[논문]오미자와 산수유 추출물이 dihydrotestosterone가 처리된 LNCaP 인간 전립선 암세포의 증식 및 전립선 비대 유발 인자 발현에 미치는 영향

김민영; 지선영; 황보현; 이혜숙; 김태희; 윤선혜; 김현진; 김성연; 김태중; 김민지; 정하은; 최영현

doi:10.5352/jls.2021.31.10.885

오미자와 산수유 추출물이 dihydrotestosterone가 처리된 LNCaP 인간 전립선 암세포의 증식 및 전립선 비대 유발 인자 발현에 미치는 영향
Effects of Schisandrae Fructus and Corni Fructus Extracts on the Proliferation and Expression of Prostatic Hyperplasia-inducing Factors in Dihydrotestosterone-stimulated LNCaP Human Prostate Carcinoma Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.10, 2021년, pp.885 - 897

김민영 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 지선영 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 황보현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 이혜숙 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 김태희 ((주)함소아제약 중앙연구소) , 윤선혜 ((주)네이처텍) , 김현진 ((주)네이처텍) , 김성연 (충북테크노파크 바이오센터 화장품 산업팀) , 김태중 (충북테크노파크 바이오센터 화장품 산업팀) , 김민지 (충북테크노파크 바이오센터 화장품 산업팀) , 정하은 (충북테크노파크 바이오센터 화장품 산업팀) , 최영현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실)

