[논문]Dexamethasone으로 유도한 근위축 세포모델에서 흑효모 배양물 유래 polycan의 근위축 개선에 대한 효과

황수진; 임종민; 구본화; 천다미; 정유진; 김영숙; 오태우

doi:10.14374/hfs.2021.29.1.45

Dexamethasone으로 유도한 근위축 세포모델에서 흑효모 배양물 유래 polycan의 근위축 개선에 대한 효과
Effects of polysaccharide (polycan) derived from black yeast in dexamethasone-induced muscle atrophy cell model 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.29 no.1, 2021년, pp.45 - 55

황수진 (대구한의대학교 제약공학과) , 임종민 ((주)글루칸) , 구본화 ((주)글루칸) , 천다미 ((주)글루칸) , 정유진 (한국화학연구원 정밀화학융합기술연구센터) , 김영숙 ((주)글루칸) , 오태우 (한국한의학연구원 한의기술응용센터)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This study was conducted to evaluate the anti-atrophic effect of polycan in dexamethasone-induced skeletal muscle atrophy in vitro model. Methods : C2C12 myoblast were differentiated into myotube by 2% horese serum medium for 6 days, and then treated polycan extract at different concentrations for 24h. The effect of dexamethasone on the induction of muscle atrophy and expression of atrophy-related genes in differentiated C2C12 myotubes using a GSH, ROS, real-time PCR, western blots analysis. Results : The results showed that Treatment with polycan (100 and 200 ㎍/㎖) noncytotoxic levels on both myoblast and myotube. Polycan decreased the ROS level overproduced with dexamethasone and improved the depletion of GSH level. Dexamethasone showed a decrease in myotube diameter, which was associated with up-regulation muscle-specific ubiquitin ligases markers, such as atrogin-1, FoxO3, myostatin and muscle RING finger-1 (MuRF1), and down-regulation of myogenin, MEF2, Myogenic regulatory factor 5, 6 and MyoD. The results showed that polycan treatment significantly dose-dependently inhibited it. Furthermore, decreased expressions of PI3K/Akt signal pathway by dexamethasone were reversed by treatment with polycan. Conclusions : Thus, polycan suppresses dexamethasone induced muscle atrophy in C2C12 myotube in vitro model through activation of PI3K/Akt pathway and protective effect of improve skeletal muscle function.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Specific primer sequences for PCR
그림 Fig. 1. Cell viability of C2C12 cells treated polycan extract. (A) Cytotoxic effects of polycan in C2C12 myoblast cell. (B) Cytotoxic effects of polycan in C2C12 myotube cell.
그림 Fig. 2. The Effect of polycan on GSH(A) and ROS(B) levels in C2C12 myotubes. C2C12 cells were treated with dexamethasone (10 uM) with various concentration of polycan (0, 100 and 200 ㎍/㎖) for 24h. Values are means SEM of two different preparations with quadruplicate experiments. ^###p<0.001 vs. CTL ; ^**p<0.01 and ^***p<0.001 vs. Dex group.
그림 Fig. 3. Effect of polycan on the Dexamethasone induced muscle atrophy in C2C12 myotube. Total RNAs were extracted using Trizol reagent and mRNA was measured using qRT-PCR. The fold changes relative to the control were calculated using the ΔΔCT method for mRNA expression levels of muscle-specific transcription genes. Values are means SEM of two different preparations with quadruplicate experiments. ^#p<0.05, ^##p<0.01 and ^###p<0.001 vs. CTL ; *p<0.05 and ***p<0.001 vs. Dex group.
그림 Fig. 4. atrophy-related proteins in dexamethasone treated C2C12 myotubes. The expression of FoxO3 α, MuRF1 and PI3k/Akt proteins was assayed by western blot in cells treated with Polycan in the absence or presence of 10μM dexamethasone for 24 h. The intensity of the protein band was normalized against the internal control β-actin. Values are means SEM of two different preparations with quadruplicate experiments. ^#p<0.05, ^##p<0.01 and ^###p<0.001 vs. CTL ; **p<0.01 and ***p<0.001 vs. Dex group.

