고, 들깻잎에서는 각각 7.0×10 spore/g, 7.0×10 spore/g로 나타나 전반적으로 boiling 법에 비하여 kit 로 추출하였을 때 검출한계를 10-100배 가량 낮출 수 있었다. 일반적으로 DNA 추출 방법에는 세포 파괴, DNA 추출 및 DNA 정제의 세 가지 주요 단계가 포함되는데 boiling 법은 가장 쉽고 저렴한 방법이지만 DNA 정제과정을 거치지 않기 때문에 DNA 수율과 순도가 낮은 단점이 있다17-19)고 알려져 있다.
후속연구
농산물은 다양한 형태, g당 표면적, 내부구성물질에 따라 전처리법을 표준화하는 것이 필요하며 추후 PCR법 등 다양한 식중독세균분석법에 연계할 수 있는 사과, 수박 등 크기가 큰 농산물에 대한 전처리법에 대한 연구가 필요하다.
뿐만 아니라 에탄올을 사용하여 DNA를 세척하여 불순물과 오염 물질을 제거하기 때문에 여러 연구자들은 상용화된 DNA 추출 kit를 사용하여 식품 및 환경에서 직접 미생물의 DNA를 추출하는 것이 적합하다고 보고하였다 . 따라서 PCR법으로 농산물 중 C. perfirngens를 검출하기 위해서는 농산물로부터 탈리가 용이하고 농산물 부스러기 및 내부 구성 물질이 유출되지 않는 방법으로 전처리하여 DNA 추출 kit를 활용하여 DNA를 추출한다면 PCR 의 효율을 높일 수 있을 것으로 판단된다.
일반적으로 DNA 추출 방법에는 세포 파괴, DNA 추출 및 DNA 정제의 세 가지 주요 단계가 포함되는데 boiling 법은 가장 쉽고 저렴한 방법이지만 DNA 정제과정을 거치지 않기 때문에 DNA 수율과 순도가 낮은 단점이 있다17-19)고 알려져 있다. 또한 boiling 법은 DNA에 부착된 농산물 유래 PCR 억제제를 제거할 수 있는 과정이 없기 때문에 농산물에서 유래된 PCR 억제제로 인하여 검출한계를 높일 수 있을 것으로 판단된다. .
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