Jang, Eun-A
(Department of Anesthesiology and Pain Medicine Chonnam National University Medical School & Hospital)
,
Son, Sung-Kuk
(Department of Anesthesiology and Pain Medicine Chonnam National University Medical School & Hospital)
,
Kang, Jeong-Hyeon
(Department of Anesthesiology and Pain Medicine Chonnam National University Medical School & Hospital)
,
Lee, Seongheon
(Department of Anesthesiology and Pain Medicine Chonnam National University Medical School & Hospital)
,
Kwak, Sang-Hyun
(Department of Anesthesiology and Pain Medicine Chonnam National University Medical School & Hospital)
This study was undertaken to clarify the effects of omega-3 fatty acid on endotoxin-induced acute lung injury. Rabbits were randomly assigned to one of four groups. Each group received intravenous infusion of saline only, saline and Escherichia coli endotoxin, omegaven infuison (0.5 mL/kg/hr) and en...
This study was undertaken to clarify the effects of omega-3 fatty acid on endotoxin-induced acute lung injury. Rabbits were randomly assigned to one of four groups. Each group received intravenous infusion of saline only, saline and Escherichia coli endotoxin, omegaven infuison (0.5 mL/kg/hr) and endotoxin, lipoven (0.5 mL/kg/hr) and endotoxin respectively. Infusion of saline was started 0.5 hr before the infusion of saline or endotoxin, and omegaven and lipoven were started 2 hours after endotoxin infusion for 4 hours. The lungs of rabbits were ventilated with 40% oxygen. Mean blood pressure, heart rate, arterial oxygen tension (PaO2), and peripheral blood leukocyte were recorded. The wet/dry (W/D) weight ratio of lung and lung injury score were measured, and analysis of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was done. Endotoxin decreased PaO2, and peripheral blood leukocyte and platelet count. And it increased W/D ratio of lung, lung injury score and leukocyte count, percentage of PMN cells, concentration of IL-8 in BALF. Omegaven attenuated all these changes except for peripheral blood leukocyte counts. Omegaven attenuated endotoxin-induced acute lung injury in rabbits mainly by inhibiting neutrophil and IL-8 responses, which may play a central role in endotoxin-related lung injury.
This study was undertaken to clarify the effects of omega-3 fatty acid on endotoxin-induced acute lung injury. Rabbits were randomly assigned to one of four groups. Each group received intravenous infusion of saline only, saline and Escherichia coli endotoxin, omegaven infuison (0.5 mL/kg/hr) and endotoxin, lipoven (0.5 mL/kg/hr) and endotoxin respectively. Infusion of saline was started 0.5 hr before the infusion of saline or endotoxin, and omegaven and lipoven were started 2 hours after endotoxin infusion for 4 hours. The lungs of rabbits were ventilated with 40% oxygen. Mean blood pressure, heart rate, arterial oxygen tension (PaO2), and peripheral blood leukocyte were recorded. The wet/dry (W/D) weight ratio of lung and lung injury score were measured, and analysis of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was done. Endotoxin decreased PaO2, and peripheral blood leukocyte and platelet count. And it increased W/D ratio of lung, lung injury score and leukocyte count, percentage of PMN cells, concentration of IL-8 in BALF. Omegaven attenuated all these changes except for peripheral blood leukocyte counts. Omegaven attenuated endotoxin-induced acute lung injury in rabbits mainly by inhibiting neutrophil and IL-8 responses, which may play a central role in endotoxin-related lung injury.
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문제 정의
이때 염증 부위에서 방출되는 화학물질을 화학유인물질(chemo-attractants)이라 이름 부르며, Arachidonic acid에서 파생되는 Leukotriene B4가 포함된다. 그 기전이 아직은 명확하진 않으나 화학유인물질와관련된 수용체에 대한 길항 작용 또는 발현감소에 영향을 미칠 것으로 예측되기에(Lewis et al., 1990; Schmidt et al., 1991; Sperling et al., 1993; Calder, 2013), 우리는 Endotoxin으로 유발된 급성 폐 손상에 오메가-3 지방산이 풍부한 지방 유제인 Omegaven의 화학유인물질과 관련된 항염증 효과를 알아보고자 하였다.
