[논문]Hsp90에 의한 NF-κB의 활성화를 촉진하는 IKKγ의 역할

이정아; 김동완

doi:10.5352/jls.2022.32.3.241

Hsp90에 의한 NF-κB의 활성화를 촉진하는 IKKγ의 역할
IKKγ Facilitates the Activation of NF-κB by Hsp90 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.3, 2022년, pp.241 - 248

초록
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NF-κB는 염증과 선천성 면역에 중요한 전사인자이며 anti-apoptotic gene을 유도하여 세포의 생존과 발암에도 깊이 연관되어 있으며 많은 신호전달분자 및 신호전달회로와 연결되어있다. 한편, Hsp90는 NF-κB의 활성을 조절한다는 보고가 이루어졌으나 그 구체적인 기전은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 IKK compelx를 구성하는 인자들의 발현 plasmid를 이용하여 NF-κB의 활성조절에서 Hsp90와 IKKγ의 연관성 및 역할을 연구하였다. 그 결과 Hsp90는 IκBα의 인산화와 분해를 촉진하여 NF-κB를 활성화시켰고, NIK과 LPS에 의한 NF-κB의 활성화는 Hsp90에 의해 더욱 활성이 증가하였다. IKKγ는 Hsp90에 의해 증가된 IκBα의 인산화와 분해를 더욱 촉진함으로써 Hsp90의 NF-κB 활성화 작용을 상승시켰다. 이러한 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κB의 활성화 현상은 항상 활성화 된 상태를 유지하는 IKKβ-EE mutant를 이용한 검토에서도 입증되었다. 또한 IKKγ의 deletion mutant를 이용한 검토에서 IKKγ의 N-말단에 위치하는 IKKβ 결합부위와 C-말단에 위치하는 leucine zipper 및 zinc finger 부위는 IKKγ와 Hsp90의 NF-κB에 대한 상호협력적 촉진작용에 필요하지 않았다. 또한 Hsp90에 의해 촉진된 세포내 pro-inflammatory cytokine들의 발현은 IKKγ에 의해 더욱 상승하였다. 이러한 결과로부터 Hsp90와 IKKγ의 상호작용을 차단한다면 NF-κB의 과다활성으로 인한 질병의 예방과 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

NF-κB acts as a critical transcription factor in inflammation and innate immunity, and it is also closely involved in cell survival and tumorigenesis via induction of anti-apoptotic genes. In these processes, NF-κB cooperates with multiple other signaling molecules and pathways, and although many studies have demonstrated that Hsp90 regulates NF-κB activity, the exact mechanism is unclear. In this study, we investigated the relationship between Hsp90 and IKKγ in the regulation of NF-κB using expression plasmids of IKK complex components. Wild-type and deletion mutants of IKKγ were expressed together with Hsp90, and the combined regulatory effect of Hsp90 and IKKγ on NF-κB activation was assayed. The results show that Hsp90 activates NF-κB by promoting the phosphorylation and degradation of IκBα and that activation of NF-κB by NIK and LPS was increased by Hsp90. IKKγ elevated the effect of Hsp90 on NF-κB activation by increasing phosphorylation and degradation of IκBα. The positive regulation on NF-κB by Hsp90 and IKKγ was also proved in analysis with IKKβ-EE, the constitutively active form of IKKβ. In experiments with the deletion mutants of IKKγ, the N-terminal IKKβ binding domain, C-terminal leucine zipper, and zinc finger domains of IKKγ were found not necessary for the positive regulation of NF-κB activity. Additionally, the expression of pro-inflammatory cytokines was synergistically elevated by Hsp90 and IKKγ. These results indicate that inhibiting the interaction between Hsp90 and IKKγ is a possible strategic method for controlling NF-κB and related diseases.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Effect of Hsp90 on the activation of NF-κB. RAW264.7 cells were co-transfected with pNL3.2-κB-RE reporter plasmid and the expression plasmids of IKKβ, NIK, Hsp90 as indicated. Luciferase assay was performed after 40 hr of transfection. (A) (mean ± SD, n=3, **p<0.01, ***p<0.001), and the proteins in total cell lysates were detected by Western blotting (B).
표 Table 1. Primer sequences for RT-PCR
그림 Fig. 2. Synergistic effect of Hsp90 and IKKγ on the activation of NF-κB by NIK. RAW264.7 cells were co-transfected with pNL3.2-κB-RE and the expression plasmids as indicated. Luciferase assay was performed after 40 hr of transfection. (A) (mean ± SD, *p<0.01, **p<0.001), and the proteins in total cell lysates were detected by Western blotting (B).
그림 Fig. 3. Synergistic effect of Hsp90 and IKKγ on the activation of NF-κB by LPS. RAW264.7 cells were co-transfected with indicated plasmids and after 35 hr, the cells were treated with 0.5 μg/ ml of LPS. Luciferase assay (A) (mean ± SD, *p<0.01, **p<0.001) and Western blotting (B) were performed after 3 hr of treatment with LPS.
그림 Fig. 4. Synergistic effect of Hsp90 and IKKγ on the NF-κB activation triggered by IKKβ-EE. RAW264.7 cells were co-transfected with indicated plasmids and after 40 hr, luciferase assay (A) (mean ± SD, *p<0.05, **p<0.01, ***p< 0.001) and Western blotting (B) were performed.
그림 Fig. 5. The structure of wild type, N-terminal and C-terminal deletion mutants of mouse IKKγ. IKKβ binding domain at N-terminal and leucine zipper domain (LZ), zinc finger domain (ZF) at C-terminal were shown. The numbers indicate the number of amino acids.
그림 Fig. 6. Effect of IKKγ on the activation of NF-κB by Hsp90. RAW264.7 cells were co-transfected with indicated plasmids, and luciferase assay (A) (mean ± SD, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001) and Western blotting (B) were performed after 40 hr of transfection.
그림 Fig. 7. Elevation of the expression of pro-inflammatory cytokines by Hsp90 and IKKγ. RAW264.7 cells were cotransfected with indicated expression plasmids and after 40 hr, the mRNA level of each protein was evaluated by RT-PCR.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구는 Hsp90와 IKKγ의 NF-κB 활성화 과 정에서의 역할을 확인하고 Hsp90와 IKKγ의 상호작용에 의한 NF-κB의 활성화 기전을 규명하여 NF-κB의 과다 활성에 의해 유발되는 염증 질환과 암의 발생을 예방하고 치료하는 데 도 움을 주고자 하였다.
본 연구에서는 Hsp90에 의한 NF-κB의 활성 조절 기전을 명확히 하기 위해 Hsp90와 IKKγ의 상호연관성을 검토하였다

