[논문]RAW 264.7 세포에서 레드비트의 항산화 및 항염증 등의 생리활성 연구

지중구

doi:10.12925/jkocs.2021.38.1.309

RAW 264.7 세포에서 레드비트의 항산화 및 항염증 등의 생리활성 연구
The Study on the Physiological Activities of Beta vulgaris such as Antioxidant and Anti-inflammatory in RAW 264.7 cells 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.38 no.1, 2021년, pp.309 - 317

초록
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본 연구는 침출차 원료로 레드비트를 활용하기 위해서 세포독성, 항염증 및 항산화 등의 활성을 조사하고자 설계되었다. 항산화 효능은 DPPH 및 ABTS 라디컬 소거 활성을 분석하여 평가하였다. RAW 264.7 세포를 통해 MTT 분석으로 세포 생존율을 평가하고 LPS로 유도하여 활성산소종과 염증매개체(일산화질소, TNF-α, IL-6 등)의 생성량을 확인하였다. 그 결과, DPPH 및 ABTS 라디컬 소거활성은 농도 의존적으로 증가하였으며, 모든 농도에서 세포독성이 없음을 확인하였다. 또한, LPS로 유도한 RAW 264.7 세포에서 활성산소종(ROS)과 일산화질소(NO), IL-6, TNF-α 생성량을 유의적으로 감소시켰다. 따라서 이러한 결과는 레드비트가 안전한 항산화 및 항염증 효과를 가진 침출차의 원료로서 높은 잠재력을 가지고 있음을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was designed to examine the cell cytotoxic, anti-inflammatory, and antioxidant activity for raw material of Beta vulagaris tea. Antioxidative ability was evaluated by bioassays using DPPH and ABTS radical scavenging activity. Cell viability was assessed by MTT assay using RAW 264.7 cells, and investigated production levels of reactive oxide speies, and inflammatory meditors(i.e., nitric oxide, tumor necrosis factor-α, and interleukin-6) in LPS-induced RAW 264.7 cells. As a results, DPPH and ABTS raidcal scavenging activity were increased in a dose-dependent manner, and confirmed no cytotoxicity in all concentration. Also, it was significantly decreased level of ROS, NO, IL-6, and TNF-a in LPS-induced RAW 264.7 cells. Therefore these results suggest Beta vulagaris has considerable potential as a raw material of leached tea with safe anti-oxidative and anti-inflammatory effects.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Effects of Beta vulagaris on the DPPH(A) and ABTS(B) radical scavenging. The measured levels were expressed as the mean±standard deviation.
그림 Fig. 2. Effects of Beta vulagaris on the cell cytotoxic in RAW 264.7 cells. The measured levels were expressed as the mean±standard deviation.
그림 Fig. 3. Effects of Beta vulagaris on the reactive oxide species level in LPS-induced RAW 264.7 cells. The measured levels were expressed as the mean±standard deviation. **p<0.01 indicates a significant difference from the control group. Normal: non treated cell, Control: only LPS treated cell.
그림 Fig. 4. Effects of Beta vulagaris on the nitric oxide(A), IL-6(B), and TNF-α(C) level in LPS-induced RAW 264.7 cells. The measured levels were expressed as the mean±standard deviation. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 indicates a significant difference from the control group. Normal: non treated cell, Control: only LPS treated cell.

AI 본문요약
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* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

따라서 본 연구에서는 DPPH, ABTS radical 소거 활성 평가와 더불어 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포를 활용하여 세포독성, 활성산소 및 일산화질소, 사이토카인 등의 감소 등을 측정하여 레드비트 침출차 효능에 관한 기초적인 자료를 제공하고자 한다.
본 연구는 레드비트가 침출차로서의 활용 가능성을 객관적으로 평가하고자 세포독성, 항산화 및 항염증 등의 연구를 진행한 결과는 다음과 같다.