AI 본문요약
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문제 정의

또한 골격근에서 특이적으로 발현되는 F-box type E3 ligase 인 MAFbx/atrogin-1 및 Ring Finger 유형의 E3 ligase인 MuRF1은 근위축을 유발하는 다양한 조건에서 증가하여 세포주기 억제 및 근육 특이적인 유전자발현의 활성화를 통한 myogenic differentiation에관여하는 myogenin과 MyoD의 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다^{1, 3, 8, 27)}. 따라서 본 연구에서는 dexamethasone에 의하여 유발된 근위축 현상에서 polycan의 효능이 근육세포 생성 및 분해에 관여하는 전사인자에 대하여 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. Fig.
특히 Aureobasidium pullulans 균주에 의하여 생산된 β-glucan인 polycane β -1, 3/1, 6- 결합의 분자 구조를 가짐으로써 THP-1 cell을 자극하여 면역을 활성시키는 인지 및 염증성사이토카인을 감소시키는 생리활성 촉진 능력이 우수하다고 알려져 있다²⁴⁾. 따라서 본 연구에서는 근아세포 (myoblast)에서 근관세포(myotube)로의 분화과정을 구축하고, 분화가 유발된 myotube에서 dexamethasone 을 이용하여 인위적인 근위축 유도한 모델에 polycan 의 효능을 평가하였다.
본 연구에서는 dexamethasone을 처리한 근위축모델에서 β-glucan인 polycan의 근 감소효과를 확인하였다. Polycan이 근육세포에 독성을 유발하지 않으면서 dexamethasone으로 유도된 근위축 세포모델에서 PI3K/Akt 신호전달경로를 통하여 단백질 생성및 분해에 관여하는 ubiquitin-proteasome 시스템에작용함으로써 근위축으로부터 근관세포를 보호하는효능을 가진다는 것을 입증하였다.
따라서 최근 근육건강에 대한 관심이 증가하면서, 건강기능식품 또는 건강 보조식품을 통하여 실제로 운동을 하지않아도 운동효과를 나타낼 수 있으면서 근육노쇠와같은 노인성 질환을 예방할 수 있는 소재 개발이 활발히 이루어지고 있으며, 특히 안전하고, 약리적인효능이 뛰어난 한의학 기반 본초, 방제 및 천연물로부터 새로운 소재를 발굴하고자 많은 연구가 수행되고 있다. 이러한 연구 동향에 따라 본 연구에서는 면역기능을 활성화하고 항염증인 효과가 있는 β-glucan에대하여 그 효능을 검증하고자 하였다. β-glucane포도당이 β-1, 3에 결합을 중심으로 중합된 다당류를통칭하며, 다당류의 일종으로 효모, 조류, 박테리아등에 존재하는 생리활성 물질로서, β-1, 3 결합의 기본구조에 β-1, 4결합이 가지형태를 이루는 분자구조를 가지고 있다²³⁾.
특히 흑 효모 Aureobasidium pullulans SM-2001에서 유래된 β-glucan의 일종인 polycan의 경우¹³⁾, 골생성 촉진 및 골 소실에 대한 효능이 있으며, 이와 더불어 항염증 작용을 가지고 있으며^{14, 15)}, 염증성 사이토카인의일종인 IL-1β, IL-6와 TNF-α를 감소시키며¹⁶⁾, 비스테로이드 항염증제와 복합투여시 항염증활성을 증가시키는 효과가 있다고 보고되었다¹⁷⁾. 이에 본 연구에서는 흑효모균 Aureobasidium pullulans 으로부터 분리한 polycan에 대하여 근감소증에 미치는 영향을 살펴보고자 C2C12 세포주에 dexamethasone으로 유도하여 근 감소 세포모델을 제작하였고, 그에 대한 개선 효과에 대하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