초록
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오미자와 산수유는 한국을 포함한 동아시아 지역에서 다양한 질병의 예방 및 치료에 오랫동안 사용되어 왔다. 최근에 이들 추출물에 의한 양성 전립선 비대증(BPH)의 발병 및 진행을 억제할 수 있다는 가능성에 대한 보고가 있었지만 관련 기전에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이다. 본 연구에서는 LNCaP 전립선 세포를 사용하여 DHT 처리에 의한 in vitro BPH 모델에서 오미자 및 산수유 추출물에 의한 BPH의 개선 가능성을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면, 오미자와 산수유의 열수 및 에탄올 추출물은 DHT 처리에 의해 LNCaP 세포의 증식을 유의적으로 억제하였으며, DHT로 유도된 BPH 바이오 마커와 성장인자의 발현을 현저히 감소시켰다. 그들은 또한 세포사멸 관련 인자의 발현을 조절하였고, DHT 매개 산화적 스트레스를 유의적으로 감소시켰으며, BPH 발병에 관여하는 주요 인자에 대한 보호 효과는 열수 추출물보다 에탄올 추출물 처리군에서 더 효과적이었다. 또한, BPH에 대한 보호 효과는 오미자와 산수유의 에탄올 추출물 단독 처리군보다 1:1 복합 혼합물 처리군에서 더 높았으며, 60% 에탄올 추출물이 40% 에탄올 추출물보다 더 높은 개선 효과를 보였다. 따라서 본 연구 결과는 오미자와 산수유 추출물이 항산화 활성과 연관된 androgen 신호 전달 경로의 억제를 통해 전립선 세포의 과다 증식을 방지함으로써 BPH 개선에 관여할 수 있음을 의미한다. 따라서 오미자와 산수유 추출물은 BPH의 임상 치료에 유용할 수 있으며, 이 두 추출물의 조합은 BPH 개선에 상승 효과를 낼 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Schisandrae Fructus (SF) and Corni Fructus (CF) have been used for a long time for the prevention and treatment of various diseases. Although reports have highlighted the possibility of inhibiting the onset and progression of benign prostatic hyperplasia (BPH), studies on related mechanisms are still lacking. In this study, we investigated the potential of SF and CF in improving BPH by using a dihydrotestosterone (DHT)-induced in vitro BPH model using LNCaP prostate carcinoma cells. According to our results, water and ethanol extracts of SF and CF significantly inhibited the proliferation of LNCaP cells by DHT treatment and markedly downregulated the expression of DHT-induced BPH biomarkers and growth factors. They also regulated the expression of apoptosis regulatory factors and significantly reduced DHT-mediated oxidative stress. In addition, the protective effect on major factors involved in the pathogenesis of BPH was more effective in the ethanol extract treatment group than in the water extract group. Furthermore, the improvement effect on BPH was higher in the 1:1 combined treatment group than in the ethanol extract alone treatment group of SF and CF, and 60% ethanol extracts showed a better effect than 40% ethanol extracts. Therefore, our findings demonstrate that SF and CF can protect against BPH by preventing the hyperproliferation of prostate cells through the inhibition of the androgen signaling pathway, which was correlated with their antioxidant activities. Therefore, SF and CF extracts may be useful in the clinical treatment of BPH, and the combination of these two extracts can be synergistic.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. Primary and secondary antibodies used for Western blot analysis
그림 Fig. 1. Induction of in vitro BPH model using DHT in LNCaP cells. The cells were treated with the indicated concentrations of DHT for 24 hr or 48 hr. Cell viability (A) and viable cell number (B) were measured by the metabolic-dye-based MTT assay and trypan blue assay, respectively. Data are expressed as the mean ± standard deviation (SD, n=3). The statistical analyses were conducted using analysis of variance (ANOVA-Tukey's post-hoc test) between groups (*p<0.05 and ***p<0.001 when compared to control). (C) Morphological changes of LNCaP cells were observed by a phase-contrast microscope. Representative photographs of the morphological changes were presented. (D) After treatment with the indicated concentrations of DHT for 48 hr, the cells were lysed, and then equal amounts of cell lysates were separated on SDS-polyacrylamide gels and then transferred to membranes. The levels of AR expression were visualized using anti-AR antibody and an ECL detection system. Actin was used as an internal control.
그림 Fig. 2. Effects of Schisandrae Fructus and Corni Fructus extracts on the cell viability of LNCaP cells. The cells were treated with different concentrations of water extracts of Schisandrae Fructus (WESF) and Corni Fructus (WECF) or 40% ethanol extracts of Schisandrae Fructus (40% EESF) and Corni Fructus (40% EECF) for 48 hr. And then cell viability was measured by an MTT assay. Data are expressed as the mean ± SD (**p<0.01 when compared to control. N.S., not significant when compared to control).
