[논문]LPS로 유도된 RAW264.7세포주에서 황금뿌리 물추출물의 항염증활성

이예은; 박홍진; 박충범; 황승미

doi:10.9721/kjfst.2021.53.2.115

LPS로 유도된 RAW264.7세포주에서 황금뿌리 물추출물의 항염증활성
Anti-inflammatory activity of Scutellaria Baicalensis root extract in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 cells 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.53 no.2, 2021년, pp.115 - 120

이예은 (진안홍삼연구소) , 박홍진 (진안홍삼연구소) , 박충범 (진안홍삼연구소) , 황승미 (진안홍삼연구소)

초록
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Scutellaria baicalensis water extract (SWE)는 지질 다당류 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO 및 전 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성을 세포 독성을 유발하지 않고 유의하게 억제하였다. 또한, SWE는 iNOS 및 COX-2의 단백질발현을 농도의존적으로 감소시켰으며, ERK, JNK, p38과 같은 MAPKs 계열의 인산화 발현 수준을 조사한 결과 JNK와 p38의 발현 수준을 감소시켰다. 이는 SWE가 p38 인산화를 억제함으로써 iNOS, COX, 그리고 TNF-α와 같은 전 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키며 결론적으로 NO의 생성을 억제시킨다는 결과를 도출할 수 있었다. 본 연구는 항염증 효능 검증뿐 아니라 염증대사기전의 주요인자를 탐색함으로써 황금의 기능성 소재로써의 가능성을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Scutellaria baicalensis has been used as a traditional medicine for diarrhea, dysentery, hypertension, hemorrhaging, insomnia, inflammation, and respiratory infections. This study examined the anti-inflammatory effect of Scutellaria baicalensis water extract (SWE) in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. To evaluate the anti-inflammatory effect of SWE, RAW 264.7 macrophages were stimulated with LPS to induce the production of inflammation-related factors, which were measured by western blotting. In RAW 264.7 cells, SWE inhibited the production of nitric oxide (NO) without causing cell toxicity. SWE also reduced the expression of inducible NO synthase and cyclooxygenase-2 protein, as well as the production of pro-inflammatory cytokines (such as tumor necrosis factor-α). The phosphorylation levels of the mitogen-activated protein kinase family members, such as JNK and p38, were also reduced by SWE. Thus, SWE could be used as a potential anti-inflammatory agent.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. HPLC condition for the analysis of baicalin from Scutellaria baicalensis
표 Table 2. Measurement of linearity for baicalin
표 Table 3. Quantitative analysis of baicalin from Scutellaria baicalensis
그림 Fig. 1. Effects of Scutellaria baicalensis water extract (SWE) on cell viability in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were plated at a concentration of 5×10⁵ cell/mL in 96-well plate. Following 24 h of stabilization, cell were cultured in the presence of SWE and LPS (1 μg/mL) for 24 h under serum-free conditions. The cell viabilities were determined via MTT assay. Each determination was made in triplicate and the data were expressed as means±SD.
그림 Fig. 2. Effects of Scutellaria baicalensis water extract (SWE) on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were plated at a concentration of 5×10⁵ cell/mL in 96-well plate. Following 24 h of stabilization, cell were cultured in the presence of SWE and LPS (1 μg/mL) for 24 h under serum-free conditions. The NO production were determined by Griess reaction. Each determination was made in triplicate and the data were expressed as means±SD. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001, compared with LPS stimulated control group.
그림 Fig. 3. Effects of Scutellaria baicalensis water extract (SWE) on expression of iNOS and COX-2 protein and production of proinflammatory cytokines in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) RAW 264.7 cells were treated with SWE (31.2-500 μg/mL) and LPS (1 μg/ mL) for 24 h. Equal amounts of whole cell extract were separated on SDS-PAGE gels, and iNOS, COX-2 and TNF-α were detected by western blot. β-actin was used as a control. (B) iNOS, COX-2, TNF-α to β-actin ratio were calculated based on the relative level of each protein after the determination of the intensity of each band using an imaging densitometer. Data are mean±SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001, compared with LPS stimulated control group.
그림 Fig. 4. Inhibition of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) phosphorylation by Scutellaria baicalensis water extract (SWE) in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) RAW 264.7 cells were plated at a concentration of 5×10⁵ cell/mL in 100 π dish. Following 24h of stabilization, cells were cultured in the presence of SWE and LPS (1 μg/mL) for 24 h under serum-free conditions. Equal amounts of whole cell extract were separated on SDS-PAGE gels, and ERK/pERK, p38/pp38, JNK/pJNK and β-actin were detected by western blot. (B) ERK/pERK, p38/pp38, JNK/pJNK ratio was calculated based on the relative level of each protein after the determination of the intensity of each band using an imaging densitometer. Data are mean±SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001, compared with LPS stimulated control group.

