[논문]마약성과 비마약성 대마 품종의 식별을 위한 카나비놀 생합성 유전자 분석법

박현승; 오혜현; 김성민; 박지영; 김진태; 심현아; 양태진

doi:10.22889/kjp.2021.52.2.69

마약성과 비마약성 대마 품종의 식별을 위한 카나비놀 생합성 유전자 분석법
Cannabinol Synthase Gene Based Molecular Markers for Identification of Drug and Fiber Type Cannabis sativa 원문보기

생약학회지, v.52 no.2, 2021년, pp.69 - 76

박현승 (서울대학교 농업생명과학대학 농림생물자원학부, 식물유전체육종연구소) , 오혜현 (대검찰청 과학수사부 디엔에이.화학분석과) , 김성민 (대검찰청 과학수사부 디엔에이.화학분석과) , 박지영 (서울대학교 농업생명과학대학 농림생물자원학부, 식물유전체육종연구소) , 김진태 (서울대학교 농업생명과학대학 농림생물자원학부, 식물유전체육종연구소) , 심현아 (서울대학교 농업생명과학대학 농림생물자원학부, 식물유전체육종연구소) , 양태진 (서울대학교 농업생명과학대학 농림생물자원학부, 식물유전체육종연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

Cannabis sativa is an important industrial plant utilized to produce fiber, oil, and medicinal ingredients. A chemotype of cannabis is divided into "Drug type" with predominance of tetrahydrocannabinolic acid (THCA) and "Fiber type" with cannabidiolic acid (CBDA). To develop molecular markers for the discrimination of these two types, nucleotide sequences of THCA synthase and CBDA synthase as well as their pseudogenes were retrieved from the recently published cannabis genome in chromosome scale. Gene-specific SNPs were discovered by multiple alignment of these sequences, and 2 dominant marker sets from each gene were designed for selective amplification. Our markers successfully identified "Drug type" and "Fiber type" cannabis plants as well as forensic samples including processed materials. Our molecular markers will provide a fast and efficient system for molecular-based identification of the cannabis plant.

주제어

표/그림 (4)

표 Table I. Primer sequences for THCAS/CBDAS specific markers
그림 Fig. 1. A schematic diagram of the relative structure of THCAS, CBDAS, CBCAS genes and pseudogenes (ψTHCAS/ψCBDAS, Pseudogene) found in drug and non-drug Cannabis sativa and the location of THCAS/CBDAS specific SNPs. The pseudogenes discovered by BLASTN are indicated by gray bars, and those discovered in the drug type genome (ψPK) are under the THCAS gene, and the above genes discovered in the non-drug type genome (ψFN) are under the CBDAS. The nucleotide sequence variation of each gene is indicated by a vertical line. The primer positions were denoted by arrows and labeled with serial numbers in Table 1.
그림 Fig. 2. PCR amplification of various samples using allele-specific molecular markers specific to THCAS and CBDAS. Ten cannabis samples of drug type and one sample of fiber type variety, "Cheongsam" were used. M, 100bp DNA size ladder; PC, primer combinations based on the serial numbers in Table 1. (A) PCR amplification using two THCAS specific markers. (B) PCR amplification using CBDAS specific markers. (C) PCR amplification using multiplex primer pairs. Top, combination of four THCAS specific primers created three bands. Middle, Four CBDAS specific primers created two bands. Bottom, two THCAS specific primers (PK_AS _12_F, PK_AS_13_R) and two CBDAS specific primers (FN_AS_7_F, FN_AS_13_R) created single band for drug and non-drug type, respectively. Primer pairs were denoted at right side of each gel panels.
그림 Fig. 3. Application of THCAS/CBDAS specific markers to various Cannabis samples. (A) Photo of samples (provided by Supreme Prosecutors' Office). S1, 19-507 2-2, cannabis chocolate; S2, 19-506 2, cannabis cookie; S3, 19-478 2-2, cannabis seeds; S4, 19-478 1-2, cannabis seeds; S5, 19-363 2-2, forensic sample of cannabis leaves. Only the sample S5 was positive for Δ9-THC by GC/MS analysis and the others were negative. (B) PCR amplification using THCAS-specific markers. M, 100bp DNA size ladder; PC, primer combinations based on the serial numbers in Table 1. (C) PCR amplification using CBDAS-specific markers. Sample 5 seems drug-type, samples 3 and 4 seems non-drug type, and samples 1and 2 seems containing both types.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 기존에 개발되었던 대마 식별 마커들의 한계점을 극복하기 위하여 염색체 수준으로 해독된 마약성, 비마약성 대마의 전장 유전체 서열을 기반으로 마약성 성분 생합성에 관여하는 주요 유전자들의 염기서열을 비교 분석하고, 마약성 대마와 비마약성 대마를 구분할 수 있는 분자 마커를 개발하여 이를 다양한 시료에 적용하고 검증함으로써 신속하고 정확한 마약성 대마 검사 체계를 확립하는 것을 목표로 수행되었다.
본 연구에서는 카나비놀 생합성 관련 유전자를 대상으로 마약성 대마와 비마약성 대마를 식별할 수 있는 분자 마커를 개발하고자 하였다. 이를 위해 pseudomolecule 수준까지 완성된 대마 유전체 서열 Database에서 대마의 주요 카나비놀생합성 유전자인 THCAS와 CBDAS의 생합성에 관여하는 유전자 서열과 관련 위유전자 서열을 모두 발굴하였고, 각 유전자들에만 특이적인 SNP들을 대상으로 분자 마커들을 디자인하였다.