그 후 PBS로 씻어주고 각 well에 10 μM DCF-DA 1 mL씩 분주하여 30분 동안 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였다. 30분 후 PBS로 씻어주고, 각 well에 PBS 1 mL 씩 분주한 다음 microplate reader(SpectraMax i3, Molecular devices, CA, USA)를 이용하여 excitation 485/20, emission 528/20에서 형광도를 측정하여 세포 내 ROS 수준을 측정하였다.
C2C12 celle 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 U/㎖), streptomycin(100 ㎍/㎖)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's) 배지로 배양되었다. C2C12 Cellse 75 cm² flask(Falcon, USA)에서 충분히 증식된 후 myotube로 분화를 유도하기 위하여 2% horse serum 및 1% penicillin이 첨가된 DMEM 배지로 6일 동안 배양 2 일 간격으로 교체하여 유도하였다. 한편 약물 처리는 근 위축 유도 하루 전에 처리하였으며, 근 위축 유도는 10 μM dexamethasone (Sigma-Aldrich, St.
C2C12 cell를 3×10⁵ cells/well로 6-well culture dish에 분주해 24시간 동안 배양하였고, 이후 6일 동안 분화를 유도하였으며, 근손실을 유도하기 24시간 전 polycan 추출물을 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 근 손실이 유도된 후 media를 제거한 뒤 PBS 를 이용하여 세척하고 RNeasy^Ⓡ mini kit(Aiagen, Hilden, Gerbany)를 이용하여 RNA를 추출하였다.
배양한 C2C12 cell를 96well plate 에 1×10⁵ cell/㎖ 농도로 200 ㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. C2C12 cell에 각각 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/㎖ 농도의 polycan 시료를 처리한 후 24시간 반응시킨 후 5 ㎎/㎖ (DPBS)의 MTT 시약을 media에 5배 희석한 용액 100 ㎕/well 씩 분주 한 후 1시간 incubator에서 반응시켰다. 상층 액을 제거 후 formazon을 DMSO 100 ㎕씩 처리해용해시킨 후, palate를 마이크로 판독기(SpectraMax i3, Molecular devices, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
C2C12 cell을 myotube로 분화시킨 후 dexamethasone 으로 근 위축을 유도한 모델에 polycan 추출물이 세포 내 근육세포 생성 및 단백질 분해 인자에 영향을 미쳤는지 확인하기 위하여 근위축 유도 24시간 전 polycan을 처리하여 mRNA의 발현을 살펴보았다. Fig.
05% Tween이 들어간 TBS로 3회 세척하였다. Membrane 에 다시 anti-IgG conjugated HRP 항체를 넣은 후 1시간 동안 실온에서 반응시키고 0.05% Tween이 포함된 TBS(1×TTBS)로 3회 세척하여 ECL용액을 이용하여 ChemiDocTM touch imaging system (BioRad, California, USA)를 이용하여 분석하였다.
추출한 RNA를 Spectrophotometer(Nanodrop)을 통하여 정량해, 1 ㎍ RNA를 Maxima frist strand cDNA synthesis kit for RT-qPCR(Thermo scientific, Waltham, USA)를 이용하여 complementary DNA(cDNA) 를 합성하였다. PCR bio syGreen blue Mix(PCR Biosystems, Pennsylvania, USA) 10 ㎕와 primer 2 ㎕가 포함된 혼합물 19 ㎕와 cDNA 1 ㎕를 polymerase chain reaction (PCR) 사이클을 40회 수행하였다. 중합 효소 반응에 쓰인 primer의 정보는 Table 1에서 나타내었다.
Polycan의 glutathion 및 ROS의 생성에 대한 효능을 평가하기 위하여 C2C12 세포를 myotube로 분화시킨 후 polycan을 24시간 처리하고, dexamethasone 으로 근 위축을 유도하였다. dexamethasone을 단독으로 처리하였을 때 , 대조세포와 비교하여 GSH는 10uM의 dexamethasone를 처리하였을 때, 대조군에비해 세포 내 GSH 농도가 40% 감소하였다(Fig.
관찰된다. Polycan의 근위축 억제 효과에 대한 작용 기전을 알아보기 위하여 C2C12 근관세포에 polycan과 dexamethasone 을 24시간 동안 처리한 후, 단백질 합성 및 분해와 관련된 신호전달경로의 인자인 FOXO3a, MuRF1, Akt 및 PI3k 단백질을 western blot을 통하여 확인해 보았다. 예상된 바와 같이, dexamethasone 처리는 FoxO3α 및 MuRF1의 수준을 유의하게 증가시켰으며, polycan의 처리군에서는 농도의존적으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