그림 Fig. 3. Effects of Schisandrae Fructus and Corni Fructus extracts on the cell viability and the expression of BPH-related proteins, growth factors and Bcl-2 family proteins in DHT-stimulated LNCaP cells. The cells were pretreated with or without 250 μg/ml WESF, WECF, 40% EESF or 40% EECF for 1 hr, before 100 nM DHT treatment for 48 hr. (A) The cell viability was measured by an MTT assay. Data are expressed as the mean ± SD (**p<0.01 vs. control group; #p<0.05 and ##p<0.01 vs. DHT-treated group). (B and C) The expression levels of the indicated proteins were determined by Western blotting with whole cell lysates. Equal protein loading was confirmed by actin as an internal control.
그림 Fig. 4. Effects of Schisandrae Fructus and Corni Fructus extracts on DHT-induced ROS generation in LNCaP cells. The cells were treated with 100 nM DHT for the indicated times (A) or pretreated with or without 250 μg/ml WESF, WECF, 40% EESF or 40% EECF for 1 hr, before 100 nM DHT treatment for 1 hr (B). The cells were collected and stained with DCF-DA dye for flow cytometry analysis. The levels of intracelullar ROS generation were determined by counting the percentages of DCF-DA-stained cells. Data are expressed as the mean ± SD (**p<0.01 and **p<0.001 vs. control group; ###p<0.001 vs. DHT-treated group).
그림 Fig. 5. Effects of mixtures containing ethanol extracts of Schisandrae Fructus and Corni Fructus on the cell viability and the expression of BPH-related proteins, growth factors and Bcl-2 family proteins in DHT-stimulated LNCaP cells. The cells were treated with 1:1, 2:1 and 1:2 mixtures containing 40% EESF and 40% EECF for 48 hr or pretreated with or without their mixtures for 1 hr, before 100 nM DHT treatment for 48 hr. (A) The cell viability was measured by an MTT assay. Data are expressed as the mean ± SD (***p<0.001 vs. control group; #p<0.05, ##p<0.01 and ###p<0.001 vs. DHT-treated group). (B and C) The expression levels of the indicated proteins were determined by Western blotting with whole cell lysates. Equal protein loading was confirmed by actin as an internal control.
그림 Fig. 6. Effects of mixtures containing ethanol extracts of Schisandrae Fructus and Corni Fructus on the ROS generation in DHT-stimulated LNCaP cells. (A) The cells were treated with 250 μg/ml 40% EESF and 40% EECF, 1:1, 2:1 and 1:2 mixtures containing 40% EESF and 40% EECF for 1 hr, and then stimulated with 100 nM DHT treatment for 1 hr. (B) The cells were treated with 250 μg/ml 40% or 60% EESF and EECF or their 1:1 mixtures for 1 hr and then treated with or without 100 nM DHT for 1 hr. The cells were collected and stained with DCF-DA dye for flow cytometry analysis. The levels of intracelullar ROS generation were determined by counting the percentages of DCF-DA-stained cells. Data are expressed as the mean ± SD (*p<0.05 and ***p<0.001 vs. control group; ###p<0.001 vs. DHT-treated group).
그림 Fig. 7. Effects of mixtures containing ethanol extracts of Schisandrae Fructus and Corni Fructus on the expression of BPH-related proteins and the levels of PSA in DHT-stimulated LNCaP cells. (A) The cells were treated with 250 μg/ml 40% or 60% EESF and EECF or their 1:1 mixtures for 1 hr and then treated with or without 100 nM DHT for 48 hr. The expression levels of AR, PSA, PCNA and ARA70 were determined by Western blotting with whole cell lysates. Equal protein loading was confirmed by actin as an internal control. (B) The cells were treated with the indication concentrations of EESF, EECF and their 1:1 mixture for 1 hr, and then treated with or without 100 nM DHT for 48 hr. The cell culture supernatants were collected and then the levels of PSA were examined by ELISA. Data are expressed as the mean ± SD (***p<0.001 vs. control group; #p<0.05, ##p<0.01 and ###p<0.001 vs. DHT-treated group).
그림 Fig. 8. A suggested schematic model for the inhibitory effect of Schisandrae Fructus and Corni Fructus on pathogenesis of BPH.

