C2C12 근관세포에서 dexamethasone 및 hydrogen peroxide에 의한 근위축 유도 Induction of Muscle Atrophy by Dexamethasone and Hydrogen Peroxide in Differentiated C2C12 Myotubes원문보기
일반적으로 노화, 영양부족 및 다양한 만성질환에 의하여 유발되는 근위축은 근육 단백질 합성 억제 및 분해증가를 통하여 근섬유 및 근육의 밀도를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 근위축과 관련된 in vitro 실험을 위한 C2C12근아세포에서 근관세포로의 분화과정을 확립하고, 분화가 유발된 C2C12 근관세포를 대상으로 dexamethasone 및 hydrogen peroxide에 의한 근위축 유발 및 관련 단백질들의 발현 변화를 조사하였다. 먼저 C2C12 근아세포에 분화배지를 처리하였을 경우 근관세포로 분화가 유발되었으며, 분화와 관련된 단백질인 myogenin 및 myoD의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 분화가 유발된 C2C12 근관세포에 세포독성이 없는 조건의 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 처리하였을 경우 근관의 지름이 감소하였으며, 이러한 현상은 musclespecific ubiquitin ligases인 MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현 증가와 함께 muscle-specific transcription factor인 myogenin 및 MyoD의 발현 감소와 관련이 있다는 것을 확인하였다. 본 연구 결과는 근위축과 관련된 in vitro 실험 모델의 구축을 위한 최적의 분화조건 확립과 함께 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 근위축 유도제로 사용할 수 있는 가능성 을 제시하는 것이다.
일반적으로 노화, 영양부족 및 다양한 만성질환에 의하여 유발되는 근위축은 근육 단백질 합성 억제 및 분해증가를 통하여 근섬유 및 근육의 밀도를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 근위축과 관련된 in vitro 실험을 위한 C2C12 근아세포에서 근관세포로의 분화과정을 확립하고, 분화가 유발된 C2C12 근관세포를 대상으로 dexamethasone 및 hydrogen peroxide에 의한 근위축 유발 및 관련 단백질들의 발현 변화를 조사하였다. 먼저 C2C12 근아세포에 분화배지를 처리하였을 경우 근관세포로 분화가 유발되었으며, 분화와 관련된 단백질인 myogenin 및 myoD의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 분화가 유발된 C2C12 근관세포에 세포독성이 없는 조건의 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 처리하였을 경우 근관의 지름이 감소하였으며, 이러한 현상은 musclespecific ubiquitin ligases인 MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현 증가와 함께 muscle-specific transcription factor인 myogenin 및 MyoD의 발현 감소와 관련이 있다는 것을 확인하였다. 본 연구 결과는 근위축과 관련된 in vitro 실험 모델의 구축을 위한 최적의 분화조건 확립과 함께 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 근위축 유도제로 사용할 수 있는 가능성 을 제시하는 것이다.
Muscle atrophy due to aging, starvation, and various chronic diseases leads to a decrease in muscle fiber area and density due to reduced muscle protein synthesis and increased protein breakdown. This study investigated the effect of dexamethasone and hydrogen peroxide on the induction of muscle atr...
Muscle atrophy due to aging, starvation, and various chronic diseases leads to a decrease in muscle fiber area and density due to reduced muscle protein synthesis and increased protein breakdown. This study investigated the effect of dexamethasone and hydrogen peroxide on the induction of muscle atrophy and expression of atrophy-related genes in differentiated C2C12 myotubes. C2C12 myoblasts were differentiated into myotubes in differentiation medium. During myoblast differentiation, muscle-specific transcription factors, such as myogenin, and MyoD expression increased. Differentiated C2C12 myotubes exposed to noncytotoxic levels of dexamethasone and hydrogen peroxide showed a decrease in myotube diameter, which was associated with up-regulation of muscle-specific ubiquitin ligases, such as muscle atrophy F-box (MAFbx)/atrogin-1 and muscle RING finger-1 (MuRF1), and down-regulation of myogenin and MyoD. These results demonstrated that dexamethasone and hydrogen peroxide induced atrophy through regulation of muscle-specific ubiquitin ligases and muscle-specific transcription factors in C2C12 myotubes. In this study, we confirmed the process of differentiation of C2C12 myoblasts into myotubes in in vitro experiments in the presence of atrophy. This muscle atrophy model of C2C12 cells induced by dexamethasone or hydrogen peroxide seems suited to studies of the mechanism of muscle atrophy suppression and to exploit the experiment for excavating new muscle atrophy.
