[논문]꽃송이버섯 열수추출물이 HaCaT의 세포 연접 관련 유전자의 발현에 대한 영향

한효상

doi:10.15268/ksim.2021.9.2.083

꽃송이버섯 열수추출물이 HaCaT의 세포 연접 관련 유전자의 발현에 대한 영향
Effect of a Hot Water Extract of Sparasis Crispa on the Expression of Tight Junction-Associated Genes in HaCaT Cells 원문보기

Journal of the Korean Society of Integrative Medicine = 대한통합의학회지, v.9 no.2, 2021년, pp.83 - 92

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose : Keratinocytes are the main cellular components involved in wound healing during re-epithelization and inflammation. Dysfunction of tight junction (TJ) adhesions is a major feature in the pathogenesis of various diseases. The purpose of this study was to identify the various effects of a Sparassis crispa water extract (SC) on HaCaT cells and to investigate whether these effects might be applicable to human skin. Methods : We investigated the effectiveness of SC on cell HaCaT viability using MTS. The antioxidant effect of SC was analyzed by comparing the effectiveness of ABTS to that of the well-known antioxidant resveratrol. Reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) is the most widely applied method Quantitative RT-PCR analysis has shown that SC in HaCaT cells affects mRNA expression of tight-junction genes associated with skin moisturization. In addition, Wound healing is one of the most complex processes in the human body. It involves the spatial and temporal synchronization of a variety of cell types with distinct roles in the phases of hemostasis, inflammation, growth, re-epithelialization, and remodeling. wound healing analysis demonstrated altered cell migration in SC-treated HaCaT cells. Results : MTS analysis in HaCaT cells was found to be more cytotoxic in SC at a concentration of 0.5 mg/㎖. Compared to 100 µM resveratrol, 4 mg/㎖ SC exhibited similar or superior antioxidant effects. SC treatment in HaCaT cells reduced levels of claudin 1, claudin 3, claudin 4, claudin 6, claudin 7, claudin 8, ZO-1, ZO-2, JAM-A, occludin, and Tricellulin mRNA expression by about 1.13 times. Wound healing analysis demonstrated altered cell migration in SC-treated HaCaT cells and HaCaT cell migration was also reduced to 73.2 % by SC treatment. Conclusion : SC, which acts as an antioxidant, reduces oxidative stress and prevents aging of the skin. Further research is needed to address the effects of SC on human skin given the observed alteration of mRNA expression of tight-junction genes and the decreased the cell migration of HaCaT cells.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Primer sequence
그림 Fig 2. The effect of SC on cell viability. HaCaT cells were treated at a concentration of 24 hours. (A) Cell viability was measured by MTS analysis. (B) The number of cells was determined by counting them directly into the hemocytometer. *p<.05, comparison to control.
그림 Fig 1. ABTS Radical erasing activity of SC and resveratrol.
그림 Fig 3. The effect of SC in tight-junction related mRNA expression level. After 36 hours of 0.5 ㎎/㎖ SC treatmented on HaCaT cells, mRNA expression level was measured by Quantitative RT-PCR. *p<.05, comparison to control.
그림 Fig 4. Reduction by HaCaT cell migration of 0.5 ㎎/㎖ of SC. (A) Typical image of wound healing analysis. (B) Percentage of the mobile area of HaCaT cells treated with SC 0.25 ㎎/㎖ for 12 hours. *p<.05, comparison to control.

AI 본문요약
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문제 정의

꽃송이버섯 열수추출물이 HaCaT 세포의 밀착연접에 대한 영향은 보고되지 않았기에 본 연구는 꽃송이버섯을 열수추출하여 얻은 시료로 항산화능 과 HaCaT 세포에 미치는 독성과 밀착연접에 대한 영향을 연구하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구에서는 꽃송이버섯 열수추출물이 가지고 있는 항산화 능의 비교와 HaCaT 세포에서 밀착연접에 대한 영향을 확인하기 위해 실험을 하였다.

제안 방법

꽃송이버섯 열수추출물을 HaCaT 세포에 처리한 뒤 MTS assay를 진행하여 세포활성도를 확인하였다. HaCaT 세포를 5,000 cells/well씩 96 well plate에 분주한 후 24 시간 배양하였다.
꽃송이버섯 열수추출물이 가지는 항산화능을 ABTS assay를 통해 항산화능으로 잘 알려진 resveratrol과 비교해서 확인하였다. 그 결과 resveratrol 25, 50, 100 μ M의 항산화 효능은 각각 35.

