[논문]Methicillin resistant staphylococcus aureus에 대한 지유산의 항균활성

황해; 강옥화; 권동렬

doi:10.22889/kjp.2022.53.2.87

[국내논문] Methicillin resistant staphylococcus aureus에 대한 지유산의 항균활성
Antibacterial Activity of JiYu-san Against Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 원문보기

생약학회지, v.53 no.2, 2022년, pp.87 - 95

황해 (원광대학교 약학대학 한약학과, 원광한약연구소) , 강옥화 (원광대학교 약학대학 한약학과, 원광한약연구소) , 권동렬 (원광대학교 약학대학 한약학과, 원광한약연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

Methicillin resistance Staphylococcus aureus (MRSA) is a gram-positive bacterium, the most commonly isolated bacterial human pathogen. JiYu-san is one of the natural products used to treat diseases in the folk recipe. In this study, we investigated the antimicrobial activity of EtOH 70% extracts of JiYu-san (JYS) against MRSA. The antibacterial activity of JYS against MRSA strain was evaluated using minimum inhibitory concentration (MIC), checkerboard dilution test, and time-kill assay. The effect of JYS on the immune mechanism of MRSA was confirmed through cell membrane permeability tests and energy metabolism tests, and the antibacterial activity mechanism was performed using qRT-PCR and western blot. As a result, in the antibacterial test of JYS, the MIC was measured to be 1.9~1000 ㎍/mL, and synergistic or showed a partial synergistic effect. In addition, JYS showed antibacterial activity in a combination test with DCCD or TX-100. In a study on the mechanism of action of antibacterial activity, it was found that JYS suppressed MRSA resistance genes and proteins. These results suggest that JYS has antibacterial activity and provides great potential as a natural antibiotic by modulating the immune mechanism against MRSA.

주제어

표/그림 (8)

표 Table I. Primer used in this experiment
표 Table II. The MIC of JYS against MRSA
표 Table III. The MIC value of antibiotic and synergistic effect of JYS combined with antibiotics
그림 Fig. 1. Time–kill curves of the synergistic effect of JYS in combination with 4 conventional antibiotics at sub-inhibitory concentrations against MRSA (ATCC 33591). (a) AMP, Ampicillin; (b) OXA, oxacillin; (c) GT, gentamicin; (d) AMK, amikacin. JYS, JiYu-san; CFU, colony-forming units; MIC, minimum inhibitory concentration.
그림 Fig. 2. Time–kill curves of the synergistic effect of JYS in combination with 4 conventional antibiotics at sub-inhibitory concentrations against MRSA (DPS-1). (a) AMP, Ampicillin; (b) OXA, oxacillin; (c) GT, gentamicin; (d) AMK, amikacin; JYS, JiYu-san; CFU, colony-forming units; MIC, minimum inhibitory concentration.
그림 Fig. 3. The effect of membrane-permeabilizing agents and ATPase inhibitors on the susceptibility of MRSA (ATCC 33591) to JYS. Bacterial viability was determined by absorbance at 600 nm after incubation for 24 h with JYS concentrations of 15.6 μg/mL JYS in the presence of 0.001% TX-100 (a) and 7.8 μg/mL JYS in the presence of 62.5 μg DCCD (b). The data were presented as the mean ± standard deviation of the three independent experiments. *represents p < 0.05. CON, untreated control MRSA; DCCD, N,N′-dicyclohexylcarbodiimide; TX-100, Triton X-100; OD 600, optical density at 600 nm.
그림 Fig. 4. Effect of JYS at sub-concentrations on the expression of penicillin-binding protein 2a (PBP2a) in MRSA (ATCC 33591). CON, the control was treated without TCA; PBP2a production after treatment with TCA at 1/8 MIC, 1/4 MIC, and 1/2 MIC, respectively.
그림 Fig. 5. The expression of mecA, mecR1, and mecI in MRSA (ATCC 33591) cultures in the presence of sub-concentrations of JYS. The relative gene expression of mecA, mecR1, and mecI was reduced in a dose-dependent manner. The data were presented as the mean ± standard deviation of the three independent experiments. *represents p < 0.05.