Muscle atrophy due to aging, starvation, and various chronic diseases leads to a decrease in muscle fiber area and density due to reduced muscle protein synthesis and increased protein breakdown. This study investigated the effect of dexamethasone and hydrogen peroxide on the induction of muscle atrophy and expression of atrophy-related genes in differentiated C2C12 myotubes. C2C12 myoblasts were differentiated into myotubes in differentiation medium. During myoblast differentiation, muscle-specific transcription factors, such as myogenin, and MyoD expression increased. Differentiated C2C12 myotubes exposed to noncytotoxic levels of dexamethasone and hydrogen peroxide showed a decrease in myotube diameter, which was associated with up-regulation of muscle-specific ubiquitin ligases, such as muscle atrophy F-box (MAFbx)/atrogin-1 and muscle RING finger-1 (MuRF1), and down-regulation of myogenin and MyoD. These results demonstrated that dexamethasone and hydrogen peroxide induced atrophy through regulation of muscle-specific ubiquitin ligases and muscle-specific transcription factors in C2C12 myotubes. In this study, we confirmed the process of differentiation of C2C12 myoblasts into myotubes in in vitro experiments in the presence of atrophy. This muscle atrophy model of C2C12 cells induced by dexamethasone or hydrogen peroxide seems suited to studies of the mechanism of muscle atrophy suppression and to exploit the experiment for excavating new muscle atrophy.
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문제 정의
특히 심장 및 골격근에서 특이적으로 발현되는 F-box type E3 ligase인 MAFbx/atrogin-1 및 Ring Finger 유형의 E3 ligase인 MuRF1은 근위축을 유발하는 다양한 조건에서 증가하여 세포주기 억제 및 근육 특이적인 유전자 발현의 활성화를 통한 myogenic differentiation에 관여하는 muscle-specific transcription factor인 myogenin과 MyoD의 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다[1, 8, 30, 32]. 따라서 dexamethasone및 hydrogen peroxide가 유발하는 근위축 현상이 muscle-specific ubiquitin ligase 및 muscle-specific transcription factor의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하였다. Fig.
근위축 연구를 위한 모델 설정에 사용되는 약물들은 기본적으로 세포독성이 없는 조건에서 근위축을 유발해야 할 것이다. 따라서 본 연구에서 근위축을 위하여 사용된 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 C2C12 myoblast의 세포독성에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 trypan blue염색 및 MTT assay를 이용하여 생존율 및 성장 억제 정도를 조사하였다. 먼저 dexamethasone이 C2C12 myoblast에서 유발하는 생존율 및 성장 억제에 미치는 영향을 확인한 결과는Fig.
In vitro실험 모델에서 dexamethasone 및 hydrogen peroxide에 의하여 유발되는 근위축과 관련된 일련의 변화가 환자에서 나타나는 근위축과 관련된 변화와 유사하므로 근위축 기전 연구에 사용될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 in vitro 실험 모델을 이용한 근위축 연구를 위하여 근아세포(myoblast)에서 근관세포(myotube)로의 분화과정을 구축하고, 분화가 유발된 myotube에서 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 이용한 인위적인 근위축 모델의 확립을 실시하였다.
분화되기 전 상태인 myoblast의 경우에는 매우 빠르게 증식하며, myotube로의 특징을 가지고 있지 않지만 분화배지 처리에 의한 분화 유도 시 myoblast는 증식억제와 더불어 세포융합이 유발되어 다핵의 myotube를 형성하는 것으로 알려져 있다[14, 15]. 따라서 본 연구에서는 in vitro 실험을 이용한 근위축 연구 모델을 구축하기 위하여 C2C12 세포를 대상으로 myoblast에서 myotube로의 최적의 분화조건을 확립하였으며, 이러한 분화과정에 관여하는 유전자들의 발현에 어떠한 변화가 유발되는지를 관찰하였다. 먼저 C2C12 myoblast를 myotube로 분화시키기 위한 최적의 조건을 확립한 결과는 Fig.