제안 방법
식염수는 Ethylendiamine tetraacetic acid (EDTA)-2Na를 포함하고 있었으며, 백혈구의 대사를 막기 위해 4℃로 냉각시켰다. BALF로 세포수와 세포 분화를 분석하였다.
5 mL/kg/hr 로 4시간 동안 투여한 E-L 그룹(n=7)으로 나누었다. S-S 그룹과 S-E 그룹은 Lipoven과 Omegaven 같은 용량의 Saline을 투여하였다. 모든 그룹은 Endotoxin 투여 시점부터 6시간까지 Saline이나 실험약물을 투여하였다(Fig.
Saline나 Endotoxin 투여 6시간 후 실험 동물들은 치오펜탈 과량 투여로 희생시켰다. 그 직후 토끼의 흉곽을 열어서 폐를 일괄적으로 제거하여 좌측 폐 상엽은 wet-dry weight ratio를 측정하고, 좌측 폐 하엽은 폐 손상 점수(lung injury score), 우측 폐는 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 의 백혈구수와 다핵호중구의 백분율, IL-8의 농도를 측정하였다.
05 mg/kg/hr)를 지속 주입하였다. 기계 환기기 (Servo 900B, Siemen-Elema, Solna, Sweden)를 이용하여 실험동물의 폐를 기계 환기하였다(흡기압 15 cmH2O, 호 기말양압 3 cmH2O, 산소 농도 40%, I:E ratio 1:2) 호흡수는 이산화탄소분압(PaCO2)이 35~50 mmHg으로 유지되도록 조절하였다.
동맥혈 가스 분석과 백혈구와 혈소판수의 측정을 위해 Saline나 Endotoxin 투여 30분 전, 투여 시, 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6시간에 동맥혈 채취를 시행하였다. Saline나 Endotoxin 투여 6시간 후 실험 동물들은 치오펜탈 과량 투여로 희생시켰다.
동맥혈은 혈액 가스 분석기(GEM Premier Plus, Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, U.S.A.)를 이용하여 동맥혈 산소분압(PaO2), 이산화탄소분압(PaCO2), pH, 염기과잉 (Base excess)을 분석하였다. 말초혈액 백혈구수는 세 포수분석기(XE2100, Sysmex, Kobe, Japan)로 측정하였다.
)를 이용하여 동맥혈 산소분압(PaO2), 이산화탄소분압(PaCO2), pH, 염기과잉 (Base excess)을 분석하였다. 말초혈액 백혈구수는 세 포수분석기(XE2100, Sysmex, Kobe, Japan)로 측정하였다.
먼저 실험 동물들을 Ketamine hydrochloride (30 mg/kg) 과 Xylazin hydrochloride (0.3 mg/kg)으로 마취한 후 수액과 약물의 지속적 주입을 위해 귀의 이 정맥에 카테터를 삽입하였다. 이 정맥관을 통해 실험이 끝날 때까지 Lactated Ringer's solution을 8 mL/kg/hr의 속도로 투여하였다.
S-S 그룹과 S-E 그룹은 Lipoven과 Omegaven 같은 용량의 Saline을 투여하였다. 모든 그룹은 Endotoxin 투여 시점부터 6시간까지 Saline이나 실험약물을 투여하였다(Fig. 1).
실험 동물의 체온유지를 위해 식도 온도를 36.5℃에서 37.5℃로 유지하도록 전기 담요에 누이고, 가열 등으로 비춰주었다. 지속적인 동맥압의 감시와 동맥혈 검사를 위해 경동맥을 통해 대동맥으로 카테터를 삽입하였다.
