[논문]융합 파트너를 이용한 인간 상피세포성장인자의 재조합 대장균에서 발현과 정제 연구

성기현; 김인호

doi:10.9713/kcer.2018.56.5.711

융합 파트너를 이용한 인간 상피세포성장인자의 재조합 대장균에서 발현과 정제 연구
Expression and Purification of Recombinant Human Epidermal Growth Factor Using Fusion Partners in Escherichia coli 원문보기

Korean chemical engineering research = 화학공학, v.56 no.5, 2018년, pp.711 - 717

성기현 (충남대학교 응용화학공학과) , 김인호 (충남대학교 응용화학공학과)

초록
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상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 세포 분열을 자극하고 의약적 용도가 다양하다. EGF는 3개의 이황화 결합을 갖고 불용성으로, 대장균에서 고효율 발현에 대한 연구가 잘 이루어지지 않았다. EGF 유전자를 작은 유비퀴틴 관련 유전자(small ubiquitin-related modifier gene, SUMO)와 결합하고 DE3 대장균에서 발현시켰다. IPTG (Isopropyl-${\beta}$-D-Thiogalactopyranoside)로 유도하여 대장균 세포 단백질의 38.9%로 융합단백질이 발현되었고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 분리하였다. 그 후 유비퀴틴 분해효소반응으로 융합단백질에서 EGF를 얻은 후 다시 Ni-NTA 크로마토그래피로 분리 하였다. 최종적으로 정제된 EGF의 순도는 HPLC로 분석하였으며, 98%이상의 순도를 얻을 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Human epidermal growth factor (hEGF) can stimulate the division of various cell types and has potential clinical applications. Since the protein contains three intra-molecular disulfide bonds, the high expression of active hEGF in Escherichia coli has not been well researched, We fused the hEGF gene with a small ubiquitin-related modifier gene (SUMO) by synthesizing an artificial SUMO-hEGF fusion gene that was highly expressed in E. coli (DE3) strain. The optimal expression level of the soluble fusion protein, SUMO-hEGF with IPTG (Isopropyl-${\beta}$-D-Thiogalactopyranoside), was up to 38.9% of the total cellular protein. The fusion protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and cleaved by a SUMO-specific protease to obtain the native hEGF, which was further purified by Ni-NTA affinity chromatography. The result of the reverse-phase HPLC showed that the purity of the recombinant cleaved hEGF was greater than 98%.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Genetic code of fusion hEGF.
그림 Fig. 2. Expression of hEGF by SDS-PAGE. lane M, protein size marker; lane 1, before induction; lane 2, after induction.
$Fig. 4. SDS-PAGE of His-tag purified gradient eluates. lane M, protein size marker; lane 1, hEGF loading sample; lane 2, flow-through; lane 3, washed eluate by 6 mM imidazole; lane 4~23, Gradient elution fractions (10 mM~60 mM).Korean Chem. Eng. Res., Vol. 56, No. 5, October, 2018$ 그림 Fig. 4. SDS-PAGE of His-tag purified gradient eluates. lane M, protein size marker; lane 1, hEGF loading sample; lane 2, flow-through; lane 3, washed eluate by 6 mM imidazole; lane 4~23, Gradient elution fractions (10 mM~60 mM).Korean Chem. Eng. Res., Vol. 56, No. 5, October, 2018
그림 Fig. 3. Solubilization of insoluble expressed hEGF inclusion body. lane M, protein size marker; lane 1, total lysate supernatant; lane 2, total lysate precipitate; lane 3, solubilized inclusion body.
$Fig. 6. Second step His-tag purified hEGF. lane M, protein size marker; lane 1, loading sample; lane 2, flow-through; lane 3, washed eluate (6 mM imidazole); lane 4, elution fraction(60 mM); lane 5, elution fraction (100 mM).$ 그림 Fig. 6. Second step His-tag purified hEGF. lane M, protein size marker; lane 1, loading sample; lane 2, flow-through; lane 3, washed eluate (6 mM imidazole); lane 4, elution fraction(60 mM); lane 5, elution fraction (100 mM).
그림 Fig. 5. (A) Effect of digestion enzyme concentration. lane M, protein size marker; lane 1, fused hEGF (uncut); lan 2, 4% enzyme cut; lane 3, 6% enzyme cut, lane 4, 8% enzyme cut; lane 5, 10% enzyme cut. (B) Contrasted digestion SDS-PAGE. lane M, protein size marker; lane 1, before enzyme digestion; lane 2, after 10% enzyme digestion.
$Fig. 7. hEGF fractions from gel filtration chromatography; lane M, protein size marker; lane 1~17, hEGF fractions.$ 그림 Fig. 7. hEGF fractions from gel filtration chromatography; lane M, protein size marker; lane 1~17, hEGF fractions.
그림 Fig. 8. HPLC chromatogram of final hEGF.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 대장균 내의 고순도 재조합 hEGF를 대량으로 생산할 수 있는 발현법과 정제기술을 개발하고자한다. 이를 위해 대장균 세포의 고농도 생장을 위한 배양조건과 고농도 재조합 hEGF의 발현을 위한 조건을 선정하고, 재조합 hEGF의 물리화학적인 성질을 이용하여 용해와 재접힘 조건을 선정한다.

