[논문]초산균 Acetobacter pasteurianus CK-1의 분리 및 발효 특성

방규호; 김채원; 김철호

doi:10.5352/jls.2022.32.2.119

초산균 Acetobacter pasteurianus CK-1의 분리 및 발효 특성
Isolation of an Acetic Acid Bacterium Acetobacter pasteurianus CK-1 and Its Fermentation Characteristics 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.2, 2022년, pp.119 - 124

방규호 (경상국립대학교 제약공학과) , 김채원 (경상국립대학교 제약공학과) , 김철호 (경상국립대학교 제약공학과)

초록
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막걸리 식초 생산에 효과적인 초산균을 분리하기 위해 다양한 시료에서 초산균을 검색하였고, 그 중 초산 생산이 우수한 균주인 Acetobacter pasteurianus CK-1을 최종 분리하였다. 분리균주의 최적 생육온도는 30.0℃로 확인되었고, pH 6.0에서 가장 왕성하게 생장하였으며, pH 5.5~6.5 범위에서 잘 생장하였다. A. pasteurianus CK-1은 배지의 초기 에탄올 농도가 4%일 때 가장 왕성하게 생장하였고, 7%의 에탄올 농도에서도 생장이 가능하였다. 분리균주를 막걸리에 접종하여 초산 발효를 유도하였을 때, 발효 초기 pH 3.54였던 것이 발효가 진행되면서 점차 낮아져서 발효 18일 후에는 pH 2.77이 되었다. 산도는 발효 초기에 0.75%였던 것이 발효 4일경부터 점차 증가하여 최종 산도는 5.54%로 증가하였다. A. pasteurianus CK-1 발효 식초에서는 acetic acid가 3,575.7±48.6 mg%로 높게 검출되었고, malic acid와 citric acid는 각각 2,150.8±27.6 mg%와 55.8±3.7 mg%로 검출되었다. 접종한 균주의 종류에 따라 생성되는 유기산의 함량과 비율이 유의하게 차이가 나는 것을 확인하였다. 초산 발효 동안 발효액 내의 효모와 A. pasteurianus CK-1의 개체군은 반비례적으로 변화하였다. 발효 초기에는 효모가 우점하였으나, 발효가 진행됨에 따라 A. pasteurianus CK-1이 서서히 증식하여 10일 후에는 정체기에 이르렀다.

Abstract ▼ AI-Helper

To effectively isolate acetic acid bacteria for producing makgeolli vinegar, various products were researched, and Acetobacter pasteurianus CK-1, a strain that is excellent in acetic acid production, was finally isolated. The optimal growth temperature of the isolated strain was confirmed to be 30℃, and it grew well in the pH range of 5.5~6.5, with optimal growth at pH 6. A. pasteurianus CK-1 had the most active proliferation when the initial ethanol concentration in the medium was 4%, and growth was possible even at an ethanol concentration of 7%. When inoculating the isolated strain into makgeolli to induce acetic acid fermentation, the pH at the beginning of fermentation was 3.54, which was gradually lowered to 2.77 after 18 days of fermentation. The acidity was 0.75% at the beginning of fermentation and gradually started to increase from the 4th day of fermentation. The final acidity at the end of fermentation was 5.54%. In the vinegar fermented by inoculating A. pasteurianus CK-1, acetic acid content was detected to be as high as 3,575.7±48.6 mg%, and the malic acid and citric acid contents were 2,150.8±27.6 and 55.8±3.7 mg%, respectively. Further, it was confirmed that the content and ratio of the organic acids produced significantly differed depending on the type of inoculated bacterial strain. During acetic acid fermentation, the populations of yeast and A. pasteurianus CK-1 were inversely changed. In the initial stage of fermentation, yeast dominated, and after 10 days of fermentation, A. pasteurianus CK-1 slowly proliferated and reached stationary phase.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Comparison of growth of A. pasteurianus CK-1 at different temperature. ♦, 25.0℃; █, 27.5℃; ▲, 30.0℃; ◊, 32.5℃.
그림 Fig. 2. Comparison of growth of A. pasteurianus CK-1 at different pH. ♦, pH 5.5; █, pH 6.0; ▲, pH 6.5; ◊, pH 7.0.
그림 Fig. 3. Comparison of growth of A. pasteurianus CK-1 at different ethanol concentration. ♦, 3%; █, 4%; ▲, 5%; ◊, 6%; ○, 7%.
그림 Fig. 4. Changes of acidity and pH during acetic acid fermentation. ♦, pH; █, acidity.
그림 Fig. 5. Changes of yeast and acetic acid bacteria during during acetic acid fermentation. ♦, yeast; █, acetic acid bacteria.
표 Table 1. The contents of organic acids in makgeolli vinegar

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 우리의 전통 식품으로부터 우수 초산균을 탐색하고, 분리균을 막걸리에 접종하여 식초 발효에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 확인하였다.