Myoblast에서 myotube로 분화가 유발될 경우에는 세포들사이의 융합에 따른 근섬유의 수가 증가하고 근섬유의 지름이 두꺼워지는 특징을 가지지만 여러 가지 원인에 의하여 근위축이 유발될 경우에는 근육 단백질 분해를 통하여 근섬유의 수와 지름이 감소함으로서 전체적인 근육량의 감소가 나타나게 된다[3, 22]. 이러한 근위축 현상을 설정하기 위한 in vitro 연구를 위하여 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 인위적인근위축 유도인자로서 활용될 수 있는지를 확인하고자 하였다. 이를 위하여 충분히 분화가 유발된 C2C12 myotube에 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 처리하였을 경우 나타나는 근섬유의 형태적인 특징을 도립현미경을 이용하여 관찰하였으며, 근섬유의 지름을 측정하였다.
가설 설정
Photographs were taken under an inverted microscope. (B) Expression levels of myogenin and myoD were compared across the differentiation stages. Cells were lysed and cellular proteins were separated by SDS-polyacrylamide gels and transferred onto nitrocellulose membranes.
제안 방법
Dexamethasone 및 hydrogen peroxide 처리에 따른 C2C12myoblast의 생존율을 측정하기 위하여 세포 배양용 6 wellplate에 C2C12 myoblast를 분주하여 100% confluent 상태까지 배양한 후 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 적정농도로 처리하였다. 일정 시간 경과 후 배지를 제거하고 0.
Dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 C2C12 myoblast에서 유발하는 성장억제 정도를 확인하기 위하여 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포를 대상으로 배지를 제거하고 성장배지와 희석된 0.5 mg/ml 농도의 MTT 용액을 2 ml 씩 분주하고 빛을 차단한 다음 동안 CO2 incubator에서 배양시켰다. 2시간경과 후 MTT 시약을 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO,Amresco, Solon, OH, USA)를 적정량 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 다음 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
근위축에서 중요한 역할을 하는 muscle-specific ubiquitinligase 및 muscle-specific transcription factor 들의 발현 변화를 확인하기 위하여 준비된 세포를 대상으로 적당량의 lysisbuffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA,1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 14,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액에 있는 총 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량하였으며, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분자량에 따라 분리한 후 electroblotting을 실시하여 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH,USA)으로 전이시켰다.
분리된 단백질은 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량하였으며, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분자량에 따라 분리한 후 electroblotting을 실시하여 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH,USA)으로 전이시켰다. 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane에 각각의 1차 및 2차 항체를 처리하여 반응시킨 다음enhanced chemiluminoesence (ECL) solution (AmershamLife Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 이용하여 특정 단백질의 발현 변화를 분석하였다.
C2C12 myoblast를 myotube로 분화시키기 위하여 90% DMEM, 10% HS 및 100 unit/ml PS가 포함된 분화배지를 사용하였다. 또한 분화과정 중 나타나는 형태변화를 확인하기 위하여 도립 현미경(inverted microscope,Carl Zeiss, Gottingen, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다.
C2C12 myoblast는 90% DMEM, 10% FBS 및 100unit/ml PS가 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을해소하기 위하여 매 48시간마다 계대 배양을 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다. C2C12 myoblast를 myotube로 분화시키기 위하여 90% DMEM, 10% HS 및 100 unit/ml PS가 포함된 분화배지를 사용하였다.
)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 phosphatebuffered saline (PBS)를 각 well 당 적정량을 첨가하여 세포를 모았다. 이렇게 모인 세포를 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 각각 1ml의 PBS와 0.5% trypan blue solution (Gibco BRL, GrandIsland, NY, USA)을 첨가하여 2분간 염색을 실시하고 hemocytometer에 적용시킨 다음 도립 현미경을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였다.
이러한 근위축 현상을 설정하기 위한 in vitro 연구를 위하여 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 인위적인근위축 유도인자로서 활용될 수 있는지를 확인하고자 하였다. 이를 위하여 충분히 분화가 유발된 C2C12 myotube에 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 처리하였을 경우 나타나는 근섬유의 형태적인 특징을 도립현미경을 이용하여 관찰하였으며, 근섬유의 지름을 측정하였다. 먼저 분화가 유발된C2C12 myotube에 dexamethasone을 처리하였을 경우 유발하는 근위축 현상을 확인한 결과, Fig.
이상의 결과를 바탕으로 생존율 및 성장에 큰 영향을 미치지 않는 조건인 100 μM dexamethasone의 48시간 처리군 및 100 μM hydrogen peroxide의 24시간 처리군까지를 실험조건으로 설정하여 근위축 유발을 실시하였다.