고정된 후 잘라낸 절편은 Hematoxylin과 Eosin 으로 염색하였다. 실험에 대해 모르는 두 명의 관찰자가광현미경으로 절편을 관찰한 후 폐포의 울혈, 출혈, 부종, 공기층과 혈관벽에 호중구의 침윤과 응집정도, 폐포벽의두께와 유리질막 형성 등을 종합 평가하여, 손상의 정도를 0(손상없음)부터 4(최대 손상)까지 점수를 매겼다.
우측 폐에서 BALF를 수집하였다. 우측 기관지를 통해 35 mL의 식염수를 다섯 차례에 걸쳐 천천히 주입하고 회수하기를 반복하였다. 식염수는 Ethylendiamine tetraacetic acid (EDTA)-2Na를 포함하고 있었으며, 백혈구의 대사를 막기 위해 4℃로 냉각시켰다.
이 정맥관을 통해 실험이 끝날 때까지 Lactated Ringer's solution을 8 mL/kg/hr의 속도로 투여하였다. 자발 호흡 상태에서 기관절개(tracheostomy)를 무균적으로 시행 후 기관 내 삽관하였고(3.5-mm 커프 없는 튜브), 마취의 유지와 근 이완을 위해 Ketamine (3 mg/kg/hr)과 Vecuronium bromide (0.05 mg/kg/hr)를 지속 주입하였다. 기계 환기기 (Servo 900B, Siemen-Elema, Solna, Sweden)를 이용하여 실험동물의 폐를 기계 환기하였다(흡기압 15 cmH2O, 호 기말양압 3 cmH2O, 산소 농도 40%, I:E ratio 1:2) 호흡수는 이산화탄소분압(PaCO2)이 35~50 mmHg으로 유지되도록 조절하였다.
건조시킨 후 무게를 측정하였다. 조직의 부종 정도를 평가하기 위해 wet/dry weight ratio를 계산하였다.
좌폐상엽의 무게를 잰 다음 60℃ 오븐에서 48시간 동안 건조시킨 후 무게를 측정하였다. 조직의 부종 정도를 평가하기 위해 wet/dry weight ratio를 계산하였다.
5℃로 유지하도록 전기 담요에 누이고, 가열 등으로 비춰주었다. 지속적인 동맥압의 감시와 동맥혈 검사를 위해 경동맥을 통해 대동맥으로 카테터를 삽입하였다.
대상 데이터
2.0~2.5 kg의 수컷 백색 토끼(Damul science, 대전)를 사용하였다. 실험 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었으며, 12시간의 낮과 밤의 순환을 유지하였다.
우측 폐에서 BALF를 수집하였다. 우측 기관지를 통해 35 mL의 식염수를 다섯 차례에 걸쳐 천천히 주입하고 회수하기를 반복하였다.
데이터처리
± 표준편차로 표시하였다. 데이터 값들의 분석은 다중비교를 이용하였다. 여러 시간에 대해 측정한 데이터 값들에 대해서는 ANOVA 검정 후 Dunnett의 검정을이용하였으며, 단일 시간에 대해 측정한 값에 대해서는 Student's unpaired t 검정을 이용하였다.
데이터 값들의 분석은 다중비교를 이용하였다. 여러 시간에 대해 측정한 데이터 값들에 대해서는 ANOVA 검정 후 Dunnett의 검정을이용하였으며, 단일 시간에 대해 측정한 값에 대해서는 Student's unpaired t 검정을 이용하였다. 조직학적 데이터에는 Wilcoxon U-test를 이용하였다.
여러 시간에 대해 측정한 데이터 값들에 대해서는 ANOVA 검정 후 Dunnett의 검정을이용하였으며, 단일 시간에 대해 측정한 값에 대해서는 Student's unpaired t 검정을 이용하였다. 조직학적 데이터에는 Wilcoxon U-test를 이용하였다. P value 값이 0.