polycan 추출물에 대한 세포 독성 및 적정 농도의 범위를 알아보기 위하여 C2C12 cell에 근아세포 (myoblast) 및 이를 분화시킨 근관세포(myotube)에서 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 ㎍/㎖ 농도로처리한 후 24시간 배양하여 MTT assay 방법으로 세포독성을 측정하였다. 그 결과, C2C12 근아세포의생존율에는 영향을 미치지 않았으며 (Fig.
측정하였다. polycan 추출물을 각각 100, 200 (μg/ml)의 농도로 처리하여 실험이 이루어졌으며 상층액의 GSH 함량은 glutathione assay kit(Cayman Co, USA)를 이용해 측정하였다. 상층액 50 μL씩에 kit 내에 있는 assay cocktail을 150 μL씩 넣어 암소 상태로 microplate shaker로 교반 후, microplate reader 를 이용해 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
근 손실이 유도된 후 media를 제거한 뒤 PBS 를 이용하여 세척하고 RNeasy^Ⓡ mini kit(Aiagen, Hilden, Gerbany)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 Spectrophotometer(Nanodrop)을 통하여 정량해, 1 ㎍ RNA를 Maxima frist strand cDNA synthesis kit for RT-qPCR(Thermo scientific, Waltham, USA)를 이용하여 complementary DNA(cDNA) 를 합성하였다.
독성이 있는지 알아보기 위해, 일반적으로 단일성분의 세포 처리 농도 범위인 25 ~ 1000 ㎍/㎖ 범위로 처리한 후 세포생존율을 분석한 결과 근아세포 및 근관세포에 독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였으며, 약물의 효능평가를 위하여 200 ㎍/㎖을최대 용량으로 하여 실험을 진행하였다.
먼저 근위축에 대한 효능을 알아보기 전에 polycan 약물에 대하여 근아세포 및 근관세포에 영향이 있는지 확인을 하기 위하여 polycan을 농도별로 처리하였다. 독성이 있는지 알아보기 위해, 일반적으로 단일성분의 세포 처리 농도 범위인 25 ~ 1000 ㎍/㎖ 범위로 처리한 후 세포생존율을 분석한 결과 근아세포 및 근관세포에 독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였으며, 약물의 효능평가를 위하여 200 ㎍/㎖을최대 용량으로 하여 실험을 진행하였다.
Western blot으로 측정하였다. 먼저, C2C12 cell에 독성이 없는 농도범위에서 polycan을 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 근 손실을 유도하기 위하여 dexamethasone을 24시간 처리 하였다. 각 세포를 1× PBS로 3회 세척 후 lysis buffer(50 mM HEPES, pH 7.
세포가 90% 자랐을 때 2% HS 및 1% P/S를 함유한 DMEM으로 교체하여 분화를 유도하였으며, 배지는 2일마다 교체해주었다. 분화가 완료된 6일째에 polycan 추출물을 각각 100, 200 (μg/ml)의 농도로 처리하였으며, 24시간 뒤에 PBS로 씻어주고 10 μM dexamethasone을 처리하여근 위축을 유도하였다. 그 후 PBS로 씻어주고 각 well에 10 μM DCF-DA 1 mL씩 분주하여 30분 동안 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였다.
C2C12 cell에 각각 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/㎖ 농도의 polycan 시료를 처리한 후 24시간 반응시킨 후 5 ㎎/㎖ (DPBS)의 MTT 시약을 media에 5배 희석한 용액 100 ㎕/well 씩 분주 한 후 1시간 incubator에서 반응시켰다. 상층 액을 제거 후 formazon을 DMSO 100 ㎕씩 처리해용해시킨 후, palate를 마이크로 판독기(SpectraMax i3, Molecular devices, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
24시간 배양하였다. 세포가 90% 자랐을 때 2% HS 및 1% P/S를 함유한 DMEM으로 교체하여 분화를 유도하였으며, 배지는 2일마다 교체해주었다. 분화가 완료된 6일째에 polycan 추출물을 각각 100, 200 (μg/ml)의 농도로 처리하였으며, 24시간 뒤에 PBS로 씻어주고 10 μM dexamethasone을 처리하여근 위축을 유도하였다.
근 손실이 유도된 후 media를 제거한 뒤 PBS 를 이용하여 세척하고 RNeasy^Ⓡ mini kit(Aiagen, Hilden, Gerbany)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 Spectrophotometer(Nanodrop)을 통하여 정량해, 1 ㎍ RNA를 Maxima frist strand cDNA synthesis kit for RT-qPCR(Thermo scientific, Waltham, USA)를 이용하여 complementary DNA(cDNA) 를 합성하였다. PCR bio syGreen blue Mix(PCR Biosystems, Pennsylvania, USA) 10 ㎕와 primer 2 ㎕가 포함된 혼합물 19 ㎕와 cDNA 1 ㎕를 polymerase chain reaction (PCR) 사이클을 40회 수행하였다.