Dexamethasone 및 hydrogen peroxide 처리에 따른 C2C12myoblast의 생존율을 측정하기 위하여 세포 배양용 6 wellplate에 C2C12 myoblast를 분주하여 100% confluent 상태까지 배양한 후 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 적정농도로 처리하였다. 일정 시간 경과 후 배지를 제거하고 0.05%trypsin-ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA, SigmaAldrich Chemical Co.)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 phosphatebuffered saline (PBS)를 각 well 당 적정량을 첨가하여 세포를 모았다. 이렇게 모인 세포를 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 각각 1ml의 PBS와 0.
대상 데이터
세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을해소하기 위하여 매 48시간마다 계대 배양을 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다. C2C12 myoblast를 myotube로 분화시키기 위하여 90% DMEM, 10% HS 및 100 unit/ml PS가 포함된 분화배지를 사용하였다. 또한 분화과정 중 나타나는 형태변화를 확인하기 위하여 도립 현미경(inverted microscope,Carl Zeiss, Gottingen, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다.
Lousi, MO, USA)에서 구입하였다. 단백질 분석을 위하여사용된 1차 항체인 MAFbx/atrogin-1, MuRF1, myogenin 및 MyoD와 2차 항체인 goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) 및 goat anti-rabbit IgG-HRP은 Santa CruzBiotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 세포주인 C2C12 myoblast는 American TypeCulture Collection (Manassa, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. C2C12 myoblast는 90% DMEM, 10% FBS 및 100unit/ml PS가 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
데이터처리
The significance was determined by the Student’s t-test (*p<0.05 vs. untreated control).
각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 한 후, Student t-test를 이용하여 *p<0.05 수준에서 검증하였다.
모든 실험 결과는 SPSS ver. 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,USA) 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation, SD)로 나타냈다.
성능/효과
따라서 dexamethasone및 hydrogen peroxide가 유발하는 근위축 현상이 muscle-specific ubiquitin ligase 및 muscle-specific transcription factor의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하였다. Fig. 6A및 B에서 나타난 바와 같이 muscle-specific ubiquitin ligase인MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현 변화를 확인한 결과 근위축을 유발하지 않았을 경우에는 발현이 되지 않았지만 dexamethasone 및 hydrogen peroxide 처리에 의한 근위축이 유발되는 조건에서 처리농도 및 시간에 따른 발현 증가가 유발되었다. 또한 muscle-specific transcription factor들의 경우에는 myotube로 분화가 유발되었을 경우 발현이 증가되었지만 dexamethasone 및 hydrogen peroxide 처리에 의하여 현저한발현 감소가 유발되는 것으로 나타났다.
1A에 나타낸 바와 같다. 결과에서 나타낸 바와 같이 C2C12 myoblast를 대상으로 성장배지를 이용하여 100% confluent한 상태로 배양한 다음 새로운 성장배지로 교환하여 2일간의 전분화과정을 유발하면 세포들 사이의 융합 현상이 나타나는 것으로 확인되었다. 전분화과정이끝난 후 매 2일마다 분화배지로 교환하여 분화를 유발하면시간 경과에 따라 분화가 유발되었으며, 7일 경과 후 완전한형태의 myotube가 형성되는 것으로 나타났다.
결과에서 볼 수 있듯이 0~200 μM 농도의 dexamethasone을 24시간 및 48시간 동안처리하였을 경우 100 μM dexamethasone 처리군까지는 생존율 및 성장 억제 현상이 크게 나타나지 않았지만 200 μM dexamethasone 처리군에서는 생존율 및 성장 억제가 유발되는것으로 나타났다.
전분화과정이끝난 후 매 2일마다 분화배지로 교환하여 분화를 유발하면시간 경과에 따라 분화가 유발되었으며, 7일 경과 후 완전한형태의 myotube가 형성되는 것으로 나타났다. 또한 Fig. 1B에 나타낸 바와 같이 분화 여부의 직접적인 증거를 제시하여 위하여 근육의 분화과정에 직접적으로 관여하는 것으로 알려진 muscle-specific transcription factor인 myogenin과 MyoD의발현 변화를 확인한 결과, 분화 유도 초기에 발현이 현저하게증가하는 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 분화 유도에 따른 형태적 변화와 더불어 C2C12 myoblast에서 myotube로의 분화가 적절히 유도되었음을 의미하는 결과이다.