AI 본문요약
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문제 정의

다른 세포의 사이토카인에 의해 활성화된다(Iontcheva 등, 2004; Li 등, 2015). 그러므로 본 연구에서는 SWE의 항염증 효과를 확인하기 위하여 먼저 대식세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. RAW264.
하지만 MAPK 경로 관련 면역 매개 인자들에 대한 연구는 부족한 것으로 판단되었다. 따라서 본 연구에서는 LPS로 염증반응을 일으켜 활성화된 RAW 264.7세포에서 황금 물 추출물의 iNOS, COX-2, 그리고 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인에 미치는 영향을 조사하고 더 나아가 염증반응의 주요 신호전달 분자인 MAPKs의 인산화 조사를 통해 염증 매개 물질에 대한 염증 완화 효과를 나타내는지 연구하여 황금의 항염증 효과를 조사하고자 하였고 유의한 연구결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
이는 SWE가 p38 인산화를 억제함으로써 iNOS, COX, 그리고 TNF-α와 같은 전 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키며 결론적으로 NO의 생성을 억제시킨다는 결과를 도출할 수 있었다. 본연구는 항염증 효능 검증뿐 아니라 염증대사기전의 주요 인자를 탐색함으로써 황금의 기능성 소재로써의 가능성을 시사한다.