AI 본문요약
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제안 방법

DHT 유도 in vitro BPH 모델에서 BPH 유발 관련 유전자들의 발현에 미치는 오미자 및 산수유 추출물의 영향 조사를 위한 조건 설정을 위하여 LNCaP 세포의 증식에 미치는 오미자 및 산수유의 열수 및 40% 에탄올 추출물의 영향을 먼저 조사하였다. 각 추출물의 처리 후 수행된 MTT 분석의 결과에 의하면, 오미자 열수 추출물(WESF)은 350 μg/ml에서 다소 LNCaP 세포의 증식을 억제하였지만, 산수유 열수 추출물 (WECF)과 오미자 및 산수유 40% 에탄올 추출물(40% EESF 및 40% EECF)은 처리 농도 350 μg/ml까지 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig.
다음은 오미자와 산수유 추출물이 DHT에 의해 유도된 LNCaP 세포의 증식 촉진을 억제하는지 확인하기 위하여, 세포독성이 없는 농도인 250 μg/ml로 각각의 열수 및 40% 에탄올 추출물을 LNCaP 세포에 전처리하고 1시간 후 DHT를 처리하여 48시간 동안 배양하였다
다음은 이상에서 얻은 결과를 바탕으로 다양한 평가항목에서 효능이 우수하였던 오미자 및 산수유 에탄올 추출물을 대상으로 복합 비율을 달리한 조건에서 최적의 BPH 제어 효과조합 비율의 도출을 시도하였다. 이를 위하여 서로 다른 처리혼합 비율(40% 오미자 및 산수유 에탄올 추출물의 1:1, 2:1 및 1:2 조합)에 따른 DHT로 유도된 세포증식 억제 효능을 평가하였다.
본 연구에서는 LNCaP 세포를 이용한 in vitro BPH 모델에서 오미자와 산수유의 열수 및 에탄올 추출물에 의한 BPH 개선 효과를 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 오미자 및 산수유 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비하여 DHT에 의하여 유도된 LNCaP 세포의 증식 억제능이 우수하였으며, 이는 BPH의 바이오 마커(AR, PSA, PCNA 및 ARA70) 뿐만 아니라 성장인자(EGF 및 b-FGF)의 발현 저해 및 세포사멸 조절 인자 (Bcl-2 family 단백질)의 발현 조절과 연관이 있었다(Fig.
, Incheon, Korea)를 이용하여 추출하였다. 시료의 40% 및 60% ehtanol 추출물은 건조 오미자와 산수유를 마쇄한 후 시료 1:10 (w/v)의 비율로 각각 40% 및 60% ethanol을 각각 가하여 50℃에서 4시간 동안 초고속 진공 저온 추출기를 이용하여 추출하였다. 추출된 용액은 여과 후 감압농축기(Eyela N-21NS, Tokyo Rikakikai Co.
이상의 결과에 의하면, 오미자 및 산수유의 열수 추출물에 비해 40% 에탄올 추출물이 DHT에 의한 LNCaP 세포의 증식, AR 관련 유전자 발현 및 ROS 생성의 억제에 더 효과적으로 나타나 추출 방법에 따라 효능의 차이가 있음을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 오미자 및 산수유 에탄올 추출과정에서 에탄올의 농도 변화에 따른 차이점을 확인하기 위하여 60% 에탄올 추출물과 40% 에탄올 추출물의 효능을 추가로 비교하였다. 이를 위하여 LNCaP 세포를 대상으로 60% 에탄올 추출물 및 1:1 비율의 혼합 복합물을 처리하여 MTT 분석을 실시한 결과에 의하면, 250 μg/ml 처리 범위에서도 세포 독성을 나타내지 않았다.
이상에서 확인된 오미자 및 산수유의 추출물에 의한 BPH 개선 효과가 PSA 수준의 감소와 직접 연관성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 40% 및 60%의 에탄올 추출물을 각각 단독 또는 1:1 비율의 복합 혼합물을 전처리한 후, DHT가 존재하는 배지에서 48시간 배양된 LNCaP 세포를 대상으로 PSA 생성의 정도를 비교하였다. Fig.
다음은 이상에서 얻은 결과를 바탕으로 다양한 평가항목에서 효능이 우수하였던 오미자 및 산수유 에탄올 추출물을 대상으로 복합 비율을 달리한 조건에서 최적의 BPH 제어 효과조합 비율의 도출을 시도하였다. 이를 위하여 서로 다른 처리혼합 비율(40% 오미자 및 산수유 에탄올 추출물의 1:1, 2:1 및 1:2 조합)에 따른 DHT로 유도된 세포증식 억제 효능을 평가하였다. Fig.
이상에서 관찰된 오미자와 산수유 추출물의 전립선 세포 과다 증식 억제 효과가 BPH 개선과 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 BPH 관련 유전자들의 발현 변화에 미치는 오미자와 산수유 추출물의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 DHT 처리에 의해 증가되었던 AR의 발현 변화를 먼저 조사하였다.
이상에서 확인된 오미자 및 산수유의 추출물에 의한 BPH 개선 효과가 PSA 수준의 감소와 직접 연관성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 40% 및 60%의 에탄올 추출물을 각각 단독 또는 1:1 비율의 복합 혼합물을 전처리한 후, DHT가 존재하는 배지에서 48시간 배양된 LNCaP 세포를 대상으로 PSA 생성의 정도를 비교하였다.

