선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그러나 건선 피부염은 대표적인 난치성 피부질환으로 기존의 TNF-α 저해제 등의 치료법의 한계와 부작용이 보고되고 있어 새로운 천연 소재 기반의 후보물질을 규명하고자 하였다.
- 그러나 건선 피부염은 대표적인 난치성 피부질환으로 기존의 TNF-α 저해제 등의 치료법의 한계와 부작용이 보고되고 있어 새로운 천연 소재 기반의 후보물질을 규명하고자 하였다. 이에 우리는 yakuchinone-A의 건선 피부염증 조절 기능 및 향후 소재 개발 가능성을 규명하고자 하였다. 건선 피부염 시험 모델인 TNF-α로 활성화된 HaCaT 세포에 yakuchinone-A를 처리한 결과에서 건선 피부염 지표인 IL-6, IL-8, TNF-α,CCL20의 mRNA 발현이 유의성 있게 감소하였다.
제안 방법
- HaCaT 세포에 IL-17A (100 ng/mL)과 yakuchinone-A를 농도별로 48시간 동시 처리한 결과, 최대 6μg/mL 농도까지 세포독성이 나타나지 않아 이후 실험에 yakuchinone-A의 최대 농도를 6 μg/mL로 설정하여 진행하였다(Fig 4A).
- 5 μg을 되도록 정량 한 후 Revertra ACE kit (Toyobo,OSAKA, Japan)를 활용해 cDNA를 합성하였다. PCR은 realtime PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 실험 기법을 사용하였으며 각각의 특이 primer를 사용하여 실시간으로 특정 유전자의 mRNA 발현량을 확인하였다. 사용된 Taqmanprobe는 Table 1에 표기하였다.
- RNA는 총 1.5 μg을 되도록 정량 한 후 Revertra ACE kit (Toyobo,OSAKA, Japan)를 활용해 cDNA를 합성하였다.
- Yakuchinone-A에 의해 염증성 cytokine 및 chemokine의 발현 억제 메커니즘 규명을 위해 western blot을 통해 NF-κB 및STAT3 신호전달 기작을 관찰하였다.
- 이후 암실에서 PVDF membrane에 Western ECL substrates (Bio-rad)을 처리한 후, 30분 동안 반응시킨 뒤 이미지 처리장치(Microchemi-DNR, NeveYamin, Israel)로 단백질 발현량을 측정하였다. 단백질 정량 분석은 Image J program (N.I.H, Bethesda,MD, USA)을 통해 분석하였고, 사용된 Antibody는 Table 2에 표기하였다.
- 따라서 Choi 등의 방법[26]에따라 건선 in vitro 모델인 TNF-α 및 IL-17 유도 HaCaT 세포주 시험 방법을 활용하여 yakuchinone-A에 의한 건선 관련 염증성 cytokine 발현 조절 기작에 대해 규명하였다.
- 건선 피부염 발병과 밀접한 관련이 있는 Th17 세포에서 분비되는 IL-17A는 각질형성세포를 자극하여 CCL20를 분비하는데, 이는 건선 피부염 발병 기작과 연계되어 있다고 알려진다. 따라서 우리는 HaCaT 세포에 IL-17A를 48시간 처리한 후 yakuchinone-A에 의한 CCL20 mRNA 발현을 관찰하였다. 먼저IL-17A, yakuchinone-A의 세포독성을 확인하기 위해 CCK-8assay를 수행하였다.
- 먼저 HaCaT 세포에 미치는 TNF-α의 세포독성은 최대 50ng/mL 농도까지 세포독성이 전혀 나타나지 않았으나, 선행 연구결과들을 고려하여 TNF-α는 20 ng/mL로 설정하였다.
