[논문]바이오접합과 자가결합을 이용한 박테리아 세포막의 위치 특이적 형광 표지

양이지; 임성인

doi:10.9713/kcer.2022.60.3.398

바이오접합과 자가결합을 이용한 박테리아 세포막의 위치 특이적 형광 표지
Site-specific Dye-labeling of the Bacterial Cell Surface by Bioconjugation and Self-assembly 원문보기

Korean chemical engineering research = 화학공학, v.60 no.3, 2022년, pp.398 - 406

양이지 (부경대학교 화학공학과) , 임성인 (부경대학교 화학공학과)

초록
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그람음성균의 외막은 수많은 생물물리학적 및 생화학적 과정이 작용하여 생존력을 유지하도록 설계되어 있는 세포환경의 가장 바깥 층이다. 세포공학의 발전으로 인해 박테리아의 막 환경을 변경하는 등 유전정보를 원하는 대로 조작할 수 있게 되었고 이는 박테리아를 특정 목적에 적용시킬 수 있게 하였다. 그중 기능성 분자를 박테리아 외막에 표지하는 세포 표면공학은 숙주세포가 특정 외부물질이나 자극에 반응하도록 유도하는 전략 중 하나이다. 기능성 펩타이드 또는 단백질을 세포 표면에 표지하기 위한 방법으로 막 고정 모티프를 융합한 후 세포 내에서 발현하는 방법이 일반적으로 사용되고 있지만 이는 박테리아 시스템에서 발현할 수 없는 외인성 단백질이나 크기가 큰 단백질에는 적용할 수 없다는 한계점이 있다. 박테리아 외막의 구성요소에 자연적으로 존재하는 반응성 그룹과 기능성 물질을 화학접합하는 방법도 있으나 필수 구성 요소의 비특이적 변형으로 인해 세포의 생장이 저해되는 경우가 많다. 본 연구에서는 비천연아미노산 또는 자가결합 도메인을 사용해 대장균의 세포 표면을 부위 특이적으로 형광 표지하는 두 가지의 접근법을 수행하였다. 첫 번째 접근법은 화학선택적 반응성을 지닌 비천연아미노산이 삽입된 펩타이드를 대장균 표면에 발현하여 위치 특이적으로 형광염료를 접합시키는 방법이다. 두 번째 접근법은 자가결합능력을 지닌 이종 이량체 코일-코일에서 유래된 α-나선 도메인을 대장균 외막에 발현하고 녹색 형광 단백질이 융합된 상보적인 α-나선 도메인을 막 표면에 특이적으로 고정하는 방법이다. 제시된 방법들은 위치와 시간이 제어된 방식으로 박테리아 외막에 새로운 기능을 부여하는 방법론으로서 유용하다.

Abstract ▼ AI-Helper

The outer membrane of Gram-negative bacteria is the outermost layer of cellular environment in which numerous biophysical and biochemical processes are in action sustaining viability. Advances in cell engineering enable modification of bacterial genetic information that subsequently alters membrane physiology to adapt bacteria to specific purposes. Surface display of a functional molecule on the outer membranes is one of strategies that directs host cells to respond to a specific extracellular matter or stimulus. While intracellular expression of a functional peptide or protein fused to a membrane-anchoring motif is commonly practiced for surface display, the method is not readily applicable to exogenous or large proteins inexpressible in bacteria. Chemical conjugation at reactive groups naturally occurring on the membrane might be an alternative, but often compromises fitness due to non-specific modification of essential components. Herein, we demonstrated two distinct approaches that enable site-specific decoration of the outer membrane with a fluorescent agent in Escherichia coli. An unnatural amino acid genetically incorporated in a surface-exposed peptide could act as a chemoselective handle for bioorthogonal dye labeling. A surface-displayed α-helical domain originating from a part of a selected heterodimeric coiled-coil complex could recruit and anchor a green fluorescent protein tagged with a complementary α-helical domain to the membrane surface in a site- and hetero-specific manner. These methods hold a promise as on-demand tools to confer new functionalities on the bacterial membranes.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Schematics of site-specific cell surface labeling. a) Surface presentation of a peptidyl motif containing an unnatural amino acid, pazido- L-phenylalanine (AzF), and its bioorthogonal conjugation with dibenzocyclooctyne (DBCO) or its derivatives. b) Surface presentation of an α-helical motif (Coil A) and its assembly with green fluorescent protein (GFP) tagged with a complementary α-helical motif (Coil B).
그림 Fig. 2. Site-specific decoration of the cell surface by unnatural amino acid incorporation and bioorthogonal chemistry. a) Schematics of the gene construct of lpp-OmpA-peptide fusion protein (upper) and the reaction of surface-expressed AzF with DBCO-Dye (lower). Numbers indicate the size of each domain in amino acids. The site of AzF incorporation is denoted UAG. b) Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition of AzF and DBCO-Dye.
그림 Fig. 3. Images of UV-irradiated fluorescence analyses to confirm the site-specific reaction between AzF and DBCO-Dye. a) lpp-OmpA-AzF mixed with DBCO-Dye (left) and lpp-OmpA-AzF without DBCO-Dye (right). b) lpp-OmpA-WT mixed with DBCO-Dye (left) and E. coli WT mixed with DBCO-Dye (right).
그림 Fig. 4. Schematics of the gene constructs of lpp-OmpA-coil A fusion protein and coil B-GFP (upper) and self-assembly of coil B-GFP and surface- expressed coil A (lower). Numbers indicate the size of each domain in amino acids.
그림 Fig. 5. a) SDS-PAGE result of purified coil B-GFP. b) Results of UV-irradiated fluorescence analysis to confirm cell surface labeling by coilcoil interaction for lpp-OmpA-coil A (left) and E. coli WT (right). c) Flow cytometric analyses of surface labeling for lpp-OmpA-coil A (red) and E. coli WT (black).
표 Table 1. Parameters obtained from flow cytometric analyses

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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