대상 데이터

본 연구에서 사용된 오미자와 산수유의 열수 및 에탄올(40% 및 60%) 추출물은 ㈜네이처텍(Naturetech Inc., Jinchenon, Korea)에서 원료를 제공하여 충북테크노파크(Cheongju, Ko- rea)에서 추출한 것을 공급받아 사용하였다. 열수 추출물은 건조 오미자와 산수유를 마쇄한 후 시료 1:10 (w/v)의 비율로 각각 증류수를 가한 후 110℃에서 4시간 동안 초고속 진공 저온 추출기(Ultra-fast vaccum low-temperautre extractor, COSMOS 660, Kyungseo E&P Co.

데이터처리

GraphPad Prism® version 5.0 (Graphpad Inc., San Diego, CA, USA)의 one-way analysis of variance (ANOVA)를 사용하여 통계 분석을 실시하였으며, Tukey's test로 사후 검정하여 p<0.05 값을 유의한 값으로 보고 통계 처리하였다.

성능/효과

Fig. 3B에 나타낸 Western blotting의 결과에서 알 수 있듯이, 오미자와 산수유의 열수 추출물(WESF 및 WECF)이 단독 처리된 세포에서는 AR의 발현이 대조군 수준으로 유지되었지만, 오미자와 산수유의 40% 에탄올 추출물(40% EESF 및 40% EECF) 단독 처리군에서는 대조군에 비하여 AR의 발현이 다소 증가되었다. 그러나 DHT 처리에 의해 크게 증가되었던 AR 의 발현은 오미자와 산수유 추출물이 전처리된 조건에서는 모두 감소하였으며, AR 발현 억제의 정도는 열수 추출물에 비하여 에탄올 추출물이 전처리된 경우에서 더 높게 나타났다.
5A의 MTT 분석 결과에 의하면, 1:1, 2:1 및 1:2 비율의 오미자 및 산수유 40% 에탄올 추출물의 혼합물을 각각 250 μg/ml으로 처리시 LNCaP 세포에 유의적인 독성을 나타내지 않았으며, DHT로 유도된 LNCaP 세포증식 유도 현상이 오미자 및 산수유 40% 에탄올 추출물의 2:1 복합 혼합물에서도 유의적으로 억제되었지만, 1:1 및 1:2 비율의 복합 혼합 물에서 더욱 억제되었다
BPH 환자에서 관찰되는 이러한 병리적인 특징이 DHT 처리에 따른 in vitro LNCaP 세포 BPH 모델에서도 나타나는지를 조사한 결과, DHT가 단독 처리된 LNCaP 세포에서 EGF와 b-FGF의 발현이 증가하였으며, Bcl-2의 발현 또한 증가된 반면, Bax 및 Bad와 같은 세포사멸 촉진 유전자들의 발현은 감소되었다(Fig. 3C).
각 추출물의 처리 후 수행된 MTT 분석의 결과에 의하면, 오미자 열수 추출물(WESF)은 350 μg/ml에서 다소 LNCaP 세포의 증식을 억제하였지만, 산수유 열수 추출물 (WECF)과 오미자 및 산수유 40% 에탄올 추출물(40% EESF 및 40% EECF)은 처리 농도 350 μg/ml까지 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig
6A). 결론적으로 세 가지 비율의 복합 혼합물 중 1:1 비율의 조합에서 DHT에 의해 증가된 BPH 유도 관련 인자, 성장인자 및 ROS의 생성을 억제하는 능력이 상대적으로 높은 것으로 나타나, 1:1 비율의 복합 혼합물이 최적의 조합임을 알 수 있다.
다음은 오미자와 산수유 추출물이 DHT에 의해 유도된 LNCaP 세포의 증식 촉진을 억제하는지 확인하기 위하여, 세포독성이 없는 농도인 250 μg/ml로 각각의 열수 및 40% 에탄올 추출물을 LNCaP 세포에 전처리하고 1시간 후 DHT를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 그 결과, DHT에 의한 LNCaP 세포의 증식 촉진은 오미자 열수 추출물(WESF)에 의해 다소 감소된 경향을 나타내었다. 그러나 산수유 열수 추출물(WECF) 과 40% 에탄올 오미자(40% EESF) 및 산수유(40% EECF) 추출물은 DHT에 의한 증식 촉진을 유의적으로 감소시켰다(Fig.