제안 방법

그러므로 NF-κB의 활성화 과정에서 Hsp90와 IKKγ의 상호작 용 기전을 더욱 상세히 검토하기 위하여 IKKγ의 deletion mutant를 사용하였다
세포 외부로부터 NF-κB의 활성화 자극이 작용하였을 때 NF-κB의 활성화에 미치는 Hsp90와 IKKγ의 영향을 알아보기 위해 Hsp90와 IKKγ의 발현 plasmid를 세포 내에 도입하고 NF-κB의 대표적인 외부 활성화인자인 bacterial LPS (lipopolysaccharide)를 처리한 후 luciferase assay를 실시하였다
이에 따라 NIK에 의해 NF-κB가 활성 화 될 때 Hsp90는 어떠한 영향을 미치는지, 이 때 IKK complex에서 조절인자로 작용하는 IKKγ는 어떤 역할을 하는지 알아보기 위해 IKKβ, NIK, Hsp90, IKKγ의 발현 plasmid를 세포에 도입하고 luciferase reporter gene assay를 실시하였 다

대상 데이터

사용 한 발현 plasmid는 사람의 IKKβ [10], IKKβ-EE [15], NIK [10], Hsp90 [18]의 cDNA와 mouse IKKγ [10]의 cDNA를 pCMV5 벡터에 cloning한 것이며, plasmid DNA의 세포 내 도입을 위한 transfection은 FuGENE6Ⓡ (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 lipofection을 진행하였다
사용한 mutant는 mouse IKKγ의 N-말단 의 IKKβ 결합 부위 100아미노산이 결손된 ΔN과 C-말단의 leucine zipper (LZ)부위와 zinc finger (ZF) 부위를 포함하는 100아미노산이 결손된 ΔC를 사용하였다(Fig
쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 실험에 사용하였으며 세포의 배양은 FBS (Fetal Bovine Serum)가 10% 함유된 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)배지로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다

데이터처리

One way ANOVA와 tukey’s test를 이용하여 통계적으로 분석하였으 며, p값이 0.05 이하이면 유의성이 있다고 판단하였다.
실험은 3회 반복하였고, 결과는 Graphpad Prism5를 이용 하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타내었다

