[논문]인간 대장상피세포에서 항균펩타이드 CopA3에 의한 survivin 발현 조절 기작 규명

김호

doi:10.5352/jls.2022.32.1.23

인간 대장상피세포에서 항균펩타이드 CopA3에 의한 survivin 발현 조절 기작 규명
Antimicrobial Peptide CopA3 Induces Survivin Expression in Human Colonocytes Through the Transcription Factor Sp1 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.1, 2022년, pp.23 - 28

초록
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곤충에서 유래한 항균펩타이드 CopA3는 다양한 세포사멸 과정을 차단한다고 알려져 있다. 세균 톡신에 의한 상피세포 세포사멸이나 6-hydroxy dopamine이 야기하는 신경세포 세포사멸 모두를 차단한다. 연구자 등은 최근에 CopA3가 카스파제에 직접 결합하여 그들의 활성형-절단과정을 차단한다고 보고하였다. 하지만 강력한 CopA3의 항세포사멸 효능을 설명하기 위해서는 추가적인 규명이 필요한 실정이다. 본 연구에서는 세포사멸경로의 핵심억제인자인 survivin 발현에 미치는 CopA3의 영향을 확인하였다. 인간 대장상피세포(HT29)에 CopA3를 처리한 뒤 survivin 발현을 추적한 결과, survivin 단백질 양이 유의하게 증가함을 확인하였다. RT-PCR을 통해서 CopA3가 survivin 유전자의 전사를 증가시킴을 확인하였다. 그리고 CopA3 자극이 Sp1 발현을 증가시키는 사실과, Sp1 억제 물질인 tolfenamic acid 처리가 CopA3에 의한 survivin 증가를 차단한다는 결과들을 바탕으로 우리는 CopA3가 Sp1을 통해 survivin 발현을 유도한다는 최종 결론을 도출하였다. 한편 본 연구를 통해서 CopA3의 강력한 항세포사멸 효능을 설명할 수 있는 분자기작을 새롭게 제시하였다고 사려된다.