대상 데이터

따라 다음과 같이 시행되었다. C2C12 celle 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 U/㎖), streptomycin(100 ㎍/㎖)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's) 배지로 배양되었다. C2C12 Cellse 75 cm² flask(Falcon, USA)에서 충분히 증식된 후 myotube로 분화를 유도하기 위하여 2% horse serum 및 1% penicillin이 첨가된 DMEM 배지로 6일 동안 배양 2 일 간격으로 교체하여 유도하였다.
본 실험에 사용한 polycane 흑효모 Aureobasidium pullans SM-2001으로 발효된 β-glucan으로, 이전연구에 따르면 β-1, 3/1, 6-glucan (β-1, 3 linkage 68: β-1, 6 linkage 32)이며, 평균 분자량은 2.6×105Da 이다18). 실험에 사용한 β-glucane ㈜글루칸에서제공받아 실험에 사용하였다.
6×105Da 이다18). 실험에 사용한 β-glucane ㈜글루칸에서제공받아 실험에 사용하였다.

데이터처리

모든 실험 결과는 GraphPadprism 5.0 통계 프로그램(Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA)을이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차(mean±SD)로 계산하였으며 각 그룹 간 비교를 위해 one-way ANOVA로 분석하였으며, 사후 검정은 LSD를 통해 검증하였으며, p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 평가하였다.

이론/모형

C2C12 cellse ATCC^Ⓡ를 통하여 구입하였으며, myoblast로, 세포배양은 이미 보고된 선행연구의 방법4)에 따라 다음과 같이 시행되었다. C2C12 celle 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 U/㎖), streptomycin(100 ㎍/㎖)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's) 배지로 배양되었다.
C2C12 cell로부터 분화 및 근 손실 관련 단백 질의발현을 Western blot으로 측정하였다. 먼저, C2C12 cell에 독성이 없는 농도범위에서 polycan을 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 근 손실을 유도하기 위하여 dexamethasone을 24시간 처리 하였다.
Total RNAs were extracted using Trizol reagent and mRNA was measured using qRT-PCR. The fold changes relative to the control were calculated using the ΔΔCT method for mRNA expression levels of muscle-specific transcription genes. Values are means SEM of two different preparations with quadruplicate experiments.
약물에 의한 세포독성을 알아보기 위해 MTT assay 방법을 이용하였다. 배양한 C2C12 cell를 96well plate 에 1×10⁵ cell/㎖ 농도로 200 ㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다.