제안 방법

THCAS, CBDAS 특이 SNP 발굴 및 마커 개발 − Cannabinoid 생합성 유전자 3종과(THCAS, CBDAS, CBCAS) 앞서 발굴한 위유전자 서열들을 대상으로 MAFFT를 이용하여 다중염기서열에서의 변이 지역을 탐색하였다
감정물 시료 적용 − 유전자 기반 마약성, 비마약성 감별 마커가 실제 법생물 감정에도 이용될 수 있을지 알아보기 위하여 4쌍의 마커를 대상으로 대검찰청에서 보관중인 DNA 시료들에 대한 식별 실험을 실시하였다(Fig
본 연구에서는 카나비놀 생합성 관련 유전자를 대상으로 마약성 대마와 비마약성 대마를 식별할 수 있는 분자 마커를 개발하고자 하였다. 이를 위해 pseudomolecule 수준까지 완성된 대마 유전체 서열 Database에서 대마의 주요 카나비놀생합성 유전자인 THCAS와 CBDAS의 생합성에 관여하는 유전자 서열과 관련 위유전자 서열을 모두 발굴하였고, 각 유전자들에만 특이적인 SNP들을 대상으로 분자 마커들을 디자인하였다. 마약성이 확인된 대마 검체 DNA들과 비마약성(혹은 저마약성) 품종 청삼의 DNA에 이들을 적용하였을 때, 마약성 시료에서는 THCAS 특이 밴드만이 증폭되었으며 비마약성 청삼 시료에서는 CBDAS 특이 밴드가 선택적으로 증폭되는 것을 확인하였다.