Abstract ▼ AI-Helper

CopA3 (LLCIALRKK), an antimicrobial peptide isolated from the Korean dung beetle, has been shown to suppress apoptosis in various cell types. CopA3 inhibits not only bacterial toxin-induced colonocyte apoptosis but also 6-hydroxy dopamine-induced neural cell apoptosis. Our recent study revealed that CopA3 directly binds to caspases (key regulators of apoptosis) and inhibits the proteolytic cleavage required for their activation. But molecular mechanisms underlying CopA3-mediated inhibition of apoptosis in multiple cell types remain unknown. Here we assessed possible effects of CopA3 on expression of survivin, which is known to inhibit apoptosis. In HT29 human colonocytes, CopA3 exposure markedly upregulated survivin expression in a concentration- and time-dependent manner. RT-PCR revealed that CopA3-mediated upregulation of survivin was attributable to increased gene transcription, and further showed that CopA3 also increased expression of Sp1, one of many transcription factors known to be involved in transcription of the survivin gene. Notably, blocking Sp1 by treatment with the Sp1 inhibitor, tolfenamic acid, significantly reduced CopA3-mediated upregulation of survivin. These results collectively suggest that CopA3 induces Sp1 expression, which in turn is involved in upregulation of survivin in human colonocytes. These novel findings establish another pathway for explaining the anti-apoptotic effects of CopA3 against various cellular apoptosis systems.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. The insect-derived antimicrobial peptide CopA3 increases survivin expression in human colonocytes. (A, B) HT29 human colonocytes were incubated with CopA3 (1 μg/ ml) for the indicated durations (A) or with different concentrations of CopA3 (0, 0.1, 0.5, 1, or 5 μg/ml) for 5 hr (B). Proteins in cell lysates were resolved by SDS-PAGE on 15% gels, and blots were probed with antibodies against survivin (16 kDa) and b-actin (42 kDa). The presented results are representative of three independent experiments. (C) DNA fragmentation was detected by TUNEL assay. Cells were grown on coverslips, treated with CopA3 (1 μg/ml) for 48 hr, and then incubated with propidium iodide to stain nuclei (Bar = 50 μm). Results are representative of three independent experiments. (D) Cells were incubated with CopA3 (1 μg/ml) for 48 hr and cell viability was measured by MTT assay. Results are presented as means ± SEM (error bars) of three experiments performed in triplicate, expressed as a percentage relative to untreated controls.
그림 Fig. 2. CopA3 increases transcription of the survivin gene in human colonocytes. HT29 cells (105 cells/well) were treated with CopA3 (1 μg/ml) for the indication times. Upper panel: Total RNA was isolated, cDNA was synthesized, and survivin and β-actin were amplified by PCR. The results shown are representative of three separate experiments. Lower panel: Densitometric quantitation of survivin mRNA expression.
그림 Fig. 3. CopA3 has no effect on the half-life of survivin protein. HT29 cells were incubated with 1 μg/ml CopA3 in the presence or absence of cycloheximide (CHX; 50 μg/ml) for the indicated times. Proteins in cell lysates were resolved by SDS-PAGE on 15% gels, and blots were probed with antibodies against survivin (16 kDa) and b-actin (42 kDa). The presented results are representative of three independent experiments.
그림 Fig. 4. CopA3 upregulates survivin expression through Sp1. (A) HT29 cells (105 cells/well) were treated with CopA3 (1 μg/ml) for the indication times. Proteins in cell lysates were resolved by SDS-PAGE on 10% gels, and blots were probed with antibodies against survivin (16 kDa), phospho- NF-κB (65 kDa), phospho-p53 (53 kDa), Sp1 (106 kDa) and b-actin (42 kDa). The presented results are representative of three independent experiments. (B) HT29 cells were incubated with medium (con), CopA3 alone (1 μg/ml), CopA3 plus tolfenamic acid (100 μM), or tolfenamic acid alone (100 μM) for 6 hr. Proteins in cell lysates were resolved by SDS-PAGE on 15% gels, and blots were probed with antibodies against survivin, Sp1 and b-actin. The presented results are representative of three independent experiments.

AI 본문요약
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문제 정의

상기 근거를 바탕으로, 본 연구에서는, 세포 사멸을 강하게 차단하는 CopA3 펩타이드 효능이 survivin 발현과 연관되어있는지를 확인하고자 하였다.

제안 방법

연구자 등은 다음으로 CopA3 처치 후 증가하는 survivin이전사 조절의 결과인지 확인하였다. 이를 위해 HT29세포에 CopA3를 시간 별로 처리한 후 mRNA를 분리하고 RT-PCR을 수행하여 survivin의 전사량 변화를 확인하였다. Fig.

대상 데이터

survivin 항체, β-actin 항체, phospho-NFκB 항체, phos- pho-p53 항체 등은 Cell Signaling Biotechnology 사(CA, USA) 에서 구매하여 사용하였다

성능/효과

2에서처럼, CopA3 처치는 시간의존적으로 survivin 유전자의 전사를 증가시켰다. Survivin의 기저 전사량이 CopA3 처치 3시간부터 유의하게 높아짐을 확인하였으며, 최고 전사량 증가가 처치 5시간과 7시간 후에 나타남을 확인하였다. 하지만 9시간 이후에는 기저 수준으로 다시 낮아지는 것으로 확인되었다.
1A)과 일치하였다. 이상의 결과는 인간 대장상피세포에서 CopA3 처리 이후에 증가하는 survivin 단백질의 양적 증가는 전사 활성화에 기인함을 보여준다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 연구자 등은 본 연구를 통해서 강력한 세포 사멸 억제 효능을 보이는 CopA3의 항세포사멸분자기작을 새롭게 제시하였다고 사려된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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