7B). 그러나 DHT 처리에 의해 증가된 PSA의 생성의 정도가 에탄올 단독 및 1:1 복합 혼합물 처리군에서 처리 농도 증가 따라 유의적인 감소를 보였다. 특히 40% 에탄올 1:1 복합 혼합물처리 군에 비하여 60% 1:1 복합 혼합물 처리군에서 PSA 생성억제 효능이 높게 관찰되어 60% 에탄올 추출물이 DHT로 유도된 BPH의 개선하는 효과가 좀 더 높은 것으로 추측된다.
3B에 나타낸 Western blotting의 결과에서 알 수 있듯이, 오미자와 산수유의 열수 추출물(WESF 및 WECF)이 단독 처리된 세포에서는 AR의 발현이 대조군 수준으로 유지되었지만, 오미자와 산수유의 40% 에탄올 추출물(40% EESF 및 40% EECF) 단독 처리군에서는 대조군에 비하여 AR의 발현이 다소 증가되었다. 그러나 DHT 처리에 의해 크게 증가되었던 AR 의 발현은 오미자와 산수유 추출물이 전처리된 조건에서는 모두 감소하였으며, AR 발현 억제의 정도는 열수 추출물에 비하여 에탄올 추출물이 전처리된 경우에서 더 높게 나타났다. 이는 아마도 열수 추출물보다 통상적으로 에탄올과 같은 유기 용매를 이용한 추출물이 열수 추출물에 함유하고 있지 않을 수 있는 다양한 생리활성 성분들이 더 많이 추출되었기 때문이라고 생각한다.
그리고 DHT로 유도된 LNCaP 세포증식의 억제 효과도 40% 에탄올 추출물과 유사하게 나타났다(Data not shown). 그러나 ROS 생성 억제 측면에서는 40%의 에탄올 오미자 및 산수유 추출물에 비하여 60%의 에탄올 추출물에서 매우 강하게 나타났으며, 40%의 에탄올 오미자 및 산수유 추출물의 1:1 비율의 복합 혼합물에 비하여 60%의 에탄올 복합 혼합물 처리 군에서 더 높은 ROS 생성 억제 효과를 나타냈다(Fig. 6B).
그 결과, DHT에 의한 LNCaP 세포의 증식 촉진은 오미자 열수 추출물(WESF)에 의해 다소 감소된 경향을 나타내었다. 그러나 산수유 열수 추출물(WECF) 과 40% 에탄올 오미자(40% EESF) 및 산수유(40% EECF) 추출물은 DHT에 의한 증식 촉진을 유의적으로 감소시켰다(Fig. 3A).
5B). 그리고 성장인자들의 발현을 평가한 결과에서는 1:1 비율의 혼합물 처리 군에서 EGF와 b-FGF의 발현이 모두 억제되었으며, 1:2 비율의 혼합물 처리군에서는 b-FGF만이 억제되었고, 2:1 비율의 복합혼합물 처리군에서는 두 인자의 억제 효과가 미미하였다(Fig. 5C).
아울러 오미자 및 산수유 추출물은 DHT에 의한 산화적 스트레스(ROS) 완화 효과가 있었으며, 열수 추출물에 비하여 에탄올 추출물에서 항산화 효능이 높게 나타났다. 그리고 이러한 효능은 오미자와 산수유의 에탄올 단독 추출물에 비하여 1:1 비율로 조합하여 혼합한 복합물에서 높게 나타났으며, 40% 에탄올 추출물에 비하여 60% 에탄올 추출물의 1:1 복합 혼합물에서 BPH의 바이오 마커에 대한 개선 효과가 우수하였다. 그러나 오미자 및 산수유 추출물에 의한 성장인자 조절 기전과 세포사멸 조절 인자들의 조절 작용 기전에 대한 상위 신호계의 역할 및 AR 신호계 조절에서 ROS의 역할에 관한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것이다.
3C). 따라서 오미자 및 산수유추출물에 의한 BPH의 제어는 AR 신호계의 억제와 함께 전립선 세포에서 성장인자의 과다 생산 차단과 세포사멸 유도의 항상성 유지를 통하여 이루어지고 있음을 의미한다.
3C). 따라서 이러한 유전자들의 발현에 미치는 오미자와 산수유 추출물의 영향을 조사한 결과, DHT 처리에 의하여 증가되었던 EGF와 b-FGF 발현이 오미자 및 산수유 추출물이 전처리된 조건에서는 모두 감소되었으며, 열수 추출물에 비하여 40% 에탄올 추출물군에서 더욱 감소되었다. 이와 유사하게 증가된 Bcl-2의 발현 또한 오미자 및 산수유 추출물 의전처리에 의하여 억제되었지만, Bax 및 Bad는 DHT 처리에 의해 감소되었으며, 오미자와 산수유 추출물이 존재하는 조건에서는 회복되었으며, 이러한 효과 역시 40% 에탄올 추출물에서 더욱 강하게 관찰되었다(Fig.
5C). 또한, DHT 처리에 의해 증가된 ROS의 생성은 1:1 비율의 오미자 및 산수유 40% 에탄올 추출물 복합 처리군에서는 거의 대조군 수준으로 유지되었으며, 2:1 및 1:2 비율의 오미자 및 산수유 40% 에탄올 추출물의 혼합물 전처리군에서도 유의적인 감소 효과가 나타났다(Fig. 6A).