제안 방법

하였다(Park 등, 2014). Baicalin 표준용액은 baicalin standard (572667, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) 1mg을 50% 에탄올 0.5mL로 용해시켜 2000µg/mL으로 조제한 것을 50% 에탄올을 가해 1000, 500, 250, 125µg/mL으로 희석시켜 표준용액으로 사용하였고, 분말형태의 SWE 10mg을 10mL 메탄올에 용해하여 0.45μm syringe filter (Advantec)를 통하여 여과한 후 그 여액 10μL를 HPLC (Fast-HPLC, Agilent 1260 Infinity, CA, USA)에 injection하였다. 컬럼은 CAPCELL PAK C₁₈ (4.
0mL/min이며, 이동상 용매 조건은 Table 1 조건과 같이 분석하였다. Baicalin에 대해서 각각 275nm에서 125, 250, 500, 1000 그리고 2000µg/mL의 농도로 분석하여 크로마토그램을 얻고 이로부터 평균면적을 얻어 검량곡선을 그려 정량하였다.
TBST로 3회 washing하고, HRP- conjugated secondary antibody로 3시간 동안 실온에서 반응시킨 후 다시 TBST로 3회 washing하였다. ECL kit (ECL plus western blotting substrate, Thermo, MA, USA)를 사용하여 목적 단백질을 검출하고 필름으로 현상하여 분석하였다.
7에서 iNOS 및 전염증성 세포 활성 물질 발현에 관여한다(Kim 등, 2011). RAW264.7 세포에 LPS (1μg/mL)와 SWE를 농도별(31.2, 62.5, 125, 250, 500μg/mL) 로처리하여 western blot을 수행하였고 β-actin으로 이들 단백질의 정량화를 확인하였다. 실험결과, LPS로 자극한 세포에서 phospho- ERK, phospho-JNK와 phospho-p38의 발현이 현저히 증가하였고 SWE를 전처리한 세포에서 phospho-JNK와 phospho-p38 발현이 감소하는 것으로 보아 SWE가 JNK와 p38의 인산화를 억제하는 것을 알 수 있고 ERK의 인산화에는 영향을 끼치지 않는 것으로 확인하였다(Fig.
RAW264.7세포로부터 생성된 NO 함량은 Griess 원리를 기반으로 만들어진 NO Plus Detection kit (21023, iNtRON, SungNam, Korea)를 이용하여 측정하였다. RAW264.
7세포로부터 생성된 NO 함량은 Griess 원리를 기반으로 만들어진 NO Plus Detection kit (21023, iNtRON, SungNam, Korea)를 이용하여 측정하였다. RAW264.7세포를 10% FBS, 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 5×10 cell/mL로 조절한 후 96-well plate에 접종하고 37 C, 5% CO₂의 습윤배양기에서 24시간 안정화하였다. 안정화된 세포에 LPS (1μg/mL)와 SWE를 농도별(31.
RAW264.7세포를 10% FBS, 100IU/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 5×10 cell/mL로 100 π dish에 분주하고 37 C, 5% CO₂의 습윤배양기에서 24 시간 안정화하였다. 안정화된 세포에 LPS (1μg/mL)와 SWE를 농도별(31.
SWE의 염증 매개물질 기전을 탐색하기 위해서 MAPKs 경로를 조사하였다. MAPK는 세포분화 및 성장의 조절뿐만 아니라사이토카인과 스트레스에 대한 세포 내 반응을 조절하는 중요한 역할을 한다(Park 등, 2018).
, Wonju, Korea)에서 3시간 동안 진탕하며 2회 반복 열수 추출을 하였고, 얻어진 용액을 합하여 여과하였다. 그 후 회전 감압 농축하여 용매를 증발시켜 추출물을 얻었고 이를 동결 건조하여 분말 형태의 황금 물추출물(SWE)을 얻었다. 분말형태의 SWE를 증류수로 녹여 시험농도로 만든 후 0.
또한 SWE에 함유되어있는 baicalin을 정량하기 위해 HPLC를 이용하여 baicalin standard 125, 250, 500, 1000, 그리고 2000µg/mL의 농도로 제조하여 기기분석을 하였고. 농도에 따른 검량곡선을 그려 직선식을 구하였다(Table 2). SWE 함유된 baicalin 정량 분석 결과 100.
42%로 나타났다. 또한 SWE에 함유되어있는 baicalin을 정량하기 위해 HPLC를 이용하여 baicalin standard 125, 250, 500, 1000, 그리고 2000µg/mL의 농도로 제조하여 기기분석을 하였고. 농도에 따른 검량곡선을 그려 직선식을 구하였다(Table 2).
이후 배지를 제거하고 100 μL의 DMSO를 이용해 formazan을 용해시켜주고 37 C 환경에서 30분간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 TM micro plate reader (Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader, Biotek, CA, USA)로 570 nm에서의 흡광도를 측정하였고 대조군과 비교하여 세포 생존률 %로 나타내었다.
그 후 회전 감압 농축하여 용매를 증발시켜 추출물을 얻었고 이를 동결 건조하여 분말 형태의 황금 물추출물(SWE)을 얻었다. 분말형태의 SWE를 증류수로 녹여 시험농도로 만든 후 0.45μm syringe filter (25HP045AN Syringe Filters, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과하여 본 연구에 사용하였다.
5, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000μg/mL)로 24시간 처리하였다. 세포배양액을 제거하고 배지로 희석한 MTT시약(0.05mg/ mL, 298-93-1, Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherland)을 100 μL씩 처리한 후 빛이 차단된 37 C 환경에서 2시간 반응시켰다. 이후 배지를 제거하고 100 μL의 DMSO를 이용해 formazan을 용해시켜주고 37 C 환경에서 30분간 반응시킨다.
재배한 1년산 황금 뿌리로 분말화된 제품을 구입하였다. 시료를 10배의 증류수로 혼합하여 80 C의 항온수조 (MultiPurpose Extration Water Bath, WEB-6, Daihan Scientific Co. Ltd., Wonju, Korea)에서 3시간 동안 진탕하며 2회 반복 열수 추출을 하였고, 얻어진 용액을 합하여 여과하였다. 그 후 회전 감압 농축하여 용매를 증발시켜 추출물을 얻었고 이를 동결 건조하여 분말 형태의 황금 물추출물(SWE)을 얻었다.
7 세포에서의 SWE의 NO 생성억제효능을 검증하였고 LPS 자극에 의해 NO를 생성하는 것으로 알려져있는 iNOS와 염증단계에서 중요한 역할을 하는 전 염증성 사이토카인인 COX- 2, 그리고 LPS 자극의 주요 매개체로 선천면역반응에 있어서 중요한 역할을 하는 TNF-α의 단백질 발현 수준의 조사를 통해 SWE 의 항염증효과를 조사하였다(Lee 등, 2003). 안정화된 RAW264.7 세포에 LPS (1μg/mL)와 SWE를 농도별(31.2, 62.5, 125, 250, 500μg/mL)로 24시간 처리한 후 western blot을 통해 단백질 발현을 확인하였고 β-actin으로 이들 단백질의 정량화를 나타내었다. 실험결과, 대식세포에 LPS를 처리함에 따라 iNOS, COX-2 그리고 TNF-α 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
7세포를 10% FBS, 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 5×10 cell/mL로 조절한 후 96-well plate에 접종하고 37 C, 5% CO₂의 습윤배양기에서 24시간 안정화하였다. 안정화된 세포에 LPS (1μg/mL)와 SWE를 농도별(31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000μg/mL)로 동시처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포배양 상등액 100μL와 Griess시약을 혼합하여 96-wellplate에서 20분동안 반응시킨 후 micro plate reader (Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader, Biotek, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하고 NO standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
7세포를 10% FBS, 100IU/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 5×10 cell/mL로 100 π dish에 분주하고 37 C, 5% CO₂의 습윤배양기에서 24 시간 안정화하였다. 안정화된 세포에 LPS (1μg/mL)와 SWE를 농도별(31.2, 62.5, 125, 250, 500μg/mL)로 동시처리한 후 24시간 배양하였다. 반응이 종료된 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 0.
5, 125, 250, 500, 1000, 2000μg/mL)로 동시처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포배양 상등액 100μL와 Griess시약을 혼합하여 96-wellplate에서 20분동안 반응시킨 후 micro plate reader (Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader, Biotek, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하고 NO standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
7세포를 10% FBS, 100 IU/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배5지를 이용하여 5×10 cell/mL로 96-well plate에 접종하고 24시간 안정화하였다. 이후 세포에 SWE를 농도별(3.9, 7.8, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000μg/mL)로 24시간 처리하였다. 세포배양액을 제거하고 배지로 희석한 MTT시약(0.
×250 mm, 5μm, Shiseido, Tokyo, Japan)을 이용하였고 이동상의 용매로는 1% acetic acid (solvent A)와 acetonitrile:methanol=7:3, 1% acetic acid (solvent B)를 사용하였다. 컬럼 온도는 40 C, 검출기는다파장검출기(Multi Wavelength Detector), UV 조건은 275nm, 유량은 1.0mL/min이며, 이동상 용매 조건은 Table 1 조건과 같이 분석하였다. Baicalin에 대해서 각각 275nm에서 125, 250, 500, 1000 그리고 2000µg/mL의 농도로 분석하여 크로마토그램을 얻고 이로부터 평균면적을 얻어 검량곡선을 그려 정량하였다.