제안 방법

이후, 키트에 동봉된 N₁ buffer와 N₂ buffer 를 각각 10분간 반응 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준 곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
시료의 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000 ㎍/㎖ 의 농도로 희석한 시료 100 ㎕에 에탄올로 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 ㎕을 혼합하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 30분간 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군에 증류수를 넣었고 DPPH 용액의 대조군으로써는 에탄올을 넣어 보정 값을 얻은 후 DPPH 자유라디칼 소거율을 아래의 식에 따라 계산하여 백분율로 나타내었다.
시료의 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000 ㎍/㎖의 농도로 희석한 시료 5 ㎕에 7.4 mM ABTS (2, 2 –azino–bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.6 mM potassium persulphate를 제조한 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온 (ABTS·+)을 형성시킨 다음 732 ㎚에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 희석한 ABTS·+ 용액 95 ㎕를 혼합하여 실온에서 10 분간 반응시켰다. 이후 732 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군에 증류수를 넣고 대조군에 대한 ABTS 라디칼 소거율을 아래의 식에 따라 계산하여 백분율로 나타내었다.
배양 후, 1, 200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, DCF-DAe 10 µM이 되도록 첨가하여 15분 동안 암소, 상온에 두었다. 염색 후 차가운 PBS를 넣어 1, 200 rpm에서 5분간 원심분리 한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400 ㎕를 부유 시켜 유세포 분석기를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.
배양 후 새로운 배양액으로 교체하고 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도의 시료에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 원심분리하여 상청액을 획득하여 제거하고 Milliplex map mouse cytokine/chemokine magnetic bead panel-immunology multiplex assay kit에 구성된 물품을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 96 well plate에 상청액 25 ㎕씩 분주하고 assay buffer 및 matrix buffer, antibody-immobilized beads를 각 25 ㎕씩 가하여 혼합한 후 2시간 동안 실온에서 반응시키고 washing 완충 용액을 이용하여 2회 세척하였다.

대상 데이터

, Korea) 등을 사용하였다. 또한, 기기는 CO₂ incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), ELISA reader (MolecularDevices Co., U.S.A.), Luminex (Merck Co., U.S.A.), 유세포 분석기 (BD co., U.S.A.) 등을 사용하였다.
레드비트는 비트농원(Korea)에서 구매하여 껍질을 깎아 물로 씻은 후 채칼을 이용하여 채를 친 후 40℃에서 건조하였다. 건조된 레드비트는 농도(㎍/㎖) 설정을 위해 분쇄기로 분말화 작업을 진행하고 상온에 보관하며 실험에 사용하였다.
시약은 dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS : Welgene, Korea), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM:Gibco BRL Co., U.S.A.), 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS : Invitrogen Co., U.S.A.), penicillin/streptomycin (Gibco BRL Co., U.S.A.), cell viability assay kit (Daeillab sevice, Korea), lipopolysaccharide (LPS:Sigma Co., U.S.A.), 2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH : Sigma Co., U.S.A.), 2, 2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS : Sigma Co., U.S.A.), Milliplex map mouse cytokine/chemokine magnetic bead panel immunology multiplex assay (Sigma Co., U.S.A.), Nitric oxide assay kit (Intron Co., Korea) 등을 사용하였다. 또한, 기기는 CO₂ incubator (Forma scientific Co.

데이터처리

D) 로 표시하였다. 그룹별 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하였고, student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다(^***p<0.001, ^**p<0.01, ^*p<0.05).
모든 실험 결과는 평균값±표준편차(mean±S.D) 로 표시하였다. 그룹별 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하였고, student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다(^***p<0.