제안 방법

(1) IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)로 유도하여 대장균 세포 단백질의 38.9%로 융합단백질을 발현시켰다.
(3) 최종 단계로 젤여과 크로마토그래피로 EGF의 순도를 증가시켰고 순도 98%를 역상 HPLC로 측정하였다.
EGF 유전자를 작은 유비퀴틴 관련 유전자(small ubiquitin-related modifier gene, SUMO), histidine 유전자와 결합하고 DE3 대장균에서 발현하였다. 발현된 융합단백질을 용해시켰고 세단계의 크로마토그래피를 거쳐 분리하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
5 mL/min, 각 fraction을 tube에 45 mL씩 80개를 나누어 분리하였다. SDS-PAGE로 분석 시에는 모든 분획을 다 확인하지 않고 5개씩 확인하였다. Fig.
8의 크로마토그램을 얻었다. hEGF 표준품과 비교하여 같은 체류시간인 42 min에서 정제된 hEGF를 확인하였다. Fig.
전기영동은 15% SDS-PAGE로 하였고, 총 단백질 정량분석은 Lowry법으로 수행하였다. hEGF의 순도를 확인하기 위하여 RP-HPLC (Reverse phase Hight performance liquid chromatography) 분석을 하였다. 이동상 A (증류수 1L와 TFA 1 mL) 이동상 B (1 L 용기에 ACN 1 L와 TFA 1 mL)을 제조 후 Shimadzu HPLC System (Solvent Delivery System: LC-20AD, UV- VIS Detector: SPD-20A, 유속:1 mL/min, 파장:280 nm, 주입량 : 20 μL)로 준비된 이동상을 주어진 용매구배로 컬럼(Vydac C18, 250 cm×4.
첫번째 친화성크로마토그래피에서 대장균 단백질과 융합단백질을 분리하였다. 그 후 분해효소반응으로 융합단백질에서 EGF를 얻은 후 두 번째 친화성 크로마토그래피에서 효소로 질려진 EGF와 융합파트너를 분리하였다.
이를 위해 대장균 세포의 고농도 생장을 위한 배양조건과 고농도 재조합 hEGF의 발현을 위한 조건을 선정하고, 재조합 hEGF의 물리화학적인 성질을 이용하여 용해와 재접힘 조건을 선정한다. 그리고 Mbp-ubp1을 이용하여 융합단백질을 절단함으로써 활성형 hEGF 형태로 얻기 위한 조건을 정한다.
마지막 고순도 정제를 위하여 소량씩 fraction collector (Frac920 Fraction Collector, GE healthcare)를 이용하여 분리하였다. resin (Sephacryl S-200 HR) 6.
분광 광도계(UV-1700)를 이용하여 세포농도를 600 nm파장에서 측정하였다. 전기영동은 15% SDS-PAGE로 하였고, 총 단백질 정량분석은 Lowry법으로 수행하였다.
이어서 크로마토그래피 정제 작업을 진행한다. 우선, hEGF에 융합되어 있는 poly-histidine을 이용하여 친화성 크로마토그래피 정제를 진행한다. 작업 전에 사용할 resin종류와부피를 정한다.
