[논문]U46619-유도의 혈소판에서 PI3K/Akt 및 MAPK 조절을 통한 Artemether의 응집억제효과

박창은; 이동하

doi:10.22889/kjp.2022.53.2.64

U46619-유도의 혈소판에서 PI3K/Akt 및 MAPK 조절을 통한 Artemether의 응집억제효과
Anti-aggregation Effect of Artemether Through Regulation of PI3K/Akt and MAPK in U46619-induced Platelets 원문보기

생약학회지, v.53 no.2, 2022년, pp.64 - 69

박창은 (남서울대학교 임상병리학과.분자진단연구소) , 이동하 (남서울대학교 임상병리학과.분자진단연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

When blood vessels are damaged, a rapid hemostatic response should occur in order to lower blood loss and keep normal circulation, and platelet activation and aggregation are essential. Nevertheless, abnormal or excessive platelet aggregation can be a reason of cardiovascular diseases including thrombosis, atherosclerosis, and stroke. Therefore, the screening for a substance which can regulate platelet activation and suppress aggregation reaction is very important for treatment and prevention of cardiovascular diseases. Artemether is a methyl ether derivative of artemisinin, which is isolated from the antimalarial plant Artemisia annua, but research on platelet aggregation or its mechanisms is still insufficient. This study identified the effects of artemether on U46619-induced human platelet aggregation and their granule secretion (ATP and serotonin release). In addition, the effects of artemether on the phosphorylation of PI3K/Akt or MAPK, which are related to signal transduction in platelet aggregation, were studied. As the results, artemether significantly lowered PI3K/Akt and MAPK phosphorylation, which inhibited platelet aggregation through granule secretion (ATP and serotonin release) dose-dependently. Therefore, we suggest that artemether is an antiplatelet substance that regulates PI3K/Akt and MAPK pathway and is of value as a therapeutic and preventive agent for platelet-derived cardiovascular diseases.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. The structure of artemether. PIN: Dihydroartemisinin methyl ether, Chemical formula: C₁₆H₂₆O₅, Molar mass: 298.379 g/mole.
그림 Fig. 2. Effects of artemether platelet aggregation and cytotoxicity. (A) Effect of artemether on the aggregation U46619-induced human platelets. (B) Half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) value of artemether in U46619-induced human platelet aggregation. (C) Effect of artemether on cytotoxicity. The aggregation of platelets and cytotoxicity were implemented as stated in the "Materials and Methods" part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.001 versus U46619- stimulated human platelets. NS, not significant.
ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets." alt="Fig. 3. Effects of artemether on PI3K and Akt phosphorylation. Western blot was implemented as stated in the "Materials and Methods" part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets." onerror="this.src='/images/noimg.png'" class="objectfit" /> 그림 Fig. 3. Effects of artemether on PI3K and Akt phosphorylation. Western blot was implemented as stated in the "Materials and Methods" part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets.
ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets." alt="Fig. 4. Effects of artemether on MAPK phosphorylation. Western blot was implemented as stated in the "Materials and Methods" part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets." onerror="this.src='/images/noimg.png'" class="objectfit" /> 그림 Fig. 4. Effects of artemether on MAPK phosphorylation. Western blot was implemented as stated in the "Materials and Methods" part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets.
ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets." alt="Fig. 5. Effects of artemether on granule secretion (A) Effects of artemether on ATP release. (B) Effects of artemether on serotonin release. Measurement of granule secretion was implemented as stated in the "Materials and Methods" part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets." onerror="this.src='/images/noimg.png'" class="objectfit" /> 그림 Fig. 5. Effects of artemether on granule secretion (A) Effects of artemether on ATP release. (B) Effects of artemether on serotonin release. Measurement of granule secretion was implemented as stated in the "Materials and Methods" part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets.