6B). 또한, DHT에 의해 유도된 AR 관련 유전자들의 발현 억제 효과에서도 40%의 에탄올 추출물에 비하여 60%의 에탄올 추출물이 각각의 단독 그리고 1:1 비율로의 복합물 처리군에서 높게 나타났다(Fig. 7A).
본 연구에서는 LNCaP 세포를 이용한 in vitro BPH 모델에서 오미자와 산수유의 열수 및 에탄올 추출물에 의한 BPH 개선 효과를 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 오미자 및 산수유 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비하여 DHT에 의하여 유도된 LNCaP 세포의 증식 억제능이 우수하였으며, 이는 BPH의 바이오 마커(AR, PSA, PCNA 및 ARA70) 뿐만 아니라 성장인자(EGF 및 b-FGF)의 발현 저해 및 세포사멸 조절 인자 (Bcl-2 family 단백질)의 발현 조절과 연관이 있었다(Fig. 8).
5C). 아울러 Bcl-2 family에 속하는 단백질 중에서 DHT에 의한 Bcl-2의 발현 증가에서는 세 가지 조합의 복합물 처리에서 모두 유사한 억제 효과를 보였으며, Bax 및 Bad의 발현 억제 효과는 1:2 및 2:1 복합 혼합물 처리군에서 상대적으로 높은 발현 유도 현상을 보여주었다(Fig. 5C).
8). 아울러 오미자 및 산수유 추출물은 DHT에 의한 산화적 스트레스(ROS) 완화 효과가 있었으며, 열수 추출물에 비하여 에탄올 추출물에서 항산화 효능이 높게 나타났다. 그리고 이러한 효능은 오미자와 산수유의 에탄올 단독 추출물에 비하여 1:1 비율로 조합하여 혼합한 복합물에서 높게 나타났으며, 40% 에탄올 추출물에 비하여 60% 에탄올 추출물의 1:1 복합 혼합물에서 BPH의 바이오 마커에 대한 개선 효과가 우수하였다.
3A). 이러한 결과는 각각의 추출물이 BPH의 개시와 진행에 필수적인 전립선 세포의 과다 증식을 억제할 수 있음을 의미한다.
이를 위하여 LNCaP 세포를 대상으로 60% 에탄올 추출물 및 1:1 비율의 혼합 복합물을 처리하여 MTT 분석을 실시한 결과에 의하면, 250 μg/ml 처리 범위에서도 세포 독성을 나타내지 않았다
이상의 결과에 의하면, 오미자 및 산수유의 열수 추출물에 비해 40% 에탄올 추출물이 DHT에 의한 LNCaP 세포의 증식, AR 관련 유전자 발현 및 ROS 생성의 억제에 더 효과적으로 나타나 추출 방법에 따라 효능의 차이가 있음을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 오미자 및 산수유 에탄올 추출과정에서 에탄올의 농도 변화에 따른 차이점을 확인하기 위하여 60% 에탄올 추출물과 40% 에탄올 추출물의 효능을 추가로 비교하였다.
따라서 이러한 유전자들의 발현에 미치는 오미자와 산수유 추출물의 영향을 조사한 결과, DHT 처리에 의하여 증가되었던 EGF와 b-FGF 발현이 오미자 및 산수유 추출물이 전처리된 조건에서는 모두 감소되었으며, 열수 추출물에 비하여 40% 에탄올 추출물군에서 더욱 감소되었다. 이와 유사하게 증가된 Bcl-2의 발현 또한 오미자 및 산수유 추출물 의전처리에 의하여 억제되었지만, Bax 및 Bad는 DHT 처리에 의해 감소되었으며, 오미자와 산수유 추출물이 존재하는 조건에서는 회복되었으며, 이러한 효과 역시 40% 에탄올 추출물에서 더욱 강하게 관찰되었다(Fig. 3C).
그러나 DHT 처리에 의해 증가된 PSA의 생성의 정도가 에탄올 단독 및 1:1 복합 혼합물 처리군에서 처리 농도 증가 따라 유의적인 감소를 보였다. 특히 40% 에탄올 1:1 복합 혼합물처리 군에 비하여 60% 1:1 복합 혼합물 처리군에서 PSA 생성억제 효능이 높게 관찰되어 60% 에탄올 추출물이 DHT로 유도된 BPH의 개선하는 효과가 좀 더 높은 것으로 추측된다. 그러나 오미자 및 산수유 에탄올 추출물 자체에 의해 증가된 PSA 수준이 생체 내에서는 어떤 의미를 지니는지에 관한 연구가 추가로 요구된다.