대상 데이터

실험에 사용한 꽃송이버섯(Sparasis crispa)은 화순군에 있는 백아산 꽃송이버섯 농장에서 2020년 5월에 구입 (NO; 2020-0520)하여 초음파 세척기를 이용하여 불순물을 제거한 후 실험에 사용하였다.
실험에는 인간 유래 각질형성 세포인 HaCaT 세포를 고려대학교 생명공학과에서 분양 받아 사용하였다.

데이터처리

대조군과 각 실험군과 평균의 차이를 student's t-test로 분석하였고 p 값이 .05 미만일 경우 통계적으로 보았을 때 의미 있는 차이가 있는 것으로 판단하였다.

이론/모형

ABTS assay를 이용하여 꽃송이버섯 열수추출물의 항산화 능을 측정하였다. ABTS 7 mM과 과황산칼슘 (potassium persulfate) 2.
이전 실험을 통해 꽃송이버섯 열수추출물을 처리한 HaCaT 세포에서 밀착연접 유전자의 mRNA 발현이 다양한 변화를 확인하였다. 이러한 꽃송이버섯 열수 추출물의 작용이 HaCaT 세포의 세포이동에 대한 영향을 알아보기 위해 상처치유분석(Wound healing assay)를 진행하였다. 그 결과 농도를 0.