이동상 A (증류수 1L와 TFA 1 mL) 이동상 B (1 L 용기에 ACN 1 L와 TFA 1 mL)을 제조 후 Shimadzu HPLC System (Solvent Delivery System: LC-20AD, UV- VIS Detector: SPD-20A, 유속:1 mL/min, 파장:280 nm, 주입량 : 20 μL)로 준비된 이동상을 주어진 용매구배로 컬럼(Vydac C18, 250 cm×4.6 mm, 5 μm)을 통과시켰다.
이동상A인 HPLC급 증류수(0.1% TFA)로 완전히 평형화를 시켜준 후 준비된 검액을 20 μL 주입하여 Fig. 8의 크로마토그램을 얻었다.
5%가 접종되도록 LB배지 부피를 정하여 플라스크에 넣어 멸균하고, LB배지에 1% 균을 접종하고 Ampicillin 40 mg/mL이 되도록 넣고, 진탕배양기에서 37 ℃, 180 rpm으로 밤새 배양을 하였다. 이를 대량 배양하기 위하여 30 L,300 L 생물반응기에 각각 생장 배지(Glucose 1%(별도살균), MgSO₄ 2 mM(별살), (NH₄)₂HPO₄ 5.7 mM, KH₂PO₄ 0.022 mM, 구연산 0.0086 mM, casein pepton 1%)를 넣고 멸균 후 종배양한 것을 접종하였다. 세포 생장을 위한 발효조 안의 배양 조건은 37 ℃, 300 rpm, 350 L/min 통기, pH 7.
본 연구에서는 대장균 내의 고순도 재조합 hEGF를 대량으로 생산할 수 있는 발현법과 정제기술을 개발하고자한다. 이를 위해 대장균 세포의 고농도 생장을 위한 배양조건과 고농도 재조합 hEGF의 발현을 위한 조건을 선정하고, 재조합 hEGF의 물리화학적인 성질을 이용하여 용해와 재접힘 조건을 선정한다. 그리고 Mbp-ubp1을 이용하여 융합단백질을 절단함으로써 활성형 hEGF 형태로 얻기 위한 조건을 정한다.
1). 이를 응용하여 hEGF의 N말단에 Sac II와 C말단의 Xho I을 포함하는 primer를 제작하여 hEGF 붙여 유비퀴틴과 융합시켰다.
이어서 크로마토그래피 정제 작업을 진행한다. 우선, hEGF에 융합되어 있는 poly-histidine을 이용하여 친화성 크로마토그래피 정제를 진행한다.
5 mL/min으로 흘린다. 통과해 나오는 순서에 의해 분획을 회수하여 불순물 구획을 제거하여 고순도의 hEGF 부분만 선택하였다.
활성형 hEGF를 얻기 위해 융합된 His-ubiquitin을 Mbp-ubp1 효소를 이용하여 앞부분을 제거한다. 효소반응에 있어 농도, 시간, 온도, pH등이 중요한 요인으로 작용하기 때문에 반응조건을 찾았다. 효소의 농도를 hEGF sample 부피 대비 4%에서 10% 범위로 2시간 반응 하였다.

대상 데이터

두 번째로는 catabolite repression을 최소화 시켜 원활한 전사 조건을 만들어 주기 위하여 당 농도가 낮아지는 수준까지 세포 배양 후 유도에 들어가는 방법이 있다. 본 연구에서 사용한 유도체는 IPTG 1 mM을 첨가해주었다. IPTG 첨가후 37 ℃, 300 rpm, 350 L/min 통기, pH 7.
잘려진 hEGF와 His-Ub를 분리하기 위해 다시 친화성 크로마토그래피를 사용하였다. His-Ub는 histidine이 연결되어 있어 Ni sepharose와 결합하고, 나머지 hEGF는 Flow through와 세척 단계(6 mM imidazole)에서 회수된다.

