[논문]하이드록실아민 절단을 이용한 재조합 인간 상피세포 성장인자의 제조

김선호; 이우일

doi:10.5762/kais.2021.22.6.542

하이드록실아민 절단을 이용한 재조합 인간 상피세포 성장인자의 제조
Preparation of Recombinant Human Epidermal Growth Factor by Hydroxylamine Cleavage 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.22 no.6, 2021년, pp.542 - 549

김선호 (건양대학교 의료신소재학과) , 이우일 (건양대학교 의료신소재학과)

초록
AI-Helper

본 연구의 목적은 재조합 인간 상피세포 성장인자(hEGF)의 발현 확인 및 정제의 용이성을 위해 단백질의 N-말단에 융합된 부분을 제거하기위하여 기존의 고가의 효소를 사용하지 않고 간단한 화학처리로 융합 태그를 절단하면서도 여전히 친화성 크로마토그래피로 정제가 가능한 재조합 hEGF의 경제적이며 공정이 단순화된 제조법을 제공하는 것이다. 인간 상피세포 성장 인자는 인간 세포 성장 및 증식에 매우 중요한 호르몬이며 이 단백질에 대한 발현 및 정제에 관한 많은 연구가 보고 되었다. 본 연구에서는 hEGF 유전자를 대장균 코돈에 최적화 하였으며 N-말단에 Hydroxylamine에 의한 절단이 가능한 Asparagine과 Glycine이 발현되도록 포함하여 설계하였다. 제조한 DNA를 대장균 발현 벡터인 pRSET_A에 삽입하여 발현용 균주 BL21 (DE3)에 형질전환 시켰으며 재조합 융합 단백질은 대장균에서 샤페론 벡터 pG-Tf2와 성공적으로 공발현 되었다. 발현된 융합 단백질은 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피로 정제한 후 Hydroxylamine으로 처리해 N-말단 융합부분을 제거하였으며 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. ELISA 분석 결과 재조합 EGF의 활성이 상업용 hEGF와 92% 이상 유사한 것으로 나타났으며 피부 섬유아세포의 세포증식을 촉진하는 것으로 확인 되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to provide an economical and easy preparation method for recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) without the need for an expensive enzyme to cleave the fusion part. However, the N-terminal fusion part is still useful for affinity chromatography. The hEGF is an important hormone in cell growth and proliferation in humans, and many studies on the expression and purification of this protein have been reported. In the present study, the hEGF gene was designed to be optimized with the E. coli codon usage preference and to contain Asn-Gly at the N-terminus of the protein. The gene was inserted into pRSET_A, an E. coli expression vector, and transformed into E. coli BL21 (DE3). The recombinant fusion protein was successfully co-expressed with pG-Tf2, a chaperone vector, in E. coli and purified by Ni-NTA column chromatography. The rhEGF was then released by hydroxylamine treatment and confirmed by SDS-PAGE. ELISA analysis showed that the activity of the free rhEGF was more than 92% similar to that of commercial EGF. The biological activity of the rhEGF was confirmed by a cell proliferation test with human skin fibroblasts.

주제어

표/그림 (9)

그림 Fig. 1. Schematic representation of the expression vector pHAEGF
표 Table 1. Primer design for amplification of hEGF. The restriction enzyme recognition site is underlined. The hydroxylamine recognition sequence is shown in bold.
그림 Fig. 2. SDS-PAGE analysis of expression by pHAEGF in E. coli BL21 (DE3) (lane M: Smart Color Protein Marker, lane 1: BL21 (DE3), lane 2: rhEGF soluble protein, lane 3: rhEGF inclusion body)
그림 Fig. 3. Western blot analysis of expression by pHAEGF in E. coli BL21 (DE3) (lane M: Smart Color Protein Marker, lane 1: BL21 (DE3), lane 2: rhEGF soluble protein)
그림 Fig. 4. Ni-NTA agarose cloumn – immobilized metal affnity chromatography of rhEGF conditions: in 250 mM imidazole buffer (Buffer 4) elution with flow rate 1.0 ㎖/min; chromatogram representing protein concentration at 280 nm.
그림 Fig. 5. Analysis of rhEGF purified by Ni-NTA column chromatography (lane M: Smart Color Protein Marker, lane 1: sample loading step, lane 2: rhEGF column wash step, lane 3: rhEGF elution step)
그림 Fig. 6. Cleavage of rhEGF fusion peptide by Hydroxylamine (lane M.: Smart Color Protein Marker, lane 1: rhEGF, lane 2: cleavage rhEGF, lane 3: cut-off rhEGF)
그림 Fig. 7. ELISA analysis with anti-human EGF antibody (p < 0.05 = *, p < 0.01 = **, p < 0.001 = ***)
그림 Fig. 8. Cell proliferation test of rhEGF (p < 0.05 = *, p < 0.01 = **, p < 0.001 = ***)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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