AI 본문요약
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문제 정의

Membrane permeability inhibition − JYS의 membrane permeability 증진과 MRSA의 생장 억제를 알아보기 위해 S

제안 방법

Fig. 3b에서 MRSA균주에서 JYS가 에너지 대사에 영향을 주는지 ATPase 억제제(DCCD)를 이용하여 실험하였다. 그 결과, MRSA는 단독으로 JYS(1/8 MIC) 또는 62.
이 결과는 JYS가 MRSA의 내성을 극복하고 항생제가 항균활성을 나타내는데, 큰 영향을 준다는 것을 나타내는 것이다. JYS가 MRSA 의 막 투과성에 미치는 영향을 확인하기 위해 균에 막 투과성 증진제인 TX-100과 JYS를 단독 또는 병용투여하여 항균 활성의 영항을 실험하였다. 그 결과 JYS 단독의 OD 600 값(1/4 MIC)과 비교하여 1/4 MIC JYS 및 0.
MRSA에 대한 JYS의 세포막 투과성과 에너지 대사에의 영향−JYS가 MRSA의 세포막 투과성과 에너지 대사에 미치는 영향을 확인하기 위해 균에 막 투과성 증진제인 TX- 100과 ATPase 억제제(DCCD)를 이용하여 실험하였다
Metabolic inhibition−JYS의 energy 대사 연관성 유무를 알아보기 위하여, ATPase inhibitor로써 사용되는 N, N′- Dicyclohexylcarbodiimide(DCCD) 단독 투여와 JYS 단독 투여, DCCD와 JYS의 병용투여를 비교하였다.
PBP2a의 발현에서 JYS의 억제효과−JYS가 MRSA의 내성을 유전자를 조절하는지 알아보기 위해, 내성 단백질인 PBP2a 발현을 확인하였다
Membrane permeability inhibition − JYS의 membrane permeability 증진과 MRSA의 생장 억제를 알아보기 위해 S. aureus의 membrane permeability를 증진시키는 detergent 인 TX-100 단독투여, JYS 단독투여, TX-100과 JYS의 병 용투여를 비교하였다.
희석 후 여러 농도의 JYS을 처리 후 30분간 배양한 다음, 13, 000 rpm에서 1분간 원심분리 후 균을 모아 easy-REDTM BYF Total RNA Extraction Kit(Intron, Daejon, Korea)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 RNA를 추출 후 QuantiTect® Reverse Transcription Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 cDNA를 만들었다. 합성된 cDNA에 mecA, biaR1, blaZ and mecR1, 16s rRNA의 primer(Table I)와 Power SYBR Green PCR Master Mix(Life technologies, CA, USA)를 섞어준 후, StepOnePlus realtime PCR system (Applied Biosystems, CA, USA)을 이용하여 qRT-PCR을 실시하였다.
희석 후 여러 농도의 JYS을 처리 후 30분간 배양한 다음, 13, 000 rpm에서 1분간 원심분리 후 균을 모아 easy-REDTM BYF Total RNA Extraction Kit(Intron, Daejon, Korea)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 RNA를 추출 후 QuantiTect® Reverse Transcription Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 cDNA를 만들었다

대상 데이터

균주 배양−본 실험에 사용한 표준균주 ATCC 33591은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, CCARM 3090, 3091, 3095, 3102는 서울여대 항생제 내성 균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, CCARM, Korea)으로부터, 임상균주 DPS-1, DPS-2은 원광대학교 병원 성형외과(Department of plastic surgery, DPS)로부터 분양받아 실험에 사용하였다

데이터처리

통계분석−모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험 결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차(SEM)를 구하여 그 유의성은 GraphPad Prism 분석법을 이용하여 신뢰수준 95%(p<0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.

이론/모형

RNA 분리 및 Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR)−MRSA 내성 관련 mRNA의 발현 정도를 보기 위하여 qRT-PCR 방법을 사용하였다