성능/효과

각 유전자 특이 SNP 중에서 유전자 증폭 산물의 크기가 400 bp 이하가 되도록 2쌍의 조합을 선정하였으며, 이들을 각각 정방향과 역방향 primer의 3’ 말단에 위치시켜 대상 유전자만을 특이적으로 증폭될 수 있도록 allele-specific primer를 제작하였다. THCAS 특이 SNP 4개와 CBDAS 특이 SNP 4개를 각각 증폭하는 2쌍의 primer를 마약성 대마 및 비마약성 대마 품종 청삼 DNA에서 PCR 하였을 때 모두 기대했던 마커 증폭 양상을 보여주는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2A, 2B).
2C). THCAS 특이 primer들을 이용하는 multiplex PCR(PK_AS_4F, PK_AS_6R, PK_AS_12_F, PK_AS_13_R)의 경우에는 앞서 확인한 증폭산물 외에도 PK_AS_4_F primer와 PK_AS_13_R primer의 조합으로 생성된 새로운 PCR 산물이 확인되었으며, 이들은 모두 대마 시료에서만 특이적으로 증폭되었다. 반면 CBDAS 특이 primer간의 multiplex PCR(FN_AS_4_F, FN_AS_9_R, FN_AS_7_F, FN_AS_13_R)의 경우에는 기존 primer 조합으로 증폭된 산물이 아닌 다른 조합에서 유래된 크기의 증폭 산물만이 관찰되었으나 여전히 비마약성 대마 품종 청 삼에서만 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있었다.
반면 CBDAS 특이 primer간의 multiplex PCR(FN_AS_4_F, FN_AS_9_R, FN_AS_7_F, FN_AS_13_R)의 경우에는 기존 primer 조합으로 증폭된 산물이 아닌 다른 조합에서 유래된 크기의 증폭 산물만이 관찰되었으나 여전히 비마약성 대마 품종 청 삼에서만 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있었다. 또한 THCAS 특이 primer 1쌍과 CBDAS 특이 primer 1쌍을 서로 섞어 multiplex PCR을 하였을 때에도(PK_AS_12_F, PK_AS_13_R, FN_AS_7_F, FN_AS_13_R), THCAS 특이조합은 대마 시료에서만, 그리고 CBDAS 특이 조합은 비마약성 대마 품종 청삼 시료에서만 특이적으로 PCR 산물을 증폭하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 위해 pseudomolecule 수준까지 완성된 대마 유전체 서열 Database에서 대마의 주요 카나비놀생합성 유전자인 THCAS와 CBDAS의 생합성에 관여하는 유전자 서열과 관련 위유전자 서열을 모두 발굴하였고, 각 유전자들에만 특이적인 SNP들을 대상으로 분자 마커들을 디자인하였다. 마약성이 확인된 대마 검체 DNA들과 비마약성(혹은 저마약성) 품종 청삼의 DNA에 이들을 적용하였을 때, 마약성 시료에서는 THCAS 특이 밴드만이 증폭되었으며 비마약성 청삼 시료에서는 CBDAS 특이 밴드가 선택적으로 증폭되는 것을 확인하였다. 다만 THCAS, CBDAS 유전자 서열의 변이로 인한 잠재적인 위양성 발생 가능성 및 마약성분이 없는 부위를 이용한 제품에서의 마커 증폭 가능성을 배제할 수 없기 때문에, 이화학적 분석을 병행하고, 알려진 검체들을 이용하여 충분한 검증 과정을 거칠 필요가 있다.

후속연구

마약성이 확인된 대마 검체 DNA들과 비마약성(혹은 저마약성) 품종 청삼의 DNA에 이들을 적용하였을 때, 마약성 시료에서는 THCAS 특이 밴드만이 증폭되었으며 비마약성 청삼 시료에서는 CBDAS 특이 밴드가 선택적으로 증폭되는 것을 확인하였다. 다만 THCAS, CBDAS 유전자 서열의 변이로 인한 잠재적인 위양성 발생 가능성 및 마약성분이 없는 부위를 이용한 제품에서의 마커 증폭 가능성을 배제할 수 없기 때문에, 이화학적 분석을 병행하고, 알려진 검체들을 이용하여 충분한 검증 과정을 거칠 필요가 있다.
최근 대마 의원형을 알 수 없도록 가공한 제품이나 미량의 마약 성분이 남아있는 종자의 껍질을 탈각을 하지 않은 상태로 소지 할 경우 마약성분이 검출되거나 DNA검사로 대마 품종이 확인되면 단속 대상이다. 하지만 의료용 대마 사용 합법화와 CBD의 효능에 기초하여 개발되는 다양한 건강기능성 제품 등이 각광을 받고 있기 때문에, 미량의 마약성분 검출이 어려운 불법 대마 가공품에 일부 적용하고 있던 기존 엽록체 DNA바코드 서열 기반 마약성/비마약성 대마 종 식별법 보다 마약성분 생성 유전자 존재 여부까지 세부적으로 식별할 수 있는 본 연구의 성과는 의미가 크다고 할 수 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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