성능/효과

살펴보았다. Fig. 3는 근육세포 생성에 관여하는 전사인자 및 근육세포 단백질 분해인자에 대하여 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과로, polycan 추출물을 처리시, 근육세포 생성에 관여하는 전사인자인 인 MyoD, Myogenin, MEF2, Myf5, Myf6의 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과, dexamethsone을 처리시 대조군대비 약 40%로 감소하는 경향을 보였으며, polycan 처리군에서는 농도의존적으로 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 또한 polycan 추출물과 근육세포 단백질분해에 관여하는 MuRF1, Atrogin-1, FoxO3, Myostatin 에 대하여 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과, Fig.
따라서 본 연구에서는 dexamethasone에 의하여 유발된 근위축 현상에서 polycan의 효능이 근육세포 생성 및 분해에 관여하는 전사인자에 대하여 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. Fig. 3에서 나타난 바와 같이 dexamethasone 처리에 의하여 근위축이 유발되는 조건에서 근육세포생성에 관여한는 MyoD, myogenin, MEF2, Myf5, Myf6의 경우 대조군에 비하여 mRNA의 발현이 감소함을 화인 할 수 있었으며, polycan처리에 의하여 증가가 유발되었다. 또한 근육세포 단백질 분해에 관여하는 muscle-specific transcription factor들 중 Forkhead box O(FoxO)의 활성은 자가포식작용 관련 단백질을 유도하여 자식작용 신호전달체계를 촉진하며, FoxO의 활성은 세포 내 mTOR의 발현 억제를통해 세포 성장에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
Polycan이 근육세포에 독성을 유발하지 않으면서 dexamethasone으로 유도된 근위축 세포모델에서 PI3K/Akt 신호전달경로를 통하여 단백질 생성및 분해에 관여하는 ubiquitin-proteasome 시스템에작용함으로써 근위축으로부터 근관세포를 보호하는효능을 가진다는 것을 입증하였다. 이를 바탕으로 추후 동물모델에서도 근위축 억제 효능 및 예방, 치료효과가 추가적으로 밝혀진다면 polyca이 노화와 연관된 근육 관련 제품화에 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.
근 위축을 유도하였다. dexamethasone을 단독으로 처리하였을 때 , 대조세포와 비교하여 GSH는 10uM의 dexamethasone를 처리하였을 때, 대조군에비해 세포 내 GSH 농도가 40% 감소하였다(Fig. 2A). 그러나 세포에 polyca(100, 200 μg/mL)를 전 처리한 후 dexamethasone을 처리한 군 에서는 GSH 농도가 대조군 대비 100 μg/mL군에서는 60.
polycane 근육세포 생성 전사인자들을 활성화하고, 근육세포 단백질 분해 인자들을 억제함으로써 dexamethasone에 의한 근손실 모델에서 근감소 효능을 확인할 수 있었다.
측정하였다. 그 결과, C2C12 근아세포의생존율에는 영향을 미치지 않았으며 (Fig. 1A), C2C12 근관세포에도 같은 조건으로 polycan을 처리한 후, 세포 생존율을 측정한 결과, 실험 한 모든 농도에서 근관세포의 생존율에 영향을 미치지 않았다 (Fig.1B). 모든 농도에서의 세포 생존율이 90% 이상을 나타내는 것으로 보아 세포독성은 거의 없는 것으로 판단되어 이후의 실험에서는 최대 200 ㎍/㎖ 까지 사용하였다.
2A). 그러나 세포에 polyca(100, 200 μg/mL)를 전 처리한 후 dexamethasone을 처리한 군 에서는 GSH 농도가 대조군 대비 100 μg/mL군에서는 60.86±4.03%, 200 μg/mL군에서는 84.26±1.85%로 유의하게 회복되는 것을 확인하였다(Fig. 2A). 또한 ROS의 생성량은 dexamethasone 처리군에서는 대조군 대비 160.