성능/효과

통해 항산화 효능이 확인되었다. 또한, 항염증 효능인 일산화질소와 사이토카인 생성 역시 효능을 나타냄에 따라 항산화 및 항염증 효능을 가진 안전한 식품 소재임이 과학적으로 증명되었다. 이는 유사 질환을 유도한 동물을 통해 추가로 입증될 점이 남아있지만, 본 연구에서 확인한 바이오마커의 병리학적 기전을 근거로 노화, 아토피피부염, 류마티스관절염, 천식 등의 예방이 가능한 식품으로서의 기초적 자료 근거와 동시에 실제 임상에서의 활용 가치가 높을 것으로 판단된다.
레드비트는 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성이 농도 의존적으로 증가하였고 RAW 264.7 세포독성 평가에서 1, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군 대비 100% 이상의 생존율을 나타내었다. 이를 근거로 진행한 동일한 농도에서의 활성산소와 일산화질소, 사이토카인 등의 생성량을 확인한 결과, LPS로 생성을 유도한 음성대조군 대비 활성산소 생성은 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서, 일산화질소 및 TNF-α 생성은 1, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서, IL-6 생성은 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있게 억제하였다.
본 연구에서 radical 소거 활성을 확인한 결과, 레드비트는 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성 이대 조 군으로 사용한 증류수의 흡광도 값을 기준으로 보정하였을 때, 1, 10, 100, 1000 ㎍/㎖로 농도가 올라갈수록 증가하는 결과가 나타났다(Fig. 1). 이와 같은 결과는 유사 연구인 레드비트의 분획물을 통한 ABTS radical 소거 활성 결과와의 비교 시 EtOAc, BuOH 층 보다는 낮은 결과가 나타났으나, 70% EtOH, Hexane 층 보다 높은 활성을 보였고 식용이 가능한 침출차라는 점에서 레드비트의 섭취가 노화와 조직 손상 등의 예방이 가능한 항산화제로서의 활용 가치를 보여주고 있다고 판단된다[3].
본 연구에서 레드비트 침출차의 세포독성을 평가한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 모든 농도에서 100% 이상의 생존율을 나타내어 독성이 나타나지 않았다(Fig. 2). 이와 같은 결과는 식·의약품에서 가장 중요하다고 할 수 있는 안전성이 확보되어 침출차로써의 역할이 가능하며, 비록 추출 용매의 차이를 보이기는 하지만 이전 연구인 건조 비트 추출물이 인체 암세포 증식 억제 효과를 나타냈다는 점에서 볼 때, 안전성을 기반으로 암 예방의 효능도 기대할 수 있을 것으로 판단되나 재배지역과 제조 공정의 차이가 있어 이는 추후 연구를 통해 확인하고자 한다.
본 연구에서 레드비트의 NO 및 사이토카인생성량을 확인한 결과, LPS로 일산화질소와 사이토카인 생성량이 높아진 음성대조군 대비 일산화 질소는 약 18∼20%, IL-6는 약 5∼12%, TNF- α는 10∼20%의 생성을 억제하였으며, 일산화질소와 TNF-α 생성은 모든 농도에서, IL-6 생성은 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성을 보였다(Fig. 4). 이와 같은 결과는 대표적인 염증 매개체인 일산화질소와 사이토카인 생성을 레드비트 침출차의 섭취를 통해 효과적인 억제가 가능하며, 항산화와 항염증 역할을 근거로 노화를 비롯하여 면역질환 예방이 가능한 식품 소재임을 보여주고 있다.
본 연구에서 레드비트의 활성산소 생성량을 확인한 결과, LPS로 활성산소 생성량이 높아진 음성대조군 대비 약 10∼20%의 생성을 억제하였으며, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성을 보였다 (Fig. 3). 이와 같은 결과는 과생성된 활성산소를 레드비트 침출차의 섭취를 통해 억제할 수 있는 항산화 식품으로서의 가능성을 나타내고 있으며, 나아가 독성 평가를 통해 언급되었던 암세포 증식 억제에 관한 효능이 활성산소 생성 저해와도 관련이 있다고 생각된다.
7 세포독성 평가에서 1, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군 대비 100% 이상의 생존율을 나타내었다. 이를 근거로 진행한 동일한 농도에서의 활성산소와 일산화질소, 사이토카인 등의 생성량을 확인한 결과, LPS로 생성을 유도한 음성대조군 대비 활성산소 생성은 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서, 일산화질소 및 TNF-α 생성은 1, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서, IL-6 생성은 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있게 억제하였다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 레드비트는 세포독성 평가를 통해 안전성이 확보되었으며, DPPH, ABTS radical 소거 활성과 활성산소 생성량을 통해 항산화 효능이 확인되었다. 또한, 항염증 효능인 일산화질소와 사이토카인 생성 역시 효능을 나타냄에 따라 항산화 및 항염증 효능을 가진 안전한 식품 소재임이 과학적으로 증명되었다.

후속연구

이와 같은 결과는 과생성된 활성산소를 레드비트 침출차의 섭취를 통해 억제할 수 있는 항산화 식품으로서의 가능성을 나타내고 있으며, 나아가 독성 평가를 통해 언급되었던 암세포 증식 억제에 관한 효능이 활성산소 생성 저해와도 관련이 있다고 생각된다. 따라서 레드비트 침출차는 노화와 암 예방 등의 가능성을 가지는 식품으로서의 개발이 가능할 수 있을 것으로 보여진다.
또한, 항염증 효능인 일산화질소와 사이토카인 생성 역시 효능을 나타냄에 따라 항산화 및 항염증 효능을 가진 안전한 식품 소재임이 과학적으로 증명되었다. 이는 유사 질환을 유도한 동물을 통해 추가로 입증될 점이 남아있지만, 본 연구에서 확인한 바이오마커의 병리학적 기전을 근거로 노화, 아토피피부염, 류마티스관절염, 천식 등의 예방이 가능한 식품으로서의 기초적 자료 근거와 동시에 실제 임상에서의 활용 가치가 높을 것으로 판단된다.
2). 이와 같은 결과는 식·의약품에서 가장 중요하다고 할 수 있는 안전성이 확보되어 침출차로써의 역할이 가능하며, 비록 추출 용매의 차이를 보이기는 하지만 이전 연구인 건조 비트 추출물이 인체 암세포 증식 억제 효과를 나타냈다는 점에서 볼 때, 안전성을 기반으로 암 예방의 효능도 기대할 수 있을 것으로 판단되나 재배지역과 제조 공정의 차이가 있어 이는 추후 연구를 통해 확인하고자 한다. [13].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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