[논문]비장 조직에서 에탄올 대사체(EtG, EtS)를 검출하는 방법과 유효성 확인

김수민; 조영훈; 안성희; 이우재; 권미아

doi:10.5806/ast.2021.34.3.115

비장 조직에서 에탄올 대사체(EtG, EtS)를 검출하는 방법과 유효성 확인
Method validation of detecting ethanol metabolites (EtG, EtS) in post-mortem spleen 원문보기

분석과학 = Analytical science & technology, v.34 no.3, 2021년, pp.115 - 121

김수민 (국립과학수사연구원 화학과) , 조영훈 (국립과학수사연구원 화학과) , 안성희 (국립과학수사연구원 화학과) , 이우재 (국립과학수사연구원 화학과) , 권미아 (국립과학수사연구원 화학과)

초록
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에탄올 대사체인 에틸글루쿠로나이드(ethyl glucuronide, EtG)와 에틸설페이트(ethyl sulfate, EtS)는 에탄올 섭취의 직접적인 지표물질로서 여러 생체 시료에서 법과학적으로 다양하게 연구되고 있다. 부검 변사자에게서 검출된 에탄올이 사망 전 음주에 의한 것인지 사후 부패에 의해 생성된 에탄올인지 판단하기 위해서는 에탄올 대사체를 분석할 필요가 있다. 일반적으로 혈액에서 에탄올과 함께 EtG, EtS를 검출하고 있지만 부패 상황에 따라 혈액을 확보하는 것이 어려우므로 조직 생체시료를 이용해 에탄올 대사체를 검출함으로써 이를 대체해야 한다. 본 연구에서는 조직 중에서 비장을 선택하여 LC-MS/MS를 이용해 EtG, EtS를 검출하였으며 시험법이 적합한 방법인지를 증명하기 위해 밸리데이션을 수행하여 법과학적 감정에 사용할 수 있는 분석법을 완성하고 실제 부검 사례에 적용하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Ethyl glucuronide (EtG) and ethyl sulfate (EtS), which are ethanol metabolites, are direct indicators of ethanol intake; they have been studied in a variety of biological samples in forensic science. It is necessary to analyze ethanol metabolites to determine whether the ethanol detected in autopsy cases was due to alcohol consumption before death or due to the ethanol produced from post-mortem decay. In general, EtG and EtS are detected in the blood together with ethanol; however, it may be difficult to secure blood depending on the extent of decay. Therefore, the aforementioned method should be replaced by detecting the ethanol metabolites using tissue biological samples. In this study, we determined the optimal experimental conditions for detecting EtG and EtS from spleen samples using Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). Herein, the test method was validated, and an analysis method was applied to the actual autopsy cases.

주제어

표/그림 (9)

그림 Fig. 1. LC-MS/MS chromatogram of blank tissue spiked with EtG, EtS and IS (EtG-d₅, EtS-d₅).
표 Table 1. The LC-MS/MS parameters for EtS, EtG
표 Table 2. Composition of LC mobile phase
표 Table 3. EtS and EtG?concentration in the spleen and muscle
그림 Fig. 2. (a) EtS, (b) EtG calibration using standard addition method.
표 Table 4. Intra-day and inter-day precision at different concentration levels
표 Table 5. Accuracy and precision obtained by measuring repeatedly at low concentration (0.25 μg/g)
표 Table 6. Results of recovery and matrix effect analyzed on the three different days (n=3, Low: 0.25, Med.: 2.0, High: 8.0 μg/g)
표 Table 7. Detection of ethanol, marker of putrefaction (n-PrOH), EtS and EtG concentration in spleen from 9 autopsy cases

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 조직 생체시료에서 에탄올 대사체를 검출하는 방법을 확립하기 위해 근육과 비장을 선택하여 실험을 진행하였으며 두 조직 중에서 보다 적합한 조직으로 비장을 선택하였다. 그리고 직선성, 회수율, 정확도 등을 통해 LC-MS/MS를 이용한 시험분석법과 유효성을 검증하였다.