대상 데이터

7세포에 대한 SWE의 세포독성을 MTT시약을 이용하여 측정하였다(Mosmann, 1983). RAW264.7세포를 10% FBS, 100 IU/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배5지를 이용하여 5×10 cell/mL로 96-well plate에 접종하고 24시간 안정화하였다. 이후 세포에 SWE를 농도별(3.
본 실험에 사용한 황금(진안당, 진안)은 전라북도 임실군에서 2018년도 재배한 1년산 황금 뿌리로 분말화된 제품을 구입하였다. 시료를 10배의 증류수로 혼합하여 80 C의 항온수조 (MultiPurpose Extration Water Bath, WEB-6, Daihan Scientific Co.
세포 배양을 위해 RAW264.7 세포는 5% CO₂ 및 37 C에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기(MCO-19AIC, SANYO, Tokyo, Japan)에서 10% FBS, 100U/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin 을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
45μm syringe filter (Advantec)를 통하여 여과한 후 그 여액 10μL를 HPLC (Fast-HPLC, Agilent 1260 Infinity, CA, USA)에 injection하였다. 컬럼은 CAPCELL PAK C₁₈ (4.6mm i.d.×250 mm, 5μm, Shiseido, Tokyo, Japan)을 이용하였고 이동상의 용매로는 1% acetic acid (solvent A)와 acetonitrile:methanol=7:3, 1% acetic acid (solvent B)를 사용하였다. 컬럼 온도는 40 C, 검출기는다파장검출기(Multi Wavelength Detector), UV 조건은 275nm, 유량은 1.