- 따라서 우리는 HaCaT 세포에 IL-17A를 48시간 처리한 후 yakuchinone-A에 의한 CCL20 mRNA 발현을 관찰하였다. 먼저IL-17A, yakuchinone-A의 세포독성을 확인하기 위해 CCK-8assay를 수행하였다. HaCaT 세포에 IL-17A (100 ng/mL)과 yakuchinone-A를 농도별로 48시간 동시 처리한 결과, 최대 6μg/mL 농도까지 세포독성이 나타나지 않아 이후 실험에 yakuchinone-A의 최대 농도를 6 μg/mL로 설정하여 진행하였다(Fig 4A).
- 배양액은 제거하고 phenolred free-DMEM과 CCK-8reagent (DoGen bio, Seoul, Korea)를 10:1 비율로 희석한 후, 각 well 당 500 μL씩 분주하여 30분간 반응시켰다.
- 이후 HaCaT 세포에 TNF-α 및 yakuchinone-A을 동시 처리한 후 세포독성을 관찰한 결과, yakuchinone-A 10μg/mL 농도 조건까지는 세포독성이 관찰되지 않았으나, 20μg/mL농도부터 세포독성이 관찰되어 yakuchinone-A의 최대 농도값을10μg/mL로 설정하여 이후 모든 실험에 적용하였다(Fig. 1C).
- 이후 기존의 배양액을 제거하고, Serum Free-DMEM에TNF-α 20 ng/mL와 yakuchinone-A를 공동 처리한 배양액으로 교체 후 24시간 동안 반응시켰다.
- Secondary antibody를 1시간 뒤 5분씩 6번, 총 30분 동안 washing하였다. 이후 암실에서 PVDF membrane에 Western ECL substrates (Bio-rad)을 처리한 후, 30분 동안 반응시킨 뒤 이미지 처리장치(Microchemi-DNR, NeveYamin, Israel)로 단백질 발현량을 측정하였다. 단백질 정량 분석은 Image J program (N.
- 이후 염증을 유도하기 위해 TNF-α 20 ng/mL를 처리하였고, 이와 동시에 yakuchinone-A를 2.5, 5, 10 μg/mL 농도조건으로 각각2 mL씩 분주한 뒤 2시간 동안 반응시켰다.
- 피부 염증반응에서 yakuchinone-A의 항염증 효능을 확인하기 위해 제일 먼저 TNF-α에 의해 활성화된 HaCaT 세포주에yakuchinone-A를 농도별로 처리하여 Th17 세포의 활성 촉진에 중요한 IL-6/8, TNF-α cytokine 및 건선 유발 chemokine 중 하나인 CCL20의 mRNA 발현 변화를 관찰하였다.
대상 데이터
- HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum (Welgene,Gyeongsan-si, Korea)과 100U/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin(Gibco, Waltham, MA, USA)이 포함된 Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM, Welgene)에서 배양하였다.
- TNF-α은 Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, MO, USA)에서 구매하였으며, IL-17A (recombinant human IL-17A (human cell expressed) protein, CF summary)는 R&D system(Minneapolis,MN, USA)에서 구매하였다.
- 배양은37oC, CO2 5% 유지 조건의 동물세포 배양기(Panasonic,Kadoma, Osaka, Japan)에서 이루어졌다.
- 본 연구에서 사용한 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7phenylheptan3-one (Yakuchinone-A, CAS Number 78954-23-1)는 EnsolBioscience (Daejeon, Korea)에서 구매하여 사용하였다. TNF-α은 Sigma Aldrich (St.
- 본 연구에서 항염증 효능을 평가하기 위해 사용된 인간 각질형성 세포인 HaCaT 세포주는 고려대학교 생명공학원에서 분양받아 사용하였다. HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum (Welgene,Gyeongsan-si, Korea)과 100U/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin(Gibco, Waltham, MA, USA)이 포함된 Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM, Welgene)에서 배양하였다.
데이터처리
- 본 연구의 모든 실험은 3회 이상 반복 실험을 수행하였고, 얻어진 실험값에 대한 모든 통계처리는 Student’s t-test를 통해 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
- 4 Yakuchinone-A inhibited CCL20 mRNA expression in the presence of IL-17A (100 ng/mL). Cytotoxicity was confirmed by IL-17 andyakuchinone-A in HaCaT cells for up to 48 h using CCK-8 assay. (A) Cytotoxicity of yakuchinone-A was not detected up to 6 μg/mL when co-treatedwith IL-17A (100 ng/mL) in HaCaT cells.