BALF의 성분분석 결과를 보면 S-S 그룹과 비교하여 S-E 그룹에서 백혈구의 수가 증가하였고, 이는 말초혈액에서 폐포 내로 백혈구의 이동을 의미하는데 Omegaven 은 이 증가 정도를 유의하게 감소시켰다(Fig. 4). 또한 S-S 그룹과 비교하여 S-E 그룹에서 다핵호중구의 백분율이 증가하였는데, Omegaven은 이 증가량을 유의하게 감소시켰다(Fig.
S-S 그룹과 비교하여 S-E 그룹에서 IL-8의 농도가 증가하였고, Omegaven은 이 증가량을 유의하게 감소시켰다 (Fig. 6).
Wet/dry weight ratio는 S-S 그룹과 비교하여 S-E 그룹에서 증가하였고, Omegaven은 그 증가 정도를 유의하게 감소시켰다(Fig. 3).
말초 백혈구수는 S-S 그룹과 비교해서 S-E, E-O, E-L 그룹에서 점차적으로 감소하였다(Table 1). 동맥혈 산소분압은 S-E 그룹은 S-S 그룹과 비교하여 점차적으로 감소하는 양상을 보였으며, Omegaven은 동맥혈산소분압의 감소를 유의하게 감소시켰다(Fig. 2).
4). 또한 S-S 그룹과 비교하여 S-E 그룹에서 다핵호중구의 백분율이 증가하였는데, Omegaven은 이 증가량을 유의하게 감소시켰다(Fig. 5).
본 실험의 주요한 결과는 Omegaven이 Endotoxin으로 유도된 폐 손상(산소화 악화, W/D 무게 비율, 폐 손상 점수) 정도를 감소 시켰고, 또한 Endotoxin으로 인한 염증성사이토카인(IL-8)과 호중구 반응을 억제하였다.
본 연구에서 Omegaven을 사용하지 않은 그룹에 비해 Omegaven을 사용한 그룹에서 BALF에서의 IL-8의 농도가 유의하게 낮았다. 이는 Omegaven이 BALF 내에서도 내독소 혈증에 의한 사이토카인 반응을 억제하는 효과가 있는 것으로 보인다.
본 연구에서 내 독소 혈증이 있는 토끼에서 폐의 W/D 비율의 증가, 및 조직학적 변화의 정도가 Omegaven에 의해 감소되었다. 이러한 지표들은 혈관 내피 투과성 장애로 인한 폐 부종의 지표이기 때문에 중요한 발견이다.
이상으로 봤을 때 Omegaven은 폐 손상과 연관된 패혈증의 핵심역할을 한다고 알려진 백혈구와 전염증성 사이토카인인 IL-8을 부분적으로 줄여줌으로써 내독소에 의한 급성 폐 손상을 줄여준다고 생각된다.
절편의 광학현미경 사진을 비교해보면, S-E 그룹에서 부종과 출혈, 폐포벽의 비후, 폐포 공간으로의 염증 세포의 침윤이 관찰되었고, E-O 그룹에서 이러한 변화의 정도가 줄어들었음을 알 수 있었으며, 폐 손상 점수를 비교하였을 때도 Omegaven은 폐의 손상을 줄여주었음을 알 수 있다(Fig. 7).
후속연구
다양한 염증성 매개체 및 사이토카인에 의해 대식 세포, 중성구, 내피 세포 등을 활성화까지는 시간이 필요하다. 그러므로 Omegaven의 초기의 투여가 이 최종 단계의 개입을 통해 폐 손상의 약화에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
Omegaven 의 공급이 패혈증에 의한 급성 호흡 곤란 증후군을 겪고 있는 환자에게서 항염증 효과를 거둘 수 있을 것으로 생각된다. 그렇지만 급성 호흡 곤란 증후군을 가진 환자에게서 장기간에 걸친 Omegaven 투여의 효과에 대한 연구와 Omegaven의 적절한 용량을 결정하기 위한 추가적인 연구가 필요하다.
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