또한 Fig. 3A 및 Fig. 3B에 나타낸 바와 같이0~200 μM 농도의 hydrogen peroxide를 6시간, 12시간 및 24시간 동안 처리하였을 경우 100 μM hydrogen peroxide 처리군까지는 처리농도 및 처리시간에 따른 생존율 및 성장 억제효과가 거의 나타나지 않았지만 200 μM hydrogen peroxide처리군에서는 생존율 및 성장 억제가 유발된다는 것을 알 수있었다.
4B에 나타난바와 같이 dexamethasone 처리시간 및 농도 의존적으로 근섬유의 수가 감소하였으며, 근섬유의 지름도 현저하게 감소하는것으로 나타났다. 또한 Fig. 5A 및 Fig. 5B에 나타난 바와 같이hydrogen peroxide를 처리하였을 경우에도 dexamethasone처리군과 마찬가지로 처리농도 및 시간이 증가할수록 근섬유의 수가 감소하는 것으로 나타났으며, 근섬유의 지름도 감소하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과들을 살펴볼 때 세포독성이 없는 조건의 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 C2C12 myotube의 근위축을 유발한다는 것을 알 수 있었으므로 인위적인 근위축 유도인자로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
6A및 B에서 나타난 바와 같이 muscle-specific ubiquitin ligase인MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현 변화를 확인한 결과 근위축을 유발하지 않았을 경우에는 발현이 되지 않았지만 dexamethasone 및 hydrogen peroxide 처리에 의한 근위축이 유발되는 조건에서 처리농도 및 시간에 따른 발현 증가가 유발되었다. 또한 muscle-specific transcription factor들의 경우에는 myotube로 분화가 유발되었을 경우 발현이 증가되었지만 dexamethasone 및 hydrogen peroxide 처리에 의하여 현저한발현 감소가 유발되는 것으로 나타났다. 이는 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 muscle-specific ubiquitin ligase 들의 발현을 증가시켜 ubiquitin-proteasome 경로를 통한 muscle-specific transcription factor 들의 분해를 유발함으로서 근위축을 유발한다는 것을 제시하는 결과이다.
이를 위하여 충분히 분화가 유발된 C2C12 myotube에 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 처리하였을 경우 나타나는 근섬유의 형태적인 특징을 도립현미경을 이용하여 관찰하였으며, 근섬유의 지름을 측정하였다. 먼저 분화가 유발된C2C12 myotube에 dexamethasone을 처리하였을 경우 유발하는 근위축 현상을 확인한 결과, Fig. 4A 및 Fig. 4B에 나타난바와 같이 dexamethasone 처리시간 및 농도 의존적으로 근섬유의 수가 감소하였으며, 근섬유의 지름도 현저하게 감소하는것으로 나타났다. 또한 Fig.
또한 muscle-specific transcription factor들의 경우에는 myotube로 분화가 유발되었을 경우 발현이 증가되었지만 dexamethasone 및 hydrogen peroxide 처리에 의하여 현저한발현 감소가 유발되는 것으로 나타났다. 이는 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 muscle-specific ubiquitin ligase 들의 발현을 증가시켜 ubiquitin-proteasome 경로를 통한 muscle-specific transcription factor 들의 분해를 유발함으로서 근위축을 유발한다는 것을 제시하는 결과이다. 본 연구 결과는근위축과 관련된 in vitro 실험 모델의 구축을 위하여 myoblast에서 myotube로의 최적의 분화조건 확립과 함께 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 근위축을 위한 유도제로 사용될 수 있는 가능성을 제시하는 것으로서 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료로서의 가치가 높을 것으로 생각된다.
결과에서 나타낸 바와 같이 C2C12 myoblast를 대상으로 성장배지를 이용하여 100% confluent한 상태로 배양한 다음 새로운 성장배지로 교환하여 2일간의 전분화과정을 유발하면 세포들 사이의 융합 현상이 나타나는 것으로 확인되었다. 전분화과정이끝난 후 매 2일마다 분화배지로 교환하여 분화를 유발하면시간 경과에 따라 분화가 유발되었으며, 7일 경과 후 완전한형태의 myotube가 형성되는 것으로 나타났다. 또한 Fig.