- In-vitro 건선 피부염 시험모델은 Choi 등의 방법[26]에 따라 수행하였다. HaCaT 세포를 6 well-plate에 각 well 당 4×105cell/well이 되도록 2mL씩 분주하여 37°C, CO2 5% 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
- Yakuchinone-A의 독성이 없는 세포 처리농도를 설정하기 위해 cell counting kit-8 assay (CCK-8 assay, DoGen bio, Seoul,Korea)를 시행하였다. 세포독성 평가는 Choi 등의 방법[26]에 따라 측정하였다.
- 1A). 따라서 yakuchinone-A의 피부염증 개선 효능을 확인하기 위해 HaCaT 세포에 미치는 세포독성을 CCK-8 assay를 통해 확인하였다(Fig. 1B). 먼저 HaCaT 세포에 미치는 TNF-α의 세포독성은 최대 50ng/mL 농도까지 세포독성이 전혀 나타나지 않았으나, 선행 연구결과들을 고려하여 TNF-α는 20 ng/mL로 설정하였다.
- Yakuchinone-A의 독성이 없는 세포 처리농도를 설정하기 위해 cell counting kit-8 assay (CCK-8 assay, DoGen bio, Seoul,Korea)를 시행하였다. 세포독성 평가는 Choi 등의 방법[26]에 따라 측정하였다. HaCaT 세포주를 24 well-plate에서 약5.
성능/효과
- TNF-α에 의해 활성화된 HaCaT 세포에서 yakuchinone-A에 의한 IκB 단백질의 인산화를 관찰한 결과,TNF-α 처리군에서는 무처리군 대비 인산화된 IκB의 발현이 11.7±1.1배 증가하였고, 이때 yakuchinone-A를 2.5, 5, 10 μg/mL 농도로 동시 처리시 TNF-α 처리군 대비 각각 64.4±1.2,57.6±5.1, 79.1±5.0%로 단백질 발현이 억제되었다(Figs. 3A, B).
- TNF-α처리군에서 CCL20의 mRNA 발현은 102.7±23.7배 증가하였고,이때 yakuchinone-A을 처리한 결과 TNF-α 처리군 대비 2.5μg/mL의 저농도 조건에서 약 46.6±12.3% 수준으로 유의성있게 감소하였다(Fig. 2D).
- 건선 피부염 시험 모델인 TNF-α로 활성화된 HaCaT 세포에 yakuchinone-A를 처리한 결과에서 건선 피부염 지표인 IL-6, IL-8, TNF-α,CCL20의 mRNA 발현이 유의성 있게 감소하였다.
- 그러나 yakuchinone-A에 의한IL-8 발현량 변화는 TNF-α 처리군에서 약 7.2±0.7배로 정상적으로 증가됨이 관찰되었으나, yakuchinone-A를 농도별로 처리했을 때 저농도에서는 변화가 없었고, 10 μg/mL 농도조건에서만 TNF-α 처리군 대비 약 23.6±1.5%로 억제되었다(Fig. 2B).
- 따라서 우리는 본 연구를 통해 yakuchinoneA는 TNF-α에 의해 활성화된 keratinocyte에서 IκB뿐만 아니라 STAT3 단백질의 인산화를 유의적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 1% 수준만큼 CCL20 mRNA 발현이 감소되었다(Fig 4B). 따라서 위 결과들을 통해 IL-17A에 의해 활성화된 각질 형성 세포에서 CCL20의 발현 또한 yakuchinone-A에 의해 억제됨을 알 수 있었다.
- 따라서 위 결과로부터 우리는 yakuchinoneA가 건선 유발 cytokine인 IL-6/8, TNF-α뿐 아니라 CCL20chemokine의 mRNA 발현을 억제함을 알 수 있었다.