AI 본문요약
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제안 방법

Artemether가 MAPK 경로에 미치는 효과 −본 연구에서는 artemether가 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 경로 로 알려진 단백질들이 인산화 및 그로 인해 유도되는 혈소 판 과립 방출에 미치는 효과를 확인하였다
Artemether가 PI3K/Akt 경로에 미치는 효과 − PI3K/Akt 가 혈소판 내 과립의 방출에 관여하는 단백질로 알려져 있 기때문에, 본 연구에서 우리는 artemether가 PI3K/Akt의 인 산화에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다
본 연구는 U46619 가 유도한 사람 혈소판 응집에서 artemether가 미치는 영향을 확인하였고, artemether의 인산화단백질의 조절에 미치는 작용 기전을 명확히 하였다. Artemether은 혈소판 응집 반응 중에 일어나는 신호 전달 과정에 작용한다고 알려진 인산화 단백질인 PI3K/Akt 경로 및 MAPK 경로를 하향 조절하였다. 또한, artemether는 ATP 및 serotonin을 포함한 혈소판 내 과립 분비를 감소시킴으로써 결과적으로 농도 의존적으로 혈소판 응집을 억제하였다.

대상 데이터

1). U46619는 Chrono-Log Corporation(Havertown, PA, USA)에서 제공되었다. ATP assay kit와 serotonin EIA kit를 Cayman Chemical Co.
시료−Artemether는 Avention Corporation(Siheung, Korea) 에서 구입하여 사용하였다(Fig

데이터처리

05를 통계적으로 유의성이 있는 것으로 하였다. 분산 분석에 따라 그룹 평균 간의 유의성이 있는 경우에는 각 그룹을 Scheffe의 방법으로 비교하였다.
통계 분석−실험 결과의 분석을 위해 평균±표준 편차를 사용하였고, ANOVA 또는 Student’s t-test 를 사용하여 통계 분석을 수행하였으며, P<0.05를 통계적으로 유의성이 있는 것으로 하였다