데이터처리

통계적 분석은 SPSS (PASWstatistics 18, SPSS Inc., IBM Corporation, Armonk, NY, USA) 분석프로그램의 One-way ANOVA, Duncan test에 준하였고 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

이론/모형

HPLC-UV 분석법에 적용하여 황금 지표성분인 baicalin의 함량분석을 하였다(Park 등, 2014). Baicalin 표준용액은 baicalin standard (572667, Sigma-Aldrich Co.
RAW264.7세포에 대한 SWE의 세포독성을 MTT시약을 이용하여 측정하였다(Mosmann, 1983). RAW264.
Following 24 h of stabilization, cell were cultured in the presence of SWE and LPS (1μg/mL) for 24 h under serum-free conditions. The cell viabilities were determined via MTT assay. Each determination was made in triplicate and the data were expressed as means±SD.
박테리아를 제거하는 기능을 하는 NO 는 과도하게 생성되면 염증을 일으켜 조직손상, 유전자변이, 신경 손상을 유발한다(Jung 등, 2010). 본 연구에서는 LPS에 의해 RAW264.7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 SWE의 억제 효과를 세포배양액으로부터 Griess assay 방법에 의해 측정하였다. NO의 생성함량은 RAW264.

성능/효과

그러므로 본 연구에서는 SWE의 항염증 효과를 확인하기 위하여 먼저 대식세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. RAW264.7 세포주에 SWE를 농도별(3.9, 7.8, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000μg/mL)로 처리한 결과 cell viability가 SWE 1000μg/mL 이하의 농도에서 96.9% 이상의 세포생존율을 가지며 2000μg/mL와 4000μg/mL에서 각각 92.9%와 84.2%로 약간의 세포독성이 보였다. 따라서 RAW264.
0μM로 현저히 증가되었다. SWE를 농도별(31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL)로 처리한 실험군은 농도의존적으로 NO 생성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었으며 500μg/mL에서 7.5μM로 유의한 억제를 보였다(Fig. 2). 이 같은 결과는 SWE가 LPS에 의해 유발된 마우스 대식세포주에서 과도한 NO 생성을 억제함으로써 염증을 완화할 수 있는 효능이 있음을 의미한다.
Scutellaria baicalensis water extract (SWE)는 지질 다당류 LPS 로 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO 및 전 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성을 세포 독성을 유발하지 않고 유의하게 억제하였다. 또한, SWE는 iNOS 및 COX-2의 단백질발현을 농도 의존적으로 감소시켰으며, ERK, JNK, p38과 같은 MAPKs 계열의 인산화 발현 수준을 조사한 결과 JNK와 p38의 발현 수준을 감소시켰다.
7 세포에서 NO 및 전 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성을 세포 독성을 유발하지 않고 유의하게 억제하였다. 또한, SWE는 iNOS 및 COX-2의 단백질발현을 농도 의존적으로 감소시켰으며, ERK, JNK, p38과 같은 MAPKs 계열의 인산화 발현 수준을 조사한 결과 JNK와 p38의 발현 수준을 감소시켰다. 이는 SWE가 p38 인산화를 억제함으로써 iNOS, COX, 그리고 TNF-α와 같은 전 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키며 결론적으로 NO의 생성을 억제시킨다는 결과를 도출할 수 있었다.
증가된 iNOS 와 COX-2 발현은 SWE를 처리함에 따라 농도의존적으로 이들 단백질 발현을 억제하였으며, 특히 SWE 250μg/mL 농도에서는 iNOS와 COX-2 발현을 공시험군과 비슷한 수준까지 억제함을 알 수 있었다. 또한, TNF-α의 경우 SWE 250μg/mL 이상의 농도에서는 발현이 관찰되지 않았고 나머지농도에서는 농도간의 단백질 발현 차이는 크게 나지는 않지만 LPS만 단독처리한 군에 비해 하향 조절되었다. 특히 SWE 62.
5, 125, 250, 500μg/mL) 로처리하여 western blot을 수행하였고 β-actin으로 이들 단백질의 정량화를 확인하였다. 실험결과, LPS로 자극한 세포에서 phospho- ERK, phospho-JNK와 phospho-p38의 발현이 현저히 증가하였고 SWE를 전처리한 세포에서 phospho-JNK와 phospho-p38 발현이 감소하는 것으로 보아 SWE가 JNK와 p38의 인산화를 억제하는 것을 알 수 있고 ERK의 인산화에는 영향을 끼치지 않는 것으로 확인하였다(Fig. 4) 이와 같은 결과는 SWE가 MAPKs 경로에서 JNK 및 p38 인산화 억제를 통해 염증성 사이토카인의 발현을 억제하여 항염증 작용을 하고 있음을 나타낸다.
5, 125, 250, 500μg/mL)로 24시간 처리한 후 western blot을 통해 단백질 발현을 확인하였고 β-actin으로 이들 단백질의 정량화를 나타내었다. 실험결과, 대식세포에 LPS를 처리함에 따라 iNOS, COX-2 그리고 TNF-α 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 증가된 iNOS 와 COX-2 발현은 SWE를 처리함에 따라 농도의존적으로 이들 단백질 발현을 억제하였으며, 특히 SWE 250μg/mL 농도에서는 iNOS와 COX-2 발현을 공시험군과 비슷한 수준까지 억제함을 알 수 있었다.
2). 이 같은 결과는 SWE가 LPS에 의해 유발된 마우스 대식세포주에서 과도한 NO 생성을 억제함으로써 염증을 완화할 수 있는 효능이 있음을 의미한다. 기존 연구는 황금 열수 추출물이 마우스 대식세포의 NO 생성을 억제한다고 보고했으며 이는 본 연구결과와 일치한다(Park 등, 2014).
또한, SWE는 iNOS 및 COX-2의 단백질발현을 농도 의존적으로 감소시켰으며, ERK, JNK, p38과 같은 MAPKs 계열의 인산화 발현 수준을 조사한 결과 JNK와 p38의 발현 수준을 감소시켰다. 이는 SWE가 p38 인산화를 억제함으로써 iNOS, COX, 그리고 TNF-α와 같은 전 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키며 결론적으로 NO의 생성을 억제시킨다는 결과를 도출할 수 있었다. 본연구는 항염증 효능 검증뿐 아니라 염증대사기전의 주요 인자를 탐색함으로써 황금의 기능성 소재로써의 가능성을 시사한다.
실험결과, 대식세포에 LPS를 처리함에 따라 iNOS, COX-2 그리고 TNF-α 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 증가된 iNOS 와 COX-2 발현은 SWE를 처리함에 따라 농도의존적으로 이들 단백질 발현을 억제하였으며, 특히 SWE 250μg/mL 농도에서는 iNOS와 COX-2 발현을 공시험군과 비슷한 수준까지 억제함을 알 수 있었다. 또한, TNF-α의 경우 SWE 250μg/mL 이상의 농도에서는 발현이 관찰되지 않았고 나머지농도에서는 농도간의 단백질 발현 차이는 크게 나지는 않지만 LPS만 단독처리한 군에 비해 하향 조절되었다.
또한, TNF-α의 경우 SWE 250μg/mL 이상의 농도에서는 발현이 관찰되지 않았고 나머지농도에서는 농도간의 단백질 발현 차이는 크게 나지는 않지만 LPS만 단독처리한 군에 비해 하향 조절되었다. 특히 SWE 62.5μg/mL에서 공시험군과 비슷한 수준으로 단백질 발현을 억제함을 알 수 있었다(Fig. 3).
황금 50g을 10배수의 증류수로 열수추출해 15.21g의 추출물을 얻었으며 수율은 30.42%로 나타났다. 또한 SWE에 함유되어있는 baicalin을 정량하기 위해 HPLC를 이용하여 baicalin standard 125, 250, 500, 1000, 그리고 2000µg/mL의 농도로 제조하여 기기분석을 하였고.

후속연구

1). 따라서 SWE는 고농도를 제외한 나머지 농도에서 독성을 보이지 않으므로 항염증 소재로서의 활용 가능성을 가지며 추후 진행되는 효능 실험 결과는 SWE의 세포독성에 의한 세포생존율 감소가 아닌 SWE의 약리활성으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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