- 또한 HaCaT 세포에서 TNF-α에 의해 활성화된 후 yakuchinoneA에 의한 TNF-α의 mRNA 발현량을 관찰한 결과, TNF-α 처리군 대비 약 26.6±9.2, 39.1±3.1, 46.0±4.8% 수준만큼 감소되었다(Fig. 2C).
- 또한 IL-6, IL-8, CCL20 발현뿐 아니라 염증반응 촉진과 Th17분화 등에 밀접하게 연관된 STAT3 단백질의 인산화 조절 변화를 관찰한 결과, TNF-α 처리군에서는 무처리군 대비 인산화된STAT3의 발현이 약 15.0±1.5배 증가된 반면, TNF-α와 yakuchinoneA를 2.5, 5, 10 μg/mL 농도조건으로 동시 처리한 결과 TNF-α처리군 대비 63.3±2.1, 70.2±2.8, 80.8±2.3% 수준만큼 감소하였다(Figs. 3C, D).
- 또한 IL-6,IL-8, TNF-α, CCL20의 m-RNA 발현 조절은 NF-κB/IκBpathway 조절 및 STAT3의 단백질 인산화 억제를 통한 단백질 신호조절에 기인함을 확인하였다.
- 2C). 마지막으로 건선 피부염 발병에 밀접한 관련이 있는 CCL20 chemokine의 mRNA 발현을 확인하였다. TNF-α처리군에서 CCL20의 mRNA 발현은 102.
- 먼저 HaCaT세포에 TNF-α를 처리한 결과, IL-6의 mRNA 발현은 무처리군대비 약 3.4±0.3배까지 증가하였고, yakuchinone-A를 각각 2.5,5, 10μg/mL 농도로 처리한 시험군에서 TNF-α 처리군 대비 각13.4±8.3, 56.9±6.5, 61.4±7.5% 수준으로 유의성 있게 감소하여 yakuchinone-A가 농도 의존적으로 IL-6의 mRNA 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 2A).
- 따라서 추후 후속 연구를 통해 yakuchinone-A가 IKK의 직접적인 inhibitor로 작용하는지 규명할 필요가 있으며 항염증 신호전달에 대한 정확한 메커니즘 규명과 건선 피부염 마우스 모델에서의 유효성 검증이 필요하다. 위 연구 결과들을 통해 우리는 yakuchinone-A가 인간 피부 모델에서 NF-κB/IκB와STAT3 pathway를 통해 염증성 cytokine 및 chemokine CCL20발현을 억제하여 향후 건선 피부염 개선 소재 가능성을 확인하였다.
- 인간 각질 형성 세포주인 HaCaT 세포에 IL-17A(100ng/mL)을 처리한 후 yakuchinone-A를 1.5, 3, 6 μg/mL 농도로 동시 처리한 결과, IL-17A 처리군에서 CCL20의 발현이 무처리군 대비 약 6.2±0.7배 증가하였으나, yakuchinone-A를 3, 6μg/mL 농도로 동시 처리한 결과 25.0±7.4, 55.5±1.1% 수준만큼 CCL20 mRNA 발현이 감소되었다(Fig 4B).
후속연구
- 그러나 yakuchinone-A는 TNF-α 수용체 신호조절 내 ERK 등 MAPKpathway 인산화 조절에는 직접적으로 관여하지 않았다(data notshown). 따라서 추후 후속 연구를 통해 yakuchinone-A가 IKK의 직접적인 inhibitor로 작용하는지 규명할 필요가 있으며 항염증 신호전달에 대한 정확한 메커니즘 규명과 건선 피부염 마우스 모델에서의 유효성 검증이 필요하다. 위 연구 결과들을 통해 우리는 yakuchinone-A가 인간 피부 모델에서 NF-κB/IκB와STAT3 pathway를 통해 염증성 cytokine 및 chemokine CCL20발현을 억제하여 향후 건선 피부염 개선 소재 가능성을 확인하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.