이론/모형

분광 광도계(UV-1700)를 이용하여 세포농도를 600 nm파장에서 측정하였다. 전기영동은 15% SDS-PAGE로 하였고, 총 단백질 정량분석은 Lowry법으로 수행하였다. hEGF의 순도를 확인하기 위하여 RP-HPLC (Reverse phase Hight performance liquid chromatography) 분석을 하였다.
정제된 최종 제품에 대한 순도를 확인하기 위하여 RP-HPLC를 이용하였다. 이동상A인 HPLC급 증류수(0.
2번째 친화성 크로마토그래피는 Ni resin과 효소에 의해 잘려진 Histidine-ubiquitin을 결합시키고, hEGF를 flow through 분획으로 회수하려는데 그 목적이 있기 때문에 loading 후 회수하여 바로 다음 공정으로 넘어간다. 회수 된 hEGF 시료의 농축과 불순물의 분리를 위하여 고농도의 염화암모늄을 이용한 염석 침전 법을 사용한다. 황산암모늄 농도는 hEGF용액 부피대비 30% (v/w)가 되도록 저어가면서 천천히 소량씩 첨가하여 완전히 녹인 후 냉장온도에서 30분 정치시키면 hEGF가 완전히 침전된다.

성능/효과

또한 결합된 hEGF를 효과적으로 용출시키기 위한 경쟁물질로 고농도의 imidazole을 이용한다. 10~60 mM까지 imidazole 농도 구배로 친화성 크로마토그래피 한 결과 Fig. 4와 같이 여러 용출 분획에서 융합단백질이 발견되었고 특히 lane 10과 11에서 고농도로 용출됨을 알았다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	hEGF는 무엇인가?	hEGF (인간 상피세포성장인자, Human epidemal growrh factor)는 미국의 생물학자 스탠리· 코헨(Stanley Cohen) 박사에 의해 발견된 “상피세포성장인자”로 피부의 표면에 있는 수용체와 결합되어 새로운 세포의 생산을 촉진하며 체내에서 형성되는 단백질의 일종이다[1]. hEGF는 인체 내에 존재하는 천연 피부 재생 물질로서 피부 등에 상처가 나면, 혈액, 땀 또는 침을 통해 공급되어 상처가 흉터 없이 자연적으로 아물게 하는 작용을 하는 생리활성 단백질이다.
	hEGF의 단백질과 관련된 특징은?	hEGF는 쥐의 악하선으로부터 분리된 폴리펩타이드로서, 다양한 표피세포의 분화와 각질화(keratinization)를 촉진한다. 추가적으로 단백질과 DNA의 합성을 촉진하고, 무세포 단백질 합성에 있어 활성있는 리보솜을 형성한다. 인간상피세포성장인자의 주요 물리화학적 특징으로는 3개의 이황화결합을 포함하는 53개의 아미노산으로 N-말단에 asparagine과 C-말단에 arginine을 갖고, lysine, alanine, phenylalanine이 결여된 single polypeptide이다.
	hEGF의 주요 작용은 무엇인가?	hEGF는 인체 내에 존재하는 천연 피부 재생 물질로서 피부 등에 상처가 나면, 혈액, 땀 또는 침을 통해 공급되어 상처가 흉터 없이 자연적으로 아물게 하는 작용을 하는 생리활성 단백질이다. hEGF의 주요 작용은 표피세포 내에 들어가서 세포의 분열과 증식 속도를 촉진 하는 기능을 한다. 표피세포의 분열증식 속도는 진피 재생 속도까지 조절하며 피부 재생 전과정의 리듬을 주도한다.

참고문헌 (9)

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Ferrer, S., Cedano, J., Querol, E. and de Llorens, R., "Cloning, Expression and Purification of Human Epidermal Growth Factor using Different Expression Systems," J. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci., 788(1), 113-23(2003).

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Kumar, V., Abbas, A. K., Fausto, N., Robbins, S. L. and Cotran, R. S., Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease (7th ed.). Elsevier Saunders, St. Louis, Mo (2005).
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Kim, J. H., Hwang, W. S. and Kim, I. H., "Simple Preparation of Immobilized-metal Affinity Chromatography Media," Korean Journal of Chemical Engineering, 26(6), 1693-1695(2009).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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