2A). 또한 ROS의 생성량은 dexamethasone 처리군에서는 대조군 대비 160.50±1.03 증가하였으며, 약물 처리군에서는 60% 정도의 유의적인 억제 효능을 나타내였다 (Fig. 2B).
3는 근육세포 생성에 관여하는 전사인자 및 근육세포 단백질 분해인자에 대하여 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과로, polycan 추출물을 처리시, 근육세포 생성에 관여하는 전사인자인 인 MyoD, Myogenin, MEF2, Myf5, Myf6의 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과, dexamethsone을 처리시 대조군대비 약 40%로 감소하는 경향을 보였으며, polycan 처리군에서는 농도의존적으로 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 또한 polycan 추출물과 근육세포 단백질분해에 관여하는 MuRF1, Atrogin-1, FoxO3, Myostatin 에 대하여 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과, Fig. 3와 같이 dexamethasone 처리에 의해 MuRF1과 Atrogin-1의 경우 대조군 대비 약 4배정도 발현되었고, FoxO3a 및 Myostatin의 경우 2~3배 정도 증가함을 알 수 있었다. 한편polycan 추출물에서 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 mRNA 발현량이 농도 의존적으로 대폭 감소됨을 확인하였다.
또한, 지질 과산화(lipid peroxidation)의 환원에 관여함으로써, glutathione이 여러 활성증가물질과 결합 (conjugation)을 이루어 GST와 같은 효소의 작용으로 소변으로 배설되게 함으로써 체내의 독성물질을제게하는 역할을 한다. 본 연구에서는 dexamethasone으로 유도한 근위축 세포모델에서 GSH의 함량을 측정한 결과 dexamethasone으로 감소된 GSH 함량이 polycan 처리에 의하여 증가함을 확인하였다. 한편, ROS는 정상 세포의 기능 수행을 위한 중요한 신호전달분자로서 그 기능을 하지만, 비정상적으로 증가된 ROS는 근육세포의 기능장애 및 근세포의 손상을 일으킴으로써 세포 죽음을 야기하는 인자로 작용한다.
한편, ROS는 정상 세포의 기능 수행을 위한 중요한 신호전달분자로서 그 기능을 하지만, 비정상적으로 증가된 ROS는 근육세포의 기능장애 및 근세포의 손상을 일으킴으로써 세포 죽음을 야기하는 인자로 작용한다. 본 연구에서는 dexamethasone이 myotube 세포 내 ROS의 과다 증가를 유도하였으나 polycan의 전 처치로 인해 ROS 수준의 변화가 억제됨을 확인하였다. 근위축은 ubiquitin-proteasome 경로의 활성화를 통한 근육 단백질의 분해에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있다^{1, 5)}.
한편, FoxO3의 경우에는 세포 순환 조절, 분화, 증식과 같은 세포 생존에 이르는 여러 세포 기능에 관여하며, 지속적인 FoxO3a의 활성은 단백질 분해를 유도하여근소모증 유발하는 것을 알려져 있다²⁹⁾. 본 연구에서는 polycan의 근위축 억제 효과의 기전을 확인 하기위하여 dexamethasone으로 유도된 근손실모델에서 PI3K/Akt와 FoxO3의 단백질 발현 양상을 분석한 결과, dexamethasone에 의해 p-Akt 및 p-PI3k의 단백질 발현이 감소된 것을 polycan에 의해 향상됨을 확인하였고, MuRF1 및 FoxO3으 경우 dexamethasone 에 의해 증가된 단백질의 발현이 약물에 의하여 감소함을 확인하였다. 이를 통해 polycan이 Akt/FOXO 신호전달경로를 통해 근위축을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