성능/효과

표준 세포 배양법 조건으로 1 % 100 U/mL 페니실린(penicillin), 100 μ g/mL 스트렙토마이신(streptomycin)과 10 % 소태아혈청 (fetal bovine serum)이 첨가가 된 DMEM을 이용하여 배양하였다.
2, Japan), 2X Prime Q-mater Mix (GENET BIO, Korea), DPBS (Corning, USA), potassium persulfate (Sigma, USA), Tripsin-EDTA (WELGENE, Korea), MTS solution (Promega, USA), RNase inhibitor (Enzynomics, Korea), streptomycin (WELGENE, Korea), 5X M-MLV RT reaction buffer (Promega, USA), ABTS (Sigma, USA), M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA), eCube Tissue RNA Mini Kit (PhileKorea, Korea) 등이 사용되었다. 사용된 기기는 ultrasonic cleaner (Branson, USA), CO₂ incubator (Thermo, USA), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), water bath (HAAKE, Germany), AriaMx (Agilent, USA), The Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, USA), microplate reader (Molecular Devices EMax Plus, USA) 등이다.
β-1, 3-D-glucan의 함유량이 다른 버섯에 비해 높은 꽃송이버섯은 면역증강과 항암효과가 알려지면서 식용뿐만 아니라 약용으로도 사용되고 있다(Nhu Ngoc 등, 2018). 성분 중에는 benzoic acid 계열인 veratric acid 등의 성분이 다른 버섯에 비해 많이 함유되어 있는 것으로 보고되었다(Lee 등, 2016).
ABTS 7 mM과 과황산칼슘 (potassium persulfate) 2.4 mM을 1:1로 맞추어 혼합한 후 24시간 실온에서 차광이 된 상태에서 반응시킨 후 ABTS 자유라디칼을 만들었다. ABTS 자유라디칼을 650 nm 흡광도가 0.
그 결과 resveratrol 25, 50, 100 μ M의 항산화 효능은 각각 35.2, 56.7, 72.6 %로 나타났으며 꽃송이버섯 열수추출물 항산화 효능인 Sparassis crispa는 0.5, 1, 2, 4 ㎎/㎖에서 각각 37.9, 55.5, 77.7, 90.4 %로 나타났다(Fig 1).
이러한 꽃송이버섯 열수 추출물의 작용이 HaCaT 세포의 세포이동에 대한 영향을 알아보기 위해 상처치유분석(Wound healing assay)를 진행하였다. 그 결과 농도를 0.5 ㎎/㎖로 측정하여 꽃송이버섯 열수 추출물을 처리한 HaCaT 세포의 세포이동은 대조군 대비 73.2 %로 감소하였다(Fig 4).
꽃송이버섯 열수추출물이 HaCaT 세포에 대한 세포 활성도를 MTS assay를 실시하여 실험에 처리할 수 있는 유효한 농도를 확인한 결과 0.5 ㎎/㎖의 꽃송이버섯 열수 추출물을 24시간 동안 처리한 HaCaT 세포에서 대조군대비 181.9 %의 세포활성도를 나타내었다. 세포독성 없이 약 200 % 세포성장을 확인하여 0.
농도 0.5 ㎎/㎖로 측정하여 36시간 처리한 꽃송이버섯 열수추출물을 HaCaT 세포에 qRT-PCR을 이용하여 밀착연접에 관여하는 여러가지 유전자의 mRNA 발현을 확인한 결과 꽃송이버섯 열수추출물을 처리한 HaCaT 세포에서 claudin 1, 3, 4, 6, 7, 8, Zo-1, 2, JAM-A, Claudin, Tricellulin의 mRNA 발현은 각각 1.11, 1.20, 1.46, 1.05, 1.05, 1.05, 1.21, 1.12, 1.07, 1.22, 1.15, 1.10배 증가하였다. 이 결과를 통해 꽃송이버섯 열수추출물이 HaCaT 세포의 밀착연접 유전자 발현에 다양하게 변화가 나타나는 것을 확인하였다(Fig 3).
2. 본 실험 결과 HaCaT 세포의 세포활성도를 MTS assay를 사용한 결과 대조군 대비 181.9 %의 세포 활성도를 나타내었다.
4. 본 실험에서 상처치유분석(wound healing assay)를진행한 결과 0.5 ㎎/㎖ 처리 군에서 HaCaT 세포의 세포 이동을 확인하였을 때 대조군과 대비 73.2 % 로 감소하였다.
3. 본 실험을 통해 HaCaT 세포의 밀착연접에 관여하는 유전자 claudin 1, 3, 4, 6, 7, 8, Zo-1, 2, JAM-A, Claudin, Tricellulin의 mRNA 발현이 증가하였다.
10배 증가하였다. 이 결과를 통해 꽃송이버섯 열수추출물이 HaCaT 세포의 밀착연접 유전자 발현에 다양하게 변화가 나타나는 것을 확인하였다(Fig 3).
이러한 결과들을 통해 꽃송이버섯 열수추출물은 항산화 능을 가지고 있어 피부의 산화적 손상을 효과적으로 감소시킬 수 있어 피부의 손상 및 노화 방지에도 효과가 있을 것으로 사료되며, 또한 꽃송이버섯 열수 추출물은 다양한 밀착연접 유전자의 발현에 영향을 일으키는 것으로 생각된다. 향후 꽃송이버섯 열수추출물을 활용하여 항산화제를 개발하기 위한 분자 및 세포수준에서의 기전 연구 등 더욱 세심한 연구 개발이 필요하다고 생각되어지는 바이다.
이상의 실험결과는 꽃송이버섯 열수추출물이 항산화 능을 가지고 있어 피부의 산화적 손상을 효과적으로 감소 시켜 피부의 손상 및 노화 방지에도 효과가 있을 것으로 사료된다. 또한 꽃송이버섯 열수추출물은 여러 가지 밀착연접 유전자의 mRNA 발현에 큰 영향을 미칠 것으로 사료되며, 앞으로 꽃송이버섯 열수추출물의 항산화능연구의 수행 및 확장이 필요할 것으로 생각되는 바이다.
항산화능이 있다고 가장 잘 알려진 resveratrol과 비교하여 ABTS 프리라디칼 소거능(free radical elimination ability)을 확인한 결과 4 ㎎/㎖의 항산화 능은 resveratrol 100 μM 90.4 %로 나타나 항산화 효능이 있는 것으로 나타내었다.

후속연구

이상의 실험결과는 꽃송이버섯 열수추출물이 항산화 능을 가지고 있어 피부의 산화적 손상을 효과적으로 감소 시켜 피부의 손상 및 노화 방지에도 효과가 있을 것으로 사료된다. 또한 꽃송이버섯 열수추출물은 여러 가지 밀착연접 유전자의 mRNA 발현에 큰 영향을 미칠 것으로 사료되며, 앞으로 꽃송이버섯 열수추출물의 항산화능연구의 수행 및 확장이 필요할 것으로 생각되는 바이다.
이러한 결과들을 통해 꽃송이버섯 열수추출물은 항산화 능을 가지고 있어 피부의 산화적 손상을 효과적으로 감소시킬 수 있어 피부의 손상 및 노화 방지에도 효과가 있을 것으로 사료되며, 또한 꽃송이버섯 열수 추출물은 다양한 밀착연접 유전자의 발현에 영향을 일으키는 것으로 생각된다. 향후 꽃송이버섯 열수추출물을 활용하여 항산화제를 개발하기 위한 분자 및 세포수준에서의 기전 연구 등 더욱 세심한 연구 개발이 필요하다고 생각되어지는 바이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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