후속연구
이러한 산화적 스트레스는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성을 통하여 ubiquitin-proteasome 경로를 활성화시킴으로서 단백질 파괴의 증가 및 myosin 발현의 감소를 유발하게 되고, 최종적으로 근위축을 일으키는 것으로 보고되고 있다[9, 17, 19]. In vitro실험 모델에서 dexamethasone 및 hydrogen peroxide에 의하여 유발되는 근위축과 관련된 일련의 변화가 환자에서 나타나는 근위축과 관련된 변화와 유사하므로 근위축 기전 연구에 사용될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 in vitro 실험 모델을 이용한 근위축 연구를 위하여 근아세포(myoblast)에서 근관세포(myotube)로의 분화과정을 구축하고, 분화가 유발된 myotube에서 dexamethasone 및 hydrogen peroxide를 이용한 인위적인 근위축 모델의 확립을 실시하였다.
이는 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 muscle-specific ubiquitin ligase 들의 발현을 증가시켜 ubiquitin-proteasome 경로를 통한 muscle-specific transcription factor 들의 분해를 유발함으로서 근위축을 유발한다는 것을 제시하는 결과이다. 본 연구 결과는근위축과 관련된 in vitro 실험 모델의 구축을 위하여 myoblast에서 myotube로의 최적의 분화조건 확립과 함께 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 근위축을 위한 유도제로 사용될 수 있는 가능성을 제시하는 것으로서 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료로서의 가치가 높을 것으로 생각된다.
5B에 나타난 바와 같이hydrogen peroxide를 처리하였을 경우에도 dexamethasone처리군과 마찬가지로 처리농도 및 시간이 증가할수록 근섬유의 수가 감소하는 것으로 나타났으며, 근섬유의 지름도 감소하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과들을 살펴볼 때 세포독성이 없는 조건의 dexamethasone 및 hydrogen peroxide가 C2C12 myotube의 근위축을 유발한다는 것을 알 수 있었으므로 인위적인 근위축 유도인자로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
근위축은 어떤 원인에 의하여 유발되는가?
근위축(muscle atrophy)은 노화, 영양부족 및 만성질환 등과 같은 여러 가지 원인에 의하여 유발되며, 단백질 합성 조절, protease 활성화, ubiquitin conjugation 및 autophagy 등과같은 많은 세포 내 변화가 관여하는 것으로 알려져 있다[11,13, 31]. 이러한 근위축은 삶의 질을 떨어뜨릴 뿐 만 아니라 병적 상태 및 사망률을 증가시키는 원인이 될 수 있기 때문에 이와 관련된 기전을 규명하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.
muscle atrophy의 기전을 규명하기 위한 연구가 많이 진행되는 이유는 무엇인가?
근위축(muscle atrophy)은 노화, 영양부족 및 만성질환 등과 같은 여러 가지 원인에 의하여 유발되며, 단백질 합성 조절, protease 활성화, ubiquitin conjugation 및 autophagy 등과같은 많은 세포 내 변화가 관여하는 것으로 알려져 있다[11,13, 31]. 이러한 근위축은 삶의 질을 떨어뜨릴 뿐 만 아니라 병적 상태 및 사망률을 증가시키는 원인이 될 수 있기 때문에 이와 관련된 기전을 규명하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 최근 연구에 따르면 근위축은 ubiquitin-proteasome 경로의 활성화에 의한 단백질 분해 증가가 중요한 원인이며, 특히 근위축 과정의 초기에 muscle-specific ubiquitin ligase에 해당되는 muscle atrophy F-box (MAFbx)/atrogin-1 및 muscleRING finger-1 (MuRF1)이 발현되어 근육 단백질 분해에 직접적으로 관여하는 것으로 보고되고 있다[2, 4, 5, 8].
합성 glucocorticoid인 dexamethasone는 무엇을 유도하기 위해 사용되고 있는가?
합성 glucocorticoid인 dexamethasone은 생체 내 또는 배양세포에서 근육에서의 단백질 합성 속도를 감소시키고 단백질분해 속도를 증가시키는 것으로 알려져 있으므로 생체 내 또는 배양세포에서 근육 단백질 분해를 유도하기 위하여 사용되고 있다[12, 20, 27]. 선행 연구에 따르면 dexamethasone은 ubiquitin-proteasome 경로를 통하여 단백질 분해를 증가시키고 이와 관련된 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 보고되고있다[6, 7, 28].
참고문헌 (32)
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