성능/효과

6) IKKγ는 IKKβ와 결합하지 않은 상태로, 또한 고분자 복합체 를 형성하지 않은 상태에서도 Hsp90와 상호작용 및 NF-κB를 활성화 함을 알 수 있었다
그리고 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κ B의 활성증가가 실제 NF-κB의 target 유전자의 발현 증가로 이어지는지 검토한 결과 iNOS, COX-2, TNF-α를 비롯한 여러 종류의 pro-inflammatory cytokines의 발현 증가가 확인되어 (Fig. 7) Hsp90의 비정상적 발현 증가는 인체 내 다양한 염증의 유발과 그로인한 염증성 암의 발생을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 그러므로 Hsp90를 target으로 하는 저해제 뿐 아니 라 Hsp90와 IKKγ의 상호작용을 차단하는 저해제도 NF-κB의 과다활성으로 인한 질병의 예방과 치료에 도움이 될 수 있을 것으로 사료되며 NF-κB를 조절하는 다양한 signaling proteins의 작용 기전을 추가로 연구한다면 더욱 효율적인 NF-κB 의 제어방법이 모색될 것으로 보인다.
Hsp90에 의 한 NF-κB의 활성화 작용이 IKKγ의 발현 plasmid의 도입으로 IKKγ가 과발현 될 때 더욱 상승하는 것으로 보아 Hsp90는 IKKγ와 상호작용하여 NF-κB를 활성화시킬 가능성이 크다는 결론을 얻을 수 있었다(Fig
그 결과 Hsp90는 NIK과 LPS에 의한 NF-κB의 활성화를 증가 시켰고 IKKγ는 이러한 증가를 더욱 가중시켰다
그리고 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κ B의 활성증가가 실제 NF-κB의 target 유전자의 발현 증가로 이어지는지 검토한 결과 iNOS, COX-2, TNF-α를 비롯한 여러 종류의 pro-inflammatory cytokines의 발현 증가가 확인되어 (Fig
또한 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κB의 활성화가 IκBα의 인산화 및 분해의 증가에 의한 것으로 나타나 Hsp90와 IKKγ가 IκBα의 인산화에 직접 관여하 는 IKK complex의 활성을 증가시킴을 알 수 있었다
또한 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κB의 활성화가 항상 활성화된 상태 를 유지하는 IKKβ-EE mutant에서도 동일하게 나타난 것으로 보아 Hsp90가 IKKβ를 활성화시키는 upstream kinase에 작용 하는 것이 아니라 IKKγ complex에 직접 작용하는 것이며 이 때 IKK complex 내에있는 IKKγ가 Hsp90의 작용을 상승시킴 을 알 수 있었다(Fig
아울러, IKKγ의 N-말단의 IKKβ 결합 부위와 C-말단의 leucine zipper 및 zinc finger 부위가 결손된 IKKγ에서도 NF-κB의 활성 증가가 나타난 것으로 보아(Fig
위의 결과에서 Hsp90는 NF-κB를 활성화시켰고 IKKγ는 Hsp90의 활성화 작용을 더욱 상승시키는 것으로 나타났다
이 결과로부터 Hsp90는 NIK과 마찬가지로 IKKβ에 의 한 IκBα의 인산화와 분해를 통한 NF-κB의 활성화를 촉진함을 알 수 있었고, 또한 Hsp90가 IKKβ와 IKKγ를 포함하는 IKK complex에 작용하여 NF-κB를 활성화시킬 가능성이 있음을 알 수 있었다.
이러한 IKKβ-EE에 대한 Hsp90와 IKKγ의 작 용을 검토한 결과 IKKβ-EE는 IKKβ와 달리 NIK이나 LPS가 없어도 높은 NF-κB활성을 나타내었으며(Fig
이러한 결과로 부터 Hsp90와 IKKγ의 상호작용에 의한 NF-κB의 활성화 작용 은 upstream kinase를 활성화하는 것이 아니라 IKK complex 에 직접 작용하는 것임을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터 IKKγ는 Hsp90의 NF-κB 활성화 작용을 더욱 상승시키고 이는 인체 내 pro-inflammatory cytokines의 발현을 증가시켜 염증을 비 롯한 관련 질병을 유발할 수 있음을 알 수 있었다.

후속연구

7) Hsp90의 비정상적 발현 증가는 인체 내 다양한 염증의 유발과 그로인한 염증성 암의 발생을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 그러므로 Hsp90를 target으로 하는 저해제 뿐 아니 라 Hsp90와 IKKγ의 상호작용을 차단하는 저해제도 NF-κB의 과다활성으로 인한 질병의 예방과 치료에 도움이 될 수 있을 것으로 사료되며 NF-κB를 조절하는 다양한 signaling proteins의 작용 기전을 추가로 연구한다면 더욱 효율적인 NF-κB 의 제어방법이 모색될 것으로 보인다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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