성능/효과

β-lactam resistance 관련 mRNA 발현에 대한 JYS의효과−JYS가 MRSA의 베타락탐 항생제의 내성에 관여하는 mRNA의 발현에 미치는 영향을 보기 위해 qRT-PCR을 실시한 결과, 각 PBP2a와 β-lactamase의 생성에 관여하는 mRNA인 mecA, blaR1, blaZ, mecR1의 발현이 JYS을 처리하였을 때 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig
JYS와 항생제 병용투여에 의한 약물병용 효과−JYS와항생제와의 synergy 효과를 확인하기 위해 checkerboard assay를 실시한 결과, JYS과 AMP 병용시에는 ATCC 33591, CCARM 3090, DPS-1에서 synergy를 보였고, DPS-2에 대해서는 patial synergy를 보였다
AMK 투여시에는 ATCC 33591, DPS-1에서 synergy를 보였고, CCARM 3090, DPS-2에서 patial synergy를 보였다(Table III). 또한, JYS와항생제(AMP, OXA, GT, AMK)를 병용 투여 시 시간에 따른 MRSA의 생장곡선을 측정한 결과 표준균주인 ATCC 33591(Fig. 1)과 임상균주 DPS-1(Fig.
JYS의 MRSA에 대한 항균활성−MRSA에 대한 JYS의항균활성을 실험한 결과 MRSA 표준균주인 ATCC 33591 와 임상균주 CCARM 3090, 3091, 3095, 3102, DPS-1, 2에서 1.9~1, 000 μg/mL의 MIC 결과 값이 나타났다(Table II).
JYS가 MRSA 의 막 투과성에 미치는 영향을 확인하기 위해 균에 막 투과성 증진제인 TX-100과 JYS를 단독 또는 병용투여하여 항균 활성의 영항을 실험하였다. 그 결과 JYS 단독의 OD 600 값(1/4 MIC)과 비교하여 1/4 MIC JYS 및 0.001% TX-100 의 존재 하에서 현탁액의 OD 600 값은 43.6% 감소했다 (Fig. 3a).
그 결과, MRSA는 단독으로 JYS(1/8 MIC) 또는 62.5 μg/mL DCCD 의 존재 하에서 생존 가능하였다
이는 JYS가 MRSA의 내성에 영향을 줄것이라 예측하고, western blot을 수행하여 MRSA의 β-lactam 내성에 관여하는 protein인 PBP2a의 발현을 확인하였다. 그 결과, 표준 균주인 ATCC 33591에 JYS 처리하였을 때, PBP2a의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 4).
5 μg/mL DCCD 의 존재 하에서 생존 가능하였다. 그러나, JYS와 DCCD을병용 투여 하였을 때는 균 생장이 억제되어 53.7%의 생존율 감소가 나타났다. 이는 JYS가 ATPase inhibitor 역할을 하는 약물과도 좋은 시너지를 보일 수 있다는 것을 의미한다.
이는 세포막투과에 영향을 주는 약물 또는 ATPase inhibitor 역할을 하는 약물과 병용 시 좋은 시너지를 보일 수 있다는 것을 의미한다. 그리고 JYS과 β-lactam계 항생제와 상승효과가 나타나는 데에는 JYS가 MRSA의 항생제 내성 유전자를 억제함으로써 나타나는 것으로 사료 된다. 이는 JYS가 향후 MRSA의 감염증을 치료하는데 있어 유효한 후보물질이 될 수 있음을 시사한다.
위 실험 결과를 종합할 때 JYS은 MRSA에 대하여 항균 활성을 가지고 있으며, 항생제인 AMP, OXA, GT, AMK와병용 시 상승효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이는 세포막투과에 영향을 주는 약물 또는 ATPase inhibitor 역할을 하는 약물과 병용 시 좋은 시너지를 보일 수 있다는 것을 의미한다.
2)에서 시간이 지남에 따라 균의 생장이 억제되었다. 이 결과는 JYS가 MRSA의 내성을 극복하고 항생제가 항균활성을 나타내는데, 큰 영향을 준다는 것을 나타내는 것이다. JYS가 MRSA 의 막 투과성에 미치는 영향을 확인하기 위해 균에 막 투과성 증진제인 TX-100과 JYS를 단독 또는 병용투여하여 항균 활성의 영항을 실험하였다.
위 실험 결과를 종합할 때 JYS은 MRSA에 대하여 항균 활성을 가지고 있으며, 항생제인 AMP, OXA, GT, AMK와병용 시 상승효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이는 세포막투과에 영향을 주는 약물 또는 ATPase inhibitor 역할을 하는 약물과 병용 시 좋은 시너지를 보일 수 있다는 것을 의미한다. 그리고 JYS과 β-lactam계 항생제와 상승효과가 나타나는 데에는 JYS가 MRSA의 항생제 내성 유전자를 억제함으로써 나타나는 것으로 사료 된다.
3a). 이에 JYS와 세포막 투과에 영향을 주는 약물과 병용 시 상승효과를 보일 수 있다는 것을 알 수 있었다. Fig.
특히, MRSA는 β-lactam 항생제에 대해 강한 내성을 가지고 있으며, JYS와 병용 시 두 항생제의 항균활성에 필요한 최소농도가 감소하는 것을 확인하였다

후속연구

그리고 JYS과 β-lactam계 항생제와 상승효과가 나타나는 데에는 JYS가 MRSA의 항생제 내성 유전자를 억제함으로써 나타나는 것으로 사료 된다. 이는 JYS가 향후 MRSA의 감염증을 치료하는데 있어 유효한 후보물질이 될 수 있음을 시사한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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