제안 방법

본 연구에서는 조직 생체시료에서 에탄올 대사체를 검출하는 방법을 확립하기 위해 근육과 비장을 선택하여 실험을 진행하였으며 두 조직 중에서 보다 적합한 조직으로 비장을 선택하였다. 그리고 직선성, 회수율, 정확도 등을 통해 LC-MS/MS를 이용한 시험분석법과 유효성을 검증하였다. 또한, 실제 부패된 비장의 사례를 통한 분석 결과 값으로 음주와 부패에 대한 해석을 해보았다.
근육과 비장에서 EtG와 EtS를 검출하였다. 두 조직에서 같은 실험 방법으로 에탄올 대사체를 검출한 결과, 근육보다 비장에서 약 3배 정도 더 많은 대사체농도가 검출되었다(Table 3).
두 조직에서 같은 실험 방법으로 에탄올 대사체를 검출한 결과, 근육보다 비장에서 약 3배 정도 더 많은 대사체농도가 검출되었다(Table 3). 따라서 근육이 아닌 비장 시료를 선택하여 유효화 실험을 진행하였고, 음주를 하지 않은 사람의 비장 시료를 확보하여 blank로 사용해 타겟 물질을 넣어 분석하였다.
그리고 직선성, 회수율, 정확도 등을 통해 LC-MS/MS를 이용한 시험분석법과 유효성을 검증하였다. 또한, 실제 부패된 비장의 사례를 통한 분석 결과 값으로 음주와 부패에 대한 해석을 해보았다.
선택성(Selectivity), 직선성(Linearity), 정밀도(Precision), 회수율(Recovery), 매트릭스 효과(matrix effect) 및 정확도(Accuracy) 시험을 통하여 분석법을 검증하였다. 유효성 검증을 통해 확립된 이 방법은 변사자의 혈액을 확보할 수 없을 때 조직 생체시료에서 에탄올 대사체를 검출할 수 있어 변사자의 음주 여부를 판단하는데 에탄올과 더불어 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
유효성 검증을 통해 확립된 이 방법은 변사자의 혈액을 확보할 수 없을 때 조직 생체시료에서 에탄올 대사체를 검출할 수 있어 변사자의 음주 여부를 판단하는데 에탄올과 더불어 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 실제 사례를 통해 비장의 EtG, EtS 농도 범위를 확인하고 음주 판단을 적용해보았다.

대상 데이터

공시료 (blank)는 음주를 하지 않은 변사자의 조직을 사용하였으며, 실제 사례로 사용된 비장은 부패로 인해 혈액 채취가 불가능한 변사자의 비장이었으며, 모든 조직 시료는 4℃ 냉장 보관 후 실험하였다.
본 연구에 사용된 모든 조직 시료는 당 연구원의 부검 변사자에서 알코올농도를 확인하기 위해 채취되어 의뢰된 것으로 국립과학연구원 생명윤리위원회에서 승인된 검체를 사용하였다(국립과학수사연구원 IRB No. 906-200114-BR-003-01).

이론/모형

다중반응겁지법(Multiple reaction monitoring, MRM) 을 이용하여 negative mode에서 이온을 검출하였다. 상세 조건은 다음과 같다.