Polycan의 근위축 억제 효과에 대한 작용 기전을 알아보기 위하여 C2C12 근관세포에 polycan과 dexamethasone 을 24시간 동안 처리한 후, 단백질 합성 및 분해와 관련된 신호전달경로의 인자인 FOXO3a, MuRF1, Akt 및 PI3k 단백질을 western blot을 통하여 확인해 보았다. 예상된 바와 같이, dexamethasone 처리는 FoxO3α 및 MuRF1의 수준을 유의하게 증가시켰으며, polycan의 처리군에서는 농도의존적으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 한편 p-Akt 및 PI3k의 경로에서는 dexamethasone의 처리군에서는 발현양이 유의하게 감소시켰으나, polycan을 처리한 경우, 실험에 사용된 모든 농도 범위의 polycan에서 p-Akt alc p-PI3k를 증가시켜 정상대조군과 유사한 수준으로 회복되는 것이 확인되었다(Fig.
4). 이러한 결과를 통하여, polycan이 Akt/FOXO 신호전달을 활성화시킴으로써 근위축으로부터 보호 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서는 polycan의 근위축 억제 효과의 기전을 확인 하기위하여 dexamethasone으로 유도된 근손실모델에서 PI3K/Akt와 FoxO3의 단백질 발현 양상을 분석한 결과, dexamethasone에 의해 p-Akt 및 p-PI3k의 단백질 발현이 감소된 것을 polycan에 의해 향상됨을 확인하였고, MuRF1 및 FoxO3으 경우 dexamethasone 에 의해 증가된 단백질의 발현이 약물에 의하여 감소함을 확인하였다. 이를 통해 polycan이 Akt/FOXO 신호전달경로를 통해 근위축을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과들로 dexamethasone에 의해 유도된 근 손실에 대하여 polycan의 근감소 효능을 확인하였다. polycane 근육세포 생성 전사인자들을 활성화하고, 근육세포 단백질 분해 인자들을 억제함으로써 dexamethasone에 의한 근손실 모델에서 근감소 효능을 확인할 수 있었다.
4). 한편 p-Akt 및 PI3k의 경로에서는 dexamethasone의 처리군에서는 발현양이 유의하게 감소시켰으나, polycan을 처리한 경우, 실험에 사용된 모든 농도 범위의 polycan에서 p-Akt alc p-PI3k를 증가시켜 정상대조군과 유사한 수준으로 회복되는 것이 확인되었다(Fig. 4). 이러한 결과를 통하여, polycan이 Akt/FOXO 신호전달을 활성화시킴으로써 근위축으로부터 보호 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다.
3와 같이 dexamethasone 처리에 의해 MuRF1과 Atrogin-1의 경우 대조군 대비 약 4배정도 발현되었고, FoxO3a 및 Myostatin의 경우 2~3배 정도 증가함을 알 수 있었다. 한편polycan 추출물에서 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 mRNA 발현량이 농도 의존적으로 대폭 감소됨을 확인하였다.

후속연구

Polycan이 근육세포에 독성을 유발하지 않으면서 dexamethasone으로 유도된 근위축 세포모델에서 PI3K/Akt 신호전달경로를 통하여 단백질 생성및 분해에 관여하는 ubiquitin-proteasome 시스템에작용함으로써 근위축으로부터 근관세포를 보호하는효능을 가진다는 것을 입증하였다. 이를 바탕으로 추후 동물모델에서도 근위축 억제 효능 및 예방, 치료효과가 추가적으로 밝혀진다면 polyca이 노화와 연관된 근육 관련 제품화에 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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