성능/효과

앞 선 연구들을 살펴볼 때, 사람 혈소판에는 다량의 MAPK 가 함유되어 있고, 활성화 작용제들에 의해 혈소판이 활성 화될 때 MAPK의 인산화가 촉발되면서 혈소판 응집에 기 능하는 것으로 알려져 있다. 11-13) 본 연구의 결과는 artemether 가 MAPK 경로의 인단백질의 인산화를 하향조절하여 혈소 판 내 과립분비 억제와 혈소판 응집의 억제에 기여하는 것으로 보여진다.
그 결과, Fig. 3 에서 보여주는 바와 같이, U46619는 PI3k/Akt의 인산화를 강력히 증가시켰고, artemether는 U46619에 의해 증가된 PI3k/Akt의 인산화를 농도의존적으로 억제하였다. 이는 artemether가 U46619 유도의 사람 혈소판에서 유의하게 PI3k/Akt의 인산화를 억제할 수 있는 물질임을 명확히 한 것이다.
Fig. 4를 보면 알 수 있듯이, U46619의 유도에 의해 인산화된 JNK/p38가 artemether에 의해 유의적으로 감소되었으나, ERK의 인산 화에는 유의한 영향을 미치지 않았다. 이는 artemether가 JNK/p38의 인산화를 억제하여 혈소판 응집의 신호 전달 과 정을 조절하고 있음을 보여준다.
그 결과, U46619에 의해 ATP 방출이 0.15 ± 0.02 µM(intact cell)에서 8.41 ± 0.15 µM까지 증가되었다(Fig
혈소판 활성화 및 응집 심혈관계 질환을 유도하는 중요한 인자로 알려져 있다. 따라서, 혈소판 활성화를 억제하는 것은 심혈관계 질환에 대한 매력적인 예방 및 치료 표적으로 여겨진다. Artemether는 항말라리아 식물인 Artemisia annua 에서 분리된 artemisinin의 methyl ether 유도체로 말라리아 치료에 효과적인 것으로 알려져 있지만, 혈소판 활성화와 그 기전에 대해서는 알려진 연구가 없다.
Artemether은 혈소판 응집 반응 중에 일어나는 신호 전달 과정에 작용한다고 알려진 인산화 단백질인 PI3K/Akt 경로 및 MAPK 경로를 하향 조절하였다. 또한, artemether는 ATP 및 serotonin을 포함한 혈소판 내 과립 분비를 감소시킴으로써 결과적으로 농도 의존적으로 혈소판 응집을 억제하였다. 이러한 결과로 볼 때, artemether가 사람 혈소판 활성화와 이를 통해 일어나는 혈전 형성을 억제하는 데 있어서 유효한 물질임을 시사한다.
Artemether는 항말라리아 식물인 Artemisia annua 에서 분리된 artemisinin의 methyl ether 유도체로 말라리아 치료에 효과적인 것으로 알려져 있지만, 혈소판 활성화와 그 기전에 대해서는 알려진 연구가 없다. 본 연구는 U46619 가 유도한 사람 혈소판 응집에서 artemether가 미치는 영향을 확인하였고, artemether의 인산화단백질의 조절에 미치는 작용 기전을 명확히 하였다. Artemether은 혈소판 응집 반응 중에 일어나는 신호 전달 과정에 작용한다고 알려진 인산화 단백질인 PI3K/Akt 경로 및 MAPK 경로를 하향 조절하였다.
42 ng/108 cells로 농도의존적으로 감소시켰다. 이 결과들은 artemether가 혈소판의 과립분비를 유의적으로 억제한다는 것을 확실하게 보여준다.
4를 보면 알 수 있듯이, U46619의 유도에 의해 인산화된 JNK/p38가 artemether에 의해 유의적으로 감소되었으나, ERK의 인산 화에는 유의한 영향을 미치지 않았다. 이는 artemether가 JNK/p38의 인산화를 억제하여 혈소판 응집의 신호 전달 과 정을 조절하고 있음을 보여준다. 앞선 연구 결과들에서 혈 소판 응집을 억제하는 물질이 JNK/p38에 비해 ERK 인산 화에 미치는 영향이 미미하다는 보고가 있다.
3 에서 보여주는 바와 같이, U46619는 PI3k/Akt의 인산화를 강력히 증가시켰고, artemether는 U46619에 의해 증가된 PI3k/Akt의 인산화를 농도의존적으로 억제하였다. 이는 artemether가 U46619 유도의 사람 혈소판에서 유의하게 PI3k/Akt의 인산화를 억제할 수 있는 물질임을 명확히 한 것이다.
또한, artemether는 ATP 및 serotonin을 포함한 혈소판 내 과립 분비를 감소시킴으로써 결과적으로 농도 의존적으로 혈소판 응집을 억제하였다. 이러한 결과로 볼 때, artemether가 사람 혈소판 활성화와 이를 통해 일어나는 혈전 형성을 억제하는 데 있어서 유효한 물질임을 시사한다.

후속연구

PI3K/Akt 경로는 혈소판이 활성화되면서 세포 내 신호 전 달이 일어나는 과정에 작용하며, 이들의 인산화 반응이 혈 소판 응집과 dense 과립 분비를 포함한 혈소판의 조절 및 기능에서 주요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. 16) 본 연 구에서 확인된 결과를 통해 artemether가 PI3K/Akt 경로의 인단백질의 인산화를 하향조절하면서 혈소판의 과립분비 및 혈소판 응집의 억제에 기여할 것이라고 기대된다.
앞선 연구 결과들에서 혈 소판 응집을 억제하는 물질이 JNK/p38에 비해 ERK 인산 화에 미치는 영향이 미미하다는 보고가 있다. 20,21) 따라서, ERK, JNK 및 p38의 인산화와 이들 MAPK가 사람 혈소판 의 응집반응에 어떻게 관여하는지에 대해서는 추가적인 연 구가 수행될 필요가 있어 보인다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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