후속연구

하지만 변사자의 음주 여부를 넘어 정확한 음주량을 알기 위해서는 혈액과 비장의 농도 비율 등 앞으로 연구가 더 되어야 한다. 비장 시료를 꾸준히 확보하고 EtG, EtS 농도를 검출하여 데이터를 구축해 놓는다면 변사자의 조직에서 검출한 에탄올 대사체 농도값을 음주여부 판단 및 정도를 확인하는 지표로 구축할 수 있을 것이다.
선택성(Selectivity), 직선성(Linearity), 정밀도(Precision), 회수율(Recovery), 매트릭스 효과(matrix effect) 및 정확도(Accuracy) 시험을 통하여 분석법을 검증하였다. 유효성 검증을 통해 확립된 이 방법은 변사자의 혈액을 확보할 수 없을 때 조직 생체시료에서 에탄올 대사체를 검출할 수 있어 변사자의 음주 여부를 판단하는데 에탄올과 더불어 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 실제 사례를 통해 비장의 EtG, EtS 농도 범위를 확인하고 음주 판단을 적용해보았다.
하지만 변사자의 음주 여부를 넘어 정확한 음주량을 알기 위해서는 혈액과 비장의 농도 비율 등 앞으로 연구가 더 되어야 한다. 비장 시료를 꾸준히 확보하고 EtG, EtS 농도를 검출하여 데이터를 구축해 놓는다면 변사자의 조직에서 검출한 에탄올 대사체 농도값을 음주여부 판단 및 정도를 확인하는 지표로 구축할 수 있을 것이다.

참고문헌 (19)

H. Schneider and H. Glatt, Biochem. J., 383, 543-549 (2004).

상세보기
M. Kwon, H. J. Choi, Y. H. Jo, M. H. Son, J. S. M., N. Y. Kim and J. E. Jung, Forensic Sci. Int., 302, 109857 (2019).

상세보기
R. S. Foti and M. B. Fisher, Forensic Sci. Int., 153, 109-116 (2005).

상세보기
N. E. Walsham and R. A. Sherwood, Ann Clin. Biochem., 49, 110-117 (2012).

상세보기
G. Hoiseth, G. O. Berg-Hansen and J. Morland, Forensic Sci. Int., 257, 398-402 (2015).

상세보기
K. Borucki, R. Schreiner, J. Dierkes, K. Jachau, D. Krause, S. Westphal, F. M. Wurst, C. Luley and H. Schmidt-Gayk, Alcohol Clin. Exp. Res., 29, 781-787 (2005).

상세보기
Y. H. Jo, S. M. Kim, W. J. Lee, K. W. Kim, S. H. An and M. Kwon, Korean J. Forensic Sci. Int., 21, 71-75 (2020).
H. Wang, J. Li, Z. Huang, F. Wang, Y. Zhang, J. Chang and Y. Rao, Forensic Toxicology, 38, 195-202 (2019).

상세보기
G. Hoiseth, R. Karinen, A. S. Christophersen, L. Olsen, P. T. Normann and J. Morland, Forensic Sci. Int., 165, 41-45 (2007).

상세보기
F. T. Peters, O. H. Drummer and F. Musshoff, Forensic Sci. Int., 165, 216-224 (2007).

상세보기
V. P. Shah, K. K. Midha, J. W. A. Findlay, H. M. Hill, J. D. Hulse, I. J. McGilveray, G. McKay, K. J. Miller, R. N. Patnaik, M. K. Powell, A. Tonelli, C. T. Viswanathan and A. Yacobi, Pharm. Res., 17, 1551-1557 (2000).

상세보기
Committee for Medicinal Products for Human Use, 'Guideline on bioanalytical method validation', EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Re.1 Corr.2 ** (2011).
의약품등 분석법의 밸리데이션 가이드라인 해설서, 식품의약품안전평가원, (2015).
S. Walorczyk, Talanta, 120, 106-113 (2014).

상세보기
European Commision DG-SANTE, 'Method validation and quality control: Procedures for pesticide residues analysis in food and feed', Document No. SANTE/11945/2015 (2016).
B. K. Matuszewski, M. L. Constanzer and C. M. Chavez-Eng, Anal. Chem., 75(13), 3019-3030 (2003).

상세보기
H. Wang, J. Li, Z. Huang, F. Wang, Y. Zhang, J. Chang and Y. Rao, Forensic Toxicology, 38, 195-202 (2020).

상세보기
H. Schloegl, T. Rost, W. Schmidt, F. M. Wurst and W. Weinmann, Forensic Sci. Int., 156, 213-218 (2006).

상세보기
L. Politi, L. Morini, F. Mari, A. Groppi and E. Bertol, Int. J. Legal Med., 122, 507-509 (2008).

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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