후속연구

특히 40% 에탄올 1:1 복합 혼합물처리 군에 비하여 60% 1:1 복합 혼합물 처리군에서 PSA 생성억제 효능이 높게 관찰되어 60% 에탄올 추출물이 DHT로 유도된 BPH의 개선하는 효과가 좀 더 높은 것으로 추측된다. 그러나 오미자 및 산수유 에탄올 추출물 자체에 의해 증가된 PSA 수준이 생체 내에서는 어떤 의미를 지니는지에 관한 연구가 추가로 요구된다.
그리고 이러한 효능은 오미자와 산수유의 에탄올 단독 추출물에 비하여 1:1 비율로 조합하여 혼합한 복합물에서 높게 나타났으며, 40% 에탄올 추출물에 비하여 60% 에탄올 추출물의 1:1 복합 혼합물에서 BPH의 바이오 마커에 대한 개선 효과가 우수하였다. 그러나 오미자 및 산수유 추출물에 의한 성장인자 조절 기전과 세포사멸 조절 인자들의 조절 작용 기전에 대한 상위 신호계의 역할 및 AR 신호계 조절에서 ROS의 역할에 관한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것이다. 아울러 오미자와 산수유의 추출 방법에 따른 생리활성 성분의 차이 및 그들이 BPH의개선에 미치는 영향 등이 동물 실험을 통하여 추가로 밝혀져야 할 것이다.
그러나 오미자 및 산수유 추출물에 의한 성장인자 조절 기전과 세포사멸 조절 인자들의 조절 작용 기전에 대한 상위 신호계의 역할 및 AR 신호계 조절에서 ROS의 역할에 관한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것이다. 아울러 오미자와 산수유의 추출 방법에 따른 생리활성 성분의 차이 및 그들이 BPH의개선에 미치는 영향 등이 동물 실험을 통하여 추가로 밝혀져야 할 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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