제안 방법

분리균주의 적정 생장온도를 확인하기 위하여 3% 에탄올을 함유한 YG 액체배지(Yeast extract 1%, Glucose 5%)에 분리 균주를 접종하여 25.0℃, 27.5℃, 30.0℃, 32.5℃에서 150 rpm으로 진탕배양하면서 일정시간 간격으로 흡광도(660 nm)를 측정하였다.
초산균은 시중에 판매되는 생막걸리와 실험실에서 만든 막걸리, 그리고 가정에서 제조한 재래 식초 등으로부터 분리하였다. 이를 위하여 전통적인 방법으로 막걸리를 제조하여 공기와 접촉한 상태에서 30일 가량 발효시켜 식초를 만들었으며, 시중에 판매되는 생막걸리도 동일한 방법으로 초산 발효시켰다[20].
초산 발효 도중 시료 내의 미생물 군집 변화를 관찰하기 위하여 시료 1 ml를 취하여 10배 희석법으로 희석한 시료를 초산균 계수를 위하여 초산균 분리용 평판배지에, 효모 계수를 위하여 YPD 평판배지에 각각 도말하여 30℃ 배양기에서 배양한 후 형성되는 집락을 계수하였다.
초산 발효 중 일정 시간 간격으로 각 항아리에서 시료를 채취하여 총산도, pH, 유기산, 그리고 총균수의 변화를 관찰하였다.
초산 발효된 막걸리 식초와 각종 재래 식초를 3% 에탄올이 함유된 GYC agar 배지에 도말하여 30℃에서 3일 동안 배양하여 생성된 초산균의 단일 집락(colony)을 동일한 배지에 계대 배양하여 순수 분리한 뒤, 고체배지에 점적하고 30℃에서 7일간 배양한 후 생성된 투명환의 크기를 비교하여 우수 초산균을 선별하였다[8, 13, 22].
초산 생성능이 가장 우수하다고 판단되는 균주를 최종 선택하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.

대상 데이터

5%(v/v)씩 주입하여 30℃ 배양기에 보관하였다. 분리된 균주의 발효 특성 비교를 위한 대조균주로는 농업유전자원센터(KACC)에서 분양받은 Acetobactor pasteurianus KACC 13993, Gluconobactor oxydans KACC 16335를 사용하였다.

성능/효과

pasteurianus CK-1에 의해 발효된 식초에는 acetic acid가 3575.7 ±48.6 mg% 정도로 높게 검출되었으며, malic acid와 citric acid는 각각 2150.8±27.6 mg%와 55.8±3.7가 검출되었는데, 대조 균주인 G
본 연구에서 분리한 A. pasteurianus CK-1의 경우에는 배지 내 초기 에탄올 농도가 4%일 때 가장 활발하게 증식하였으며, 에탄올 농도가 높아질수록 생장이 점차 억제되었지만, 에탄올 농도가 7%인 배지에서도 성장이 가능하였다(Fig. 3).
pasteurianus CK-1 개체수가 매우 낮았지만, 발효가 진행되면서 서서히 A. pasteurianus CK-1이 증식하여 10일 정도 경과 후 정체기에 도달하는 것을 확인할 수 있었다. 발효가 진행됨에 따라 효모 개체수는 점점 감소하였는데, 이는 유기산 생성에 따른 생장억제 결과로 추정된다.
배지 내 알코올 농도가 9%일 경우에는 생장이 현저하게 지연되는 것을 확인할 수 있었다(Data unshown).
분리균의 16S rRNA 염기서열을 비교분석한 결과는 분리 균주는 Acetobacter pasteurianus와 염기서열이 완전히 일치하여 유연관계가 매우 가까움을 확인할 수 있었으며, Acetobacter pasteurianus CK-1로 명명하였다.
분리균주의 적정 생장온도는 30.0℃로 확인되었으며, 27.5 ℃와 32.5℃에서 상대적으로 생장이 급격하게 둔화되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
5 mg% 정도의 높은 농도를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 초산 발효 과정에서 발효균 주에 따라 발효액 내의 유기산 함량 및 비율이 현저하게 달라질 수 있다는 사실을 의미한다. 이전의 연구에서도 발효균 종류, 발효조건 등에 따라 유기산 조성과 함량에 차이가 있는 것이 확인된 바 있다[1].
1). 이러한 생장 특성은 다른 종의 일반 세균에 비하여 매우 좁은 적정 생장 온도를 요구하는 것을 알 수 있었다. 대부분의 초산균은 25~30℃의 적정 생장 온도를 나타내며, 이 온도 보다 높아지면 효소 비활성화, 막 손상, 그리고 생산된 초산의 독성 때문에 생장 저해 효과가 나타나는 것으로 알려져 있다[28].
초산균은 초산 배양 과정에서 배지 내 초산의 농도가 증가함에 따라 세포 외부에 피막을 형성함으로써 pH 저하에 대한 저항성을 나타내는 것으로 알려져 있는데[12], 분리균주는 pH 6.0에서 가장 왕성하게 성장하였으며, pH 5.5와 pH 6.5에서도 높은 성장율을